CN107652260B - 高速逆流色谱快速分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法，本方法采用高速逆流色谱连续循环方法，以正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水形成的高速逆流色谱的两相溶剂体系从苦豆子根中分离制备二氢黄酮类化合物。本方法中同时采用高速逆流循环洗脱模式、在线存储技术以及逆向洗脱模式，将含有目标化合物的流份进行连续的循环洗脱，收集流份，得到纯度大于95％黄酮类化合物Sophoratonkin，Alopecurone F，Lehmannin，Alopecurone A，Sophora flavanone G和Alopecurone B。本发明方法一次性分离得到高纯度的五个二氢黄酮类化合物以及紫檀素苷，操作方法简便、快速，分离过程没有因材料吸附导致的目标成分损失。

Description

高速逆流色谱快速分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法，具体涉及采用高速逆流色谱(HSCCC)连续循环分离法制备二氢黄酮类化合物。

背景技术

现有技术公开了苦豆子(Sophora alopecuroides L.)为豆科槐属多年生草本植物，别名苦豆草，在我国西北地区为常用中药材，其根、茎、全草及种子皆可入药。苦豆子味苦性寒，具有祛风燥湿、清热解毒、止痛杀虫等作用。药理学研究表明，从苦豆子中分离所得多种类型化合物具有抗肿瘤、免疫调节、抗毒素、治疗乙型肝炎等药理作用，已有开发成为临床药物。化学成分研究表明，苦豆子含有多种化学成分,除生物碱类成分外，另有黄酮类、有机酸、氨基酸、挥发油、蛋白质和多糖类成分；所述类型各异的化学成分导致植物苦豆子的多种药理活性，黄酮类化合物包括二氢黄酮类是所述成分中的一类；由于多种不同的药理活性使得苦豆子成为用途广泛的药用植物，但是，苦豆子中类型不同的化合物所具有的不同类型的药理作用也使得它作为药材使用时产生药效不明确的问题，如，曾经作为临床用药的苦豆草片便由于上述原因于20世纪90年代后期停止生产。因此采用特定方法对苦豆子药材中成分进行分离对于这一药材的使用具有重要意义。

高速逆流色谱(HSCCC)是一种连续的液-液分配色谱分离技术，这种分离技术的固定相和流动相均为液体，因此样品在分离应用过程中不发生不可逆吸附，具有无损失的特点。若分离条件选择适当，可以高效、快速、以及较大量分离制备植物化学成分。已有文献报道利用常规HSCCC技术从花生壳中分离纯化得到黄酮类化合物，如香叶木素、木犀草素、5,7-二羟基色原酮等(牛丹丹等,天然产物研究与开发,2011,23:110-113)，但常规HSCCC方法耗时较长且分离的化合物结构较为单一，对于苦豆子，很难快速同时一次性分离得到较高纯度的、结构复杂而且相近的单体黄酮类化合物。

基于已有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种用高速逆流色谱的快速高效分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法，该方法中同时组合利用HSCCC连续循环洗脱模式、在线储存技术和逆向洗脱模式，能快速高效一次性从苦豆子植物提取物中分离纯化得到多个高纯度、结构复杂的二氢黄酮类化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高效分、无损耗分离制备高纯度二氢黄酮类化合物的方法，具体涉及一种高速逆流色谱快速分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法。该方法中同时组合利用HSCCC连续循环洗脱模式、在线储存技术以及逆向洗脱模式，快速高效地同时从植物提取物中分离纯化得到多个高纯度、复杂结构二氢黄酮化合物。

具体的，本发明的高速逆流色谱快速分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法，其包括步骤：

(1)设定高速逆流色谱仪参数；

(2)测算并设置分离制备条件；

(3)将含有二氢黄酮类化合物的苦豆子根的乙醇提提取物样品溶于两相体系中；通过进样阀将样品注入色谱柱内；

(4)同时组合利用循环分离模式、在线存储技术和逆向洗脱模式进行分离；

(5)收集高纯度的含有目标二氢黄酮化合物的流份；

(6)合并回收含有相同的二氢黄酮类化合物的流份，浓缩蒸干，得到苦豆子二氢黄酮类化合物。

本发明中，设置高速逆流色谱(HSCCC)仪，HSCCC仪器检测器后连接六通阀a，六通阀a连接储存环，恒流泵前连接六通阀b，负责正常洗脱和循环洗脱两种洗脱模式的切换(设置的高速逆流色谱仪结构图如图1所示)；

本发明中，设定分离条件，用于分离的两相溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照9:6:6～8:6～8的比例混匀后分层得到；将两相溶剂体系中的上相作为固定相，下相作为流动相；泵入固定相到高速逆流色谱柱内，然后开启主机，设定转速，启动旋转，泵入流动相到色谱柱内，使溶剂体系在色谱柱内达到动态平衡；

本发明中，将苦豆子根的乙醇提取物溶液通过进样阀将样品注入色谱柱内；根据逆流色谱监测图(如图2所示)，首先将A流分通过切换六通阀门引流于贮存环中；然后收集流分B得到化合物3的流分；再对A流分进行三次循环分离得到并收集化合物1,2,4和6的流分；最后通过控制转换开关，将流动相换成上相，控制仪器进入逆向洗脱模式(尾到头)，收集流份C得到化合物5的流分；合并回收含有较高纯度结构相同的二氢黄酮类化合物的流份，浓缩蒸干，分离得到苦豆子二氢黄酮类化合物。

本发明制备分离得到苦豆子二氢黄酮类化合物的化学结构通式如式I、II、III、IV所示：

。

本发明中，仪器参数和分离条件设置为，两个六通阀a和b的3#孔和4#孔位置分别用接头封堵，六通阀a所连接的储存环由内径为1.6mm，长度为25-55米的PTFE管路组成；本发明的实施例中优选储存环的管路长度为30米；

本发明中，两相溶剂由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比为9:6:6～8:6～8的比例混合均匀，静置分层得到；

本发明中，固定相泵入的流速为10-50mL/min，流动相泵入的流速为5-20mL/min；本发明实施例中优选固定相泵入的流速为30mL/min，流动相泵入的流速为15mL/min；

本发明中，HSCCC的主机转速为800-1200rpm，本发明实施例中优选HSCCC的主机转速为1200rpm；温度为25℃。

本发明中，紫外检测器作为高速逆流色谱的检测器，检测波长为254-360nm；，本发明实施例中优选波长为254nm。二氢黄酮类化合物的样品溶于两相体系中的浓度为5-20mg/mL。

本发明中，自动接收仪接收流份；分离结束后，使用高效液相色谱对所得流份进行检测；将纯度较高的保留时间相同的流份合并；然后使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到二氢黄酮类化合物固体；使用高效液相色谱分析所得到的单体化合物纯度均高于95％。

本发明利用高速逆流色谱连续循环洗脱模式，结合在线存储技术，从苦豆子根醇提物中一次性分离纯化同时得到六个较高纯度二氢黄酮类化合物，该方法操作简便，快速高效，所得化合物纯度较高。

附图说明

图1.高速逆流色谱仪设置结构图。

图2.实施例1的高速逆流色谱图。

图3.实施例1的醇提样品和分离得到的二氢黄酮类化合物高效液相色谱，其中

1.Sophoratonkin；2.Alopecurone F；3.Lehmannin；4.Alopecurone A；5.Sophoraflavanone G；6.Alopecurone B。

具体实施方式

本发明实施例中所用苦豆子(Sophora alopecuroides L.)根，采集于新疆石河子。

下面实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面实施例中所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1

(1)采用江苏江阴逆流科技有限公司生产的OptiChrome-300PLUS高速逆流色谱仪加以改进实现样品分离纯化，使用美国安捷伦有限公司生产的Agilent 1200HPLC高效液相色谱仪进行样品纯度分析；

设置高速逆流色谱仪，仪器检测器后连接六通阀a，六通阀a连接储存环，恒流泵前连接六通阀b，负责正常洗脱和循环洗脱两种洗脱模式的切换(如图1所示)；

(2)制备提取物样品

取苦豆子根干燥根粉碎，用95％乙醇冷浸提取三次，合并提取液并减压浓缩、蒸干；

(3)制备两相溶剂体系：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按9:6:6～8:6～8(v:v)比例充分混匀后，静置待分层，分别取上下相并超声脱气20min以除气泡；

(4)制备样品溶液：将上述苦豆子根提取物200mg样品溶于各5mL的上下相溶剂体系中；

(5)高速逆流色谱分离：将固定相以30mL/min的流速泵入到色谱柱内，待固定相充盈整个色谱柱后启动主机，设定转速为1200rpm，待达到设定转速后，将流动相以15mL/min的流速泵入色谱柱内；待两相体系在色谱柱中达到动态平衡后，通过进样六通阀将10mL样品溶液注入色谱柱内；通过控制六通阀a将流份A储存于储存环中；在收集流份B后，通过控制六通阀a和b使仪器进入循环分离模式，流分A经过3个循环分离后收集流份；待流份A洗脱完全以后，通过控制转换开关，将流动相换成上相，控制仪器进入逆向洗脱模式(尾到头)，收集流份C；分离过程中使用紫外检测器对流份进行检测，波长为254nm，采用色谱工作站对数据进行采集处理，同时采用流份自动接收仪收集流份，每管10mL；实验所得高速逆流色谱图如图2所示，显示出五个二氢黄酮和一个紫檀素苷单体(化合物1-6)得到较好的分离；

(6)样品合并和纯度分析：采用高效液相色谱仪对所收集的流份进行纯度检测；色谱分离条件为：色谱柱Eclipse XDB-C18column(5μm,250mm×4.6mm,i.d.)，柱温25℃，流动相为乙腈：水＝55:45，流速为1mL/min，检测波长为254nm；合并纯度较高的相同保留时间的流份，使用旋转蒸发仪除去合并流份中的溶剂，获得如式(I、II、III、IV所示的二氢黄酮类化合物单体集流份，高效液相色谱分析测得最终分离得到的二氢黄酮类化合物Sophoratonkin，Alopecurone F，Lehmannin，AlopecuroneA，Sophora flavanone G和Alopecurone B；。的纯度均大于95％(如图3所示)。

Claims (4)

1.一种高速逆流色谱快速分离制备天然二氢黄酮类化合物的方法，其特征在于，同时组合利用高速逆流色谱连续循环分离模式、在线存储技术和逆向洗脱模式，一次性分离制备多个天然二氢黄酮类化合物，其包括步骤，

(1)设定高速逆流色谱仪参数；其中，仪器检测器之后连接六通阀(a)，六通阀(a)连接储存环，恒流泵前连接六通阀(b)，负责正常洗脱和循环洗脱两种洗脱模式之间的切换；

(2)测算并设置分离制备条件；其中，两相溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水9:6:6:8v:v混匀后静置分层得到两相溶剂体系；其中，将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；先将固定相泵入高速逆流色谱柱内，然后开启主机，设定转速，启动旋转，并向色谱柱内泵入流动相；

(3)将含有二氢黄酮类化合物的苦豆子根的乙醇提提取物样品溶于两相体系中；通过进样阀将样品注入色谱柱内；

(4)同时组合利用循环分离模式、在线存储技术和逆向洗脱模式进行分离；

(5)收集高纯度的含有目标二氢黄酮化合物的流份；

(6)合并回收含有相同的二氢黄酮类化合物的流份，浓缩蒸干，得到苦豆子二氢黄酮类化合物；

所制得的天然二氢黄酮类化合物其结构中具有一个或两个异戊烯结构片段，如式I、II、III、IV所示，

其中，R₁＝OH，Sophora flavanone G(5)；R₁＝H，Lehmannin(3)；

Alopecurone F(2)；

Alopecurone A(4)；

Alopecurone B(6)；

Sophoratonkin(1)。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的设定高速逆流色谱仪中，六通阀(a)和(b)的3#孔和4#孔均用接头封堵；六通阀(a)所连接的储存环由内径为1.6mm，长度为25-55米的PTFE管路组成。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的泵入固定相的流速为30mL/min；泵入流动相的流速为15mL/min。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的的主机转速为800-1200rpm，仪器运行温度为25℃。

Images