JP2022543794A - テトラガロイルグルコースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
毛葉茶を粉砕して篩にかけ、蒸留水を加えて超音波抽出及びろ過を1~3回行い、濾液を収集し、pH値を3.0±0.1に調整し、3~4BV/hの流速でクロマトグラフィーカラムで吸着し、吸着後30min~60min静置し(目標成分はカラムに吸着し、水洗されないようにする)、まず3~4BVの水を用いて4~6BV/hの流速で洗浄し、その後4~6BVの質量濃度30±70%のエタノール水溶液を用いて2~4BV/hの流速で溶離液が無色となるまで溶離し、エタノール溶離液を収集し、濃縮後凍結乾燥し、毛葉茶抽出物を得る、毛葉茶抽出液の製造のステップAと、
体積比(4±0.1):(1±0.1):(1±0.1):(1.5±0.1):(1±0.1):(1±0.1)の使用量で0.2%トリフルオロ酢酸水溶液、n-ブタノール、酢酸エチル、メチル-t-ブチルエーテル、アセトニトリル及びn-ヘキサンを2相溶媒系として、十分に混合した後、一晩静置し、2相分離後に超音波脱気を行い、上相を固定相、下相を移動相とし、流速1.6~2.0mL/min、検出波長280nmの条件下で、上記で製造した毛葉茶抽出物を高速向流クロマトグラフィー(HSCCC)により分離し、ピーク形状に基づいて119~130minの流出液を収集し、収集した流出液を濃縮した後乾燥して化合物としてテトラガロイルグルコースを得る高速向流クロマトグラフィーによる分離のステップBとを含む。
1つの実施例では、流速は1.95~2.0mL/minであり、及び/又はサンプリング量は300±50mgの毛葉茶抽出物である。
本発明の前記テトラガロイルグルコースの製造方法は、毛葉茶を原料として抽出し、毛葉茶抽出物をマクロポーラス吸着樹脂により精製した後、最適化された高速向流クロマトグラフィーにより分離してテトラガロイルグルコースを得る。本発明の前記製造方法は、方法が簡便で再現性が良く、テトラガロイルグルコースの純度、収率が高いという利点を有し、化合物の量産に有用であり、更なる活性研究のための物質的基礎を築く。
本発明の理解を容易にするために、以下、本発明についてより包括的に説明する。本発明は、本明細書に記載された実施例に限定されるものではなく、多くの異なる形態で実施されてもよい。むしろ、これらの実施例は、本発明の開示内容の理解をより完全なものにすることを目的として提供される。
1、高速向流(HSCCC)サンプリング原料(毛葉茶抽出物)の製造
粉砕して10メッシュの篩にかけた毛葉茶粉末200gを、毛葉茶粉末の10倍の重量の蒸留水を用いて50~60℃で1回目は60min、2回目は3min2回抽出し、抽出液を収集して合わせ、塩酸でpHを3に調整し、AB-8マクロポーラス吸着樹脂800mlを充填したカラムを用いて4BV/hの流速で吸着し、吸着後3min静置し、まず1800mlの水を用いて6BV/hの流速で洗浄し、その後、50%質量濃度のエタノール水溶液を用いて1800mlを4BV/hの流速で溶離し、溶離液を収集し、濃縮した後、凍結乾燥して毛葉茶抽出物を得て、高速向流のサンプリング原料とした。
2、HPLC検出方法
高速液体クロマトグラフィー条件:カラム:Agilent ZORBAX SB-C18(5μm、4.6×250mm)、移動相Aは0.2%リン酸水溶液、Bはアセトニトリルである。溶離勾配:0→25min:B 5%→72%;25→30min:B 28%→32%、流速1.0mL/min、DAD検出器、サンプリング量20μL、カラム温度28℃。
上記で製造された毛葉茶抽出物を少量収集し、水に溶解し、膜を介してサンプリングした。HPLCスペクトルを図1に示す。図1から、毛葉茶抽出物には複数の化学成分が含まれ、保持時間が23.4minの化合物が目標成分であることが分かった。
3、高速向流クロマトグラフィー(HSCCC)による分離
3.1溶剤系の選択
複数の系をスクリーニングし、その系中の異なる溶媒を次の表1に示す割合で調合し、振とうさせた後に静置して層分離した。3mLの下相溶媒を収集し、上記で製造した少量の毛葉茶抽出物のサンプルに添加し、HPLCを用いて下相溶媒中の各目標ピークの面積(S抽出前)を測定した。さらに等体積の上相を抽出し、抽出後の下相中の目標ピーク面積(S抽出後)を測定し、次式(1)により各成分の分配係数Kを算出した。HSCCCの固定相と移動相としてK値に応じて適切な溶媒系を選択した。
式(1)K=(S)抽出前-S抽出後)/S抽出前
系1は中等溶媒系であり、目標成分の水溶性が高いため、この系では分配係数(K)の値が小さすぎる。
系2は系1を基礎に酸を加え、系の配合比を変えたものであり、目標成分のK値が適切であることを見出したが、装置にかけて操作した結果、目標成分の純度は低く、低含有量の親水性不純物の多くは目標成分とともに流出し、分離効果は全く得られなかった。
系3は親水性の強い成分の分離によく使用される系であるが、目標成分に対するK値は大きすぎる。そこで、実験では、系1、2の組成を組み合わせ、溶媒の配合比を調整したところ、系4、5のK値は良く、すなわち0.2%トリフルオロ酢酸水溶液、n-ブタノール、酢酸エチル、メチル-t-ブチルエーテル、アセトニトリル、n-ヘキサンを溶媒系とすると、サンプリング操作は満足のいく分離効果が得られ、好ましい系は系4、すなわち体積百分率0.2%のトリフルオロ酢酸水溶液:n-ブタノール:酢酸エチル:メチル-t-ブチルエーテル:アセトニトリル:n-ヘキサン=4:1:1:1.5:1:1(V/V)であった。
3.2 HSCCCの操作条件
高速向流クロマトグラフィーカラム:TBE-300A高速向流クロマトグラフ(上海同田生物技術有限公司):ポリテトラフルオロエチレンカラム、内径1.6mm、カラム容積280mL、回転速度0~1000r/min;TBP-50Aポンプ;TBD-2000 UV検出器;LX-300サーモスタットを配置した。
上記系4に従って溶媒系を調製し、十分に混合し、一晩静置し、2相分離後3min超音波脱気を行った。2相分離後に超音波脱気を行い、上相を固定相、下相を移動相とし、下相流速2.0mL/min、本体の回転速度850rpm、カラム温度20℃、波長280nmの条件下で固定相の保持率は62%であり(保持率が高いほど、機器チューブ中の上相の体積が大きくなり、抽出分離に有利である)、サンプリング量は300mgであり、HSCCC分離マップは図2に示され、119~130minの流出液を収集し、55℃で回転蒸発濃縮した後、凍結乾燥して3.17mgの目標化合物を得た。
図3を参照して、254nmでのHPLC(分析条件は上記と同じ)のクロマトグラムに基づいてピーク面積正規化法を用いて算出したところ、目標化合物の純度は92.3%であった。
質量分析及び核磁気共鳴を用いて、実施例1に記載の化合物の構造を同定、分離した。
化合物:褐色粉末、ESI-MSm/z:787.1012[M-H]‐、組成式はC34H28O22である。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 6. 99(2H, s, H-2’’’’, 6’’’’), 6. 97(2H, s, H-2’’’, 6’’’), 6. 95( 2H, s, H-2’, 6’), 6. 92( 2H, s, H-2’’, 6’’) , 6.10 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-1) ,5.89(H, m, H-3), 5.20 ( 1H ,dd, J = 8.5 Hz, 7.5 Hz, H-2) , 4.27( 2H , m , H-6 ) , 4.16( H, m , H-5 ) , 3.88(1H, s, H-4);
1 3 C-NMR (125 MHz , DMSO-d6):δ 62. 3 ( C-6 ) ,66. 22 ( C-4 ) , 70.58 C-2 ) , 71.65( C-5 ) , 72.87 ( C-3 ) , 92.43 (C-1 ) , 119.38 (C-1 ’) , 109. 48 ( C-2’ , 6’ ) ,146.10( C-3’ , 5’ ) , 139. 94 (C-4’) , 164. 97 ( C-7’ ) , 165. 33 ( C-7’’) , 166.00 (C-7’’’) ,109.36(C-2’’, 6’’), 109.23(C-2’’’, 6’’’) ,109.23( C-2’’’’, 6’’’’), 118. 03 ( C-1’’), 119.31 ( C-1’’’) , 119.49 (C- 1’’’’), 139. 24( C-4’’ ), 139.14( C-4’’’’ ), 143. 02 ( C-3’’, 5’’ ), 145.98( C- 3’’’ , 5’’’ ) , 145.95 (C-3’’’’ , 5’’’’)
1Hと13C NMRデータと現在開示されている資料(例:肖世基、郭大楽、何達海ら.キウイフルーツ藤山柳化学成分研究[J].漢方薬,2016,(03):383-387.舒希凱、シャクヤクカの抗酸化活性成分の分離と同定[M],山東師範大学)に基づいて、化合物は1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-グルコースであることが決定され、その化学構造式は以下のとおりである。
上記系2に従って溶媒系を調製し、十分に混合し、一晩静置し、2相分離後30min超音波脱気を行った。下相流速2.0mL/min、本体の回転速度850rpm、カラム温度20℃、波長280nmの条件下で固定相の保持率は51%、サンプリング量は300mgであった。HSCCC分離マップを図4に示す。195~210minの流出液を収集し、HPLC検出結果を図5に示す。その結果、この部分の流出液には原料中の低含有量の2つの成分も濃縮され、目標成分と全く分離できないことを示した。
上記の系5に従って溶媒系を調製し、十分に混合し、一晩静置し、2相分離後3min超音波脱気を行った。2相分離後に超音波脱気を行い、上相を固定相、下相を移動相とし、下相流速2.0mL/min、本体の回転速度850rpm、カラム温度20℃、波長280nmの条件下で固定相の保持率は53%、サンプリング量は300mgであった。HSCCC分離マップを図6に示す。141~147minの流出液を収集し、55℃で回転蒸発濃縮した後、凍結乾燥して約1.8mgの目標化合物を得た。HPLC(分析条件は上記と同じ)の254nmでのクロマトグラムを図7に示し、ピーク面積正規化法を用いて化合物純度を算出したところ、化合物純度は90.6%であった。その結果、この方法の固定相の保持率、目標化合物の収率、及び純度はすべて系4の配合比の場合より低いことがわかった。
Claims (12)
- テトラガロイルグルコースの製造方法であって、
毛葉茶を粉砕して篩にかけ、蒸留水を加えて超音波抽出とろ過を1~3回行い、濾液を収集し、pH値を3.0±0.1に調整し、3~4BV/hの流速でクロマトグラフィーカラムで吸着し、吸着後30min~60min静置し、まず3~4BVの水を用いて4~6BV/hの流速で洗浄し、その後4~6BVの質量濃度50±5%のエタノール水溶液を用いて2~4BV/hの流速で溶離液が無色となるまで溶離し、エタノール溶離液を収集し、濃縮後凍結乾燥し、毛葉茶抽出物を得る、毛葉茶抽出液の製造のステップAと、
体積比(4±0.1):(1±0.1):(1±0.1):(1.5±0.1):(1±0.1):(1±0.1)の使用量で0.2%トリフルオロ酢酸水溶液、n-ブタノール、酢酸エチル、メチル-t-ブチルエーテル、アセトニトリル及びn-ヘキサンを2相溶媒系として、十分に混合した後、一晩静置し、
2相分離後に超音波脱気を行い、上相を固定相、下相を移動相とし、流速1.6~2.0mL/min、検出波長280nmの条件下で、上記で製造した毛葉茶抽出物を高速向流クロマトグラフィーにより分離し、ピーク形状に基づいて119~130minの流出液を収集し、収集した流出液を濃縮した後乾燥して、テトラガロイルグルコースとして1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-グルコースを得る、高速向流クロマトグラフィーによる分離のステップBとを含む、テトラガロイルグルコースの製造方法。 - 前記蒸留水の使用量が毛葉茶の9~11倍であることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記蒸留水の使用量が、毛葉茶の10倍であることを特徴とする請求項2に記載の製造方法。
- 前記抽出温度は50℃~60℃であり、及び/又は抽出は2回行い、1回当たり25min~60minであることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 抽出は2回行い、1回当たり30min~40minであることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 塩酸でpHを3に調整することを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- AB-8マクロポーラス吸着樹脂を充填したカラムにより3~4BV/hの流速で吸着し、及び/又は高速向流クロマトグラフィーにより分離する場合、本体の回転速度は850±50rpm、分離温度は25±5℃であることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記エタノール水溶液の濃度が50%であることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 粉砕後、10メッシュ~30メッシュの篩にかけることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記毛葉茶は南昆山毛葉茶であることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記0.2%トリフルオロ酢酸水溶液、n-ブタノール、酢酸エチル、メチル-t-ブチルエーテル、アセトニトリル、n-ヘキサンの体積比は4:1:1:1.5:1:1であることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
- サンプリング量が300±50mgの毛葉茶抽出物であることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
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