CN106188180A - 一种黑果枸杞中花色苷类化合物异构体的分离纯化方法 - Google Patents
一种黑果枸杞中花色苷类化合物异构体的分离纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种黑果枸杞中花色苷类化合物异构体的分离纯化方法，具体为采用混合模式色谱从黑果枸杞提取物中高效分离纯化花色苷类化合物异构体，混合模式色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱，采用混合模式色谱在低pH条件下实现花色苷异构体的高效分离，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。选取黑果枸杞乙醇提取物反相色谱制备分离所得2个馏分，通过混合模式色谱制备两对顺反式花色苷异构体，其中包括1个新花色苷、3个从黑果枸杞中首次分离的花色苷单体化合物。该方法对花色苷顺反式异构体表现出优异的分离效果，可以实现花色苷异构体的高效分离纯化，为花色苷类化合物的活性研究提供物质基础。
Description
技术领域
本发明涉及花色苷类化合物的分离纯化，具体地说是一种利用混合模式色谱在低pH条件下高效分离花色苷异构体的方法。该方法对顺反式花色苷异构体表现出较优的分离效果。
背景技术
花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。花色苷是类黄酮–以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。据文献报道该类化合物具有很好的生物活性，如预防癌症和心脏病、抗炎和抗氧化等作用(Hou,D.X.(2003).Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins.Current Molecular Medicine,3(2),149-159；Olsson,M.E.,Gustavsson,K.E.,Andersson,S.,Nilsson,A.,&Duan,R.D.(2004).Inhibition of cancer cell proliferation in vitro by fruit and berry extracts and correlations with antioxidant levels.Journal of Agricultural and Food Chemistry,52(24),7264-7271)。
酚酸酰化的花色苷是花色苷在自然界中存在的一种重要形式。这类花色苷容易形成顺反式异构体给单体化合物的分离纯化带来了很大困难。目前，反相色谱是花色苷分离中应用最广泛的色谱技术。但对于顺反式异构化的花色苷，反相色谱的分离能力常常不足，主要由于分离选择性有限。而混合模式色谱在疏水作用的基础上，引入电荷排斥作用，其有望改善分离选择性，解决花色苷顺反式异构体分离的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种提取黑果枸杞中花色苷的基础上对花色苷组分进行继续分离，得到花色苷类化合物的异构体。
具体的技术方案为：
本发明提供一种黑果枸杞中花色苷类化合物异构体的分离纯化方法，具体为采用混合模式色谱从黑果枸杞提取物中高效分离纯化花色苷类化合物异构体，混合模式色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX)，流动相由A和B组成，A选自甲酸水溶液、三氟乙酸水溶液，B选自甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇或正丁醇，其中，所述甲酸水溶液和三氟乙酸水溶液的体积浓度均为0.1％-10％。
色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-50mm；样品浓度为1mg/mL-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为0.5-480mL/min；柱温为4-60℃。
操作步骤为：
1)黑果枸杞提取物先经制备型反相高效液相色谱(RPLC)分离，色谱柱 为碳十八柱，洗脱方式为线性梯度、台阶梯度洗脱，洗脱完后取出含有花色苷异构体的馏分；
2)将含有花色苷异构体的多组馏分分别经混合模式色谱进行分离，色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX)，选择权利要求1所述的流动相对馏分进行洗脱，采用等度洗脱方式制备得到花色苷异构体。
所述的黑果枸杞提取物的制备方法为：称取一定量的黑果枸杞果实，用5～30倍量的50％～95％乙醇溶液浸泡提取1-5次，每次浸泡时间为1-3小时，其中，乙醇溶液中加入盐酸、甲酸、三氟乙酸中的一种或两种以上调节乙醇溶液pH值至1-3，合并提取液抽滤，用旋转蒸发仪50℃条件下减压回收乙醇，得到浓缩液，将浓缩液上AB-8或XAD-7大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的蒸馏水或10％-30％乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱体积50％-95％的乙醇洗脱花色苷，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥即得黑果枸杞红色素，即黑果枸杞提取物，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。
步骤1)中黑果枸杞提取物经制备型反相高效液相色谱(RPLC)分离，梯度洗脱参数为：梯度时间范围为40min-100min,流动相为权利要求1所述的流动相，流动相中B的体积百分数的变化为5％～15％→80％～100％，流速为50-100mL/min，检测波长为500-600nm；采用体积浓度为0.5％-1％(v/v)的甲酸水溶液溶解提取物得到浓度为100-400mg/mL的样品，进样量为1-5mL，根据色谱峰收集馏分，将每组馏分浓缩至干后备用，取出其中富含花色苷异构体的馏分。
步骤2)中将含有花色苷异构体的多组馏分均采用混合模式色谱进行分离，该分离使得每组馏分中的多个异构体组分分开，馏分的等度洗脱参数为：进样量为1-100μL，流动相为权利要求1所述的流动相，最佳流动相为三氟乙酸水溶液和乙腈；流动相中B的体积百分数范围为10％-30％，流速为0.5-10mL/min，检测波长为500-600nm，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得花色苷异构体。
所述的花色苷异构体为2对顺反式花色苷异构体，其中包括1个新花色苷、3个从黑果枸杞中首次分离的花色苷，共4个花色苷单体化合物，化合物1为矮牵牛素-3-葡糖基反式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷，化合物2为矮牵牛素-3-葡糖基顺式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷，化合物3为矮牵牛素-3-顺式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷，化合物4为矮牵牛素-3-反式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷。
所述化合物的结构式如下：
本发明的有益效果
该方法可以实现顺反式花色苷异构体的高效制备，为花色苷类化合物的活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。
具体实施方式
下述实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
1)黑果枸杞提取物先经制备型反相高效液相色谱(RPLC)分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱(XTerra MS C18柱)；以三氟乙酸水溶液A和甲醇B为流动相体系，其中，三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.2％；洗脱梯度为0-40min，体积浓度15％→80％B；流速为80mL/min；检测波长为520nm；样品溶液浓度为300mg/mL，其采用体积浓度0.5％(v/v)甲酸水溶液溶解；进样体积为5mL；根据色谱峰收集馏分，共收集14个馏分，每个馏分浓缩至干后备用。
2)针对富含花色苷异构体的2个馏分，标记为馏分6和馏分9，采用混合模式色谱进行制备，色谱柱为XCharge C8SAX柱；采用乙腈-三氟乙酸水溶液，三氟乙酸水溶液体积浓度为0.2％作为流动相；采用等度洗脱方式制备花色苷异构体。
化合物1、2的制备
选取馏分6，采用混合模式色谱进行HPLC分离，色谱条件：色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX,150×4.6mm,i.d.,5μm)；体积浓度为0.1％-10％的三氟乙酸水溶液A和乙腈B作为流动相体系；体积浓度12％B等度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为520nm；进样量为100μL；收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2两个化合物；经理化测定，数据如下：1，红色粉末，[M+H]+：m/z 1095.3169。1H NMR(CD3OD)：见表1。2，红色粉末，[M+H]+：m/z 1095.3169。1H NMR(CD3OD)：见表1。
化合物3、4的制备
选取馏分9，采用混合模式色谱进行HPLC分离，色谱条件：色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX,150×4.6mm,i.d.,5μm)；体积浓度为0.1％-10％的三氟乙酸水溶液A和乙腈B作为流动相体系；体积浓度15％B等度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为520nm；进样量为100μL；收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得3,4两个化合物；经理化测定，数据如下：3，红色粉末，[M+H]+：m/z 933.2647。1H NMR(CD3OD)：见表1。4，红色粉末，[M+H]+：m/z 933.2647。1H NMR(CD3OD)：见表1。
表1 化合物1-4的1H NMR数据(600MHz，氘代甲醇)
Claims (8)
1.一种黑果枸杞中花色苷类化合物异构体的分离纯化方法，其特征在于：采用混合模式色谱从黑果枸杞提取物中高效分离纯化花色苷类化合物异构体，混合模式色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX)，流动相由A和B组成，A选自甲酸水溶液、三氟乙酸水溶液，B选自甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇或正丁醇，其中，所述甲酸水溶液和三氟乙酸水溶液的体积浓度均为0.1％-10％。
2.按照权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-50mm；样品浓度为1mg/mL-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为0.5-480mL/min；柱温为4-60℃。
3.按照权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：
操作步骤为：
1)黑果枸杞提取物先经制备型反相高效液相色谱(RPLC)分离，色谱柱为碳十八柱，洗脱方式为线性梯度、台阶梯度洗脱，洗脱完后取出含有花色苷异构体的馏分；
2)将含有花色苷异构体的多组馏分分别经混合模式色谱进行分离，色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX)，选择权利要求1所述的流动相对馏分进行洗脱，采用等度洗脱方式制备得到花色苷异构体。
4.按照权利要求1或3所述的分离纯化方法，其特征在于：所述的黑果枸杞提取物的制备方法为：称取一定量的黑果枸杞果实，用5～30倍量的50％～95％乙醇溶液浸泡提取1-5次，每次浸泡时间为1-3小时，其中，乙醇溶液中加入盐酸、甲酸、三氟乙酸中的一种或两种以上调节乙醇溶液pH值至1-3，合并提取液抽滤，用旋转蒸发仪50℃条件下减压回收乙醇，得到浓缩液，将浓缩液上AB-8或XAD-7大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的蒸馏水或10％-30％乙醇溶液淋洗，然后用3-5倍柱体积50％-95％的乙醇洗脱花色苷，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥即得黑果枸杞提取物，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。
5.按照权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤1)中黑果枸杞提取物经制备型反相高效液相色谱(RPLC)分离，梯度洗脱参数为：梯度时间范围为40min-100min,流动相为权利要求1所述的流动相，流动相中B的体积百分数的变化为5％～15％→80％～100％，流速为50-100mL/min，检测波长为500-600nm；采用体积浓度为0.5％-1％(v/v)的甲酸水溶液溶解提取物得到浓度为100-400mg/mL的样品，进样量为1-5mL，根据色谱峰收集馏分，将每组馏分浓缩至干后备用，取出其中富含花色苷异构体的馏分。
6.按照权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤2)中将含有花色苷异构体的多组馏分均采用混合模式色谱进行分离，该分离使得每组馏分中的多个异构体组分分开，馏分的等度洗脱参数为：进样量为1-100μL，流动相为权利要求1所述的流动相，最佳流动相为三氟乙酸水溶液和乙腈；流动相中B的体积百分数范围为10％-30％，流速为0.5-10mL/min，检测波长为500-600nm，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得花色苷异构体。
7.按照权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：
1)黑果枸杞提取物先经制备型反相高效液相色谱(RPLC)分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱(XTerra MS C18柱)；以三氟乙酸水溶液A和甲醇B为流动相体系，其中，三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.2％；洗脱梯度为0-40min,体积浓度15％→80％B；流速为80mL/min；检测波长为520nm；样品溶液浓度为300mg/mL，采用体积浓度0.5％(v/v)甲酸水溶液溶解；进样体积为5mL；根据色谱峰收集馏分，共收集14个馏分，每个馏分浓缩至干后备用；
2)针对富含花色苷异构体的2个馏分，标记为馏分6和馏分9，采用混合模式色谱进行制备，色谱柱为XCharge C8SAX柱；采用乙腈-体积浓度为0.2％的三氟乙酸水溶液作为流动相；采用等度洗脱方式制备花色苷异构体；
化合物1、2的制备
选取馏分6，采用混合模式色谱进行HPLC分离，色谱条件：色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX,150×4.6mm,i.d.,5μm)；体积浓度为0.1％-10％的三氟乙酸水溶液A和乙腈B作为流动相体系；体积浓度12％B等度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为520nm；进样量为100μL；收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2两个化合物；
化合物3、4的制备
选取馏分9，采用混合模式色谱进行HPLC分离，色谱条件：色谱柱为反相/强阴离子交换混合模式色谱柱(XCharge C8SAX,150×4.6mm,i.d.,5μm)；体积浓度为0.1％-10％的三氟乙酸水溶液A和乙腈B作为流动相体系；体积浓度15％B等度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为520nm；进样量为100μL；收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得3,4两个化合物。
8.按照权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述的花色苷异构体为2对顺反式花色苷异构体，其中包括1个新花色苷、3个从黑果枸杞中首次分离的花色苷，共4个花色苷单体化合物，化合物1为矮牵牛素-3-葡糖基反式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷，化合物2为矮牵牛素-3-葡糖基顺式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷，化合物3为矮牵牛素-3-顺式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷，化合物4为矮牵牛素-3-反式香豆酰芸香糖苷-5-葡萄糖苷。
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