CN109369751B - 二氢山奈酚糖苷类化合物及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种二氢山奈酚糖苷类化合物及其提取方法。所述方法为:将滇山茶饼用乙醇水溶液进行超声浸提得提取液，减压蒸馏得到浓缩液；加入大孔树脂层析柱梯度洗脱，收集含有目标提取物的洗脱液得粗流份段；将粗流份段加入RP‑C18填料层析柱，用乙腈‑甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得准流份段；减压浓缩、干燥得到粗分离物；使用C18色谱柱、用甲醇‑甲酸水溶液体系作为流动相，将粗分离物用溶剂溶解后进样，进行梯度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物。本申请提供的方法，首次从自然界中分离出目标化合物，提取纯度高。

Description

二氢山奈酚糖苷类化合物及其提取方法

技术领域

本发明涉及化合物提取领域，具体而言，涉及一种二氢山奈酚糖苷类化合物及其提取方法。

背景技术

滇山茶(Camellia reticulata Lindl.)又名滇茶或腾冲红花油茶，山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L.)多年生常绿乔木，是中国特有物种、国家二级重点保护植物。我国作为油茶的原产地，已有2300多年的栽培历史，云南省是我国的油茶大省，具有丰富的油茶资源。

油茶多用来榨油，一般来说，油茶籽中油酸、亚油酸等脂肪酸的含量是评定油茶品质的重要指标。滇山茶与普通的油茶相比，含油量高、油体透亮，不饱和脂肪酸含量高达83.5％。滇山茶含有丰富的生物活性物质，如黄酮、有机酸、皂苷、三萜类化合物等，这些化合物有一定的营养保健功效，能降低胆固醇、预防肿瘤、增强机体免疫力，具有很好的生物利用价值。

山奈酚及其衍生物是油茶中一类重要的化合物，具有抗癌、治疗糖尿病和骨质疏松以及保护损伤细胞等功能。

现有技术对于滇山茶中所含有的活性物质分析不全面，很多有效成分有待分离提取。将滇山茶中的有效活性物质从复杂多样的成分中分离提取出来，得到纯度较高的产品，对于滇山茶的深度应用具有重要的作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

发明的第一目的在于提供一种二氢山奈酚糖苷类化合物，该化合物首次从滇山茶中提取纯化得到，现有技术中没有任何相关记载，具有开拓性的意义，提高了滇山茶的利用价值。

本发明的第二目的在于提供一种二氢山奈酚糖苷类化合物的提取方法，所述方法首次从滇山茶中提取出目标化合物，而且快速有效、纯度很高。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种二氢山奈酚糖苷类化合物，所述二氢山奈酚类化合物的结构式为：

一种所述的二氢山奈酚糖苷类化合物的提取方法，所述方法包括以下步骤:

A.将滇山茶饼用乙醇水溶液进行超声浸提，得到提取液；将所述提取液减压蒸馏至无醇得到浓缩液；

B.将所述浓缩液加入大孔树脂层析柱，依次用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得粗流份段；

C.将所述粗流份段加入RP-C18填料层析柱，用乙腈-甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得准流份段；减压浓缩、干燥得到粗分离物；

D.使用C18色谱柱、用甲醇-甲酸水溶液体系作为流动相，将所述粗分离物用溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物。

通过浸提-浓缩-大孔树脂柱层析-RP-C18柱层析-C18色谱柱高效液相色谱制备的方法，可以有效的将目标化合物从滇山茶众多的成分中分离提取出来，提取得率大于30.6mg/kg，纯度高于95.3％。

优选地，所述大孔树脂层析柱中的大孔树脂的型号为D101，粒径60-16目、比表面积≥550m²/g、比照吸附量(酚/干基)≥20mg/g。

更加优选地，所述大孔树脂使用前需用乙醇洗脱至颜色清亮，再用纯水洗脱至无醇味。

大孔树脂型号和参数的选择，是基于滇山茶中不同成分的极性以及彼此之间的差异、通过设计试验来确定的。对大孔树脂进行预处理，有利于保证大孔树脂对分离成分的有效吸附，保证柱层析按照理论分析的目标顺利进行，提高分离效率。

优选地，所述步骤B中，所述大孔树脂层析柱的柱体积为2L；每500mL收集一次洗脱液并顺次标号，所述粗流份段由第A26-28号洗脱液合并得到。

限定柱体积和收集洗脱液的时机，是为了在有效分离的基础上最大程度的收集目标化合物，从而提高分离效率、最终的提取得率和纯度。

优选地，所述RP-C18填料层析柱的制备方法为：取RP-C18填料加入乙醇溶液进行超声，去除多余气泡后装入层析柱中。

更加优选地，所述步骤C中，所述乙腈-甲酸水溶液体系为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液；洗脱梯度配比为：流动相A与流动相B的体积比依次为17：83、30：70、40：60、100：0，每个洗脱梯度洗脱至无色为止。

进一步优选地，所述步骤C中，所述RP-C18填料层析柱的柱体积为1.2L；每200mL收集一次洗脱液并顺次标号，所述准流份段由第B22-25号洗脱液合并得到。

层析柱类型、流动相及其比例、洗脱梯度、收集选取时机是基于粗流份段中所包含的物质的极性、分离时间、分离度等参数来确定。合适的流动相及其比例、洗脱梯度，可以快速有效地将目标化合物初步分离出来。

优选地，所述步骤D中，所述C18色谱柱的规格为：Venusil MP C18，尺寸10mm×250mm，填料粒径为5微米；所述甲醇-甲酸水溶液体系为：流动相C为甲醇，流动相D为体积分数0.1％的甲酸水溶液；其洗脱配比为：所述流动相C与所述流动相D的体积比为50：50。

色谱柱的参数选择、流动相体系的选取、洗脱配比的选取，都是为了更好的获得目标化合物。这些参数彼此之间互相影响，最终决定整个方法对目标提取物的分离纯化结果。

可选地，所述滇山茶饼的制作方法为：将滇山茶果晾干、去壳，以冷榨法脱去油脂后晾干，粉碎即可；所述乙醇水溶液的体积分数为50-60％；所述浸提的方法为：料液比为1kg所述滇山茶饼对应3-4L所述乙醇水溶液，在30-40℃条件下超声浸提2-4次，过滤得到所述提取液。

去壳、脱去油脂，是为了最大程度的保证提取得率，减少分离过程中的干扰。合适的原料处理方法还有利于避免目标化合物的流失。恰当的浸提溶剂和浸提方法，可以保证提取得率。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)首次发现并从滇山茶中分离出了目标提取物；

(2)本申请提供的提取方法简单、有效，适合于推广应用。

(3)目标化合物提取纯度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1对B22-25洗脱液进行制备的HPLC谱图；

图2为实施例1制备得到的目标化合物的纯度测定图；

图3为本申请制备得到的目标化合物的质谱图；

图4为本申请制备得到的目标化合物的H谱图；

图5为本申请制备得到的目标化合物的C谱图；

图6为本申请制备得到的目标化合物的H-H COSY谱图；

图7为本申请制备得到的目标化合物的HSQC谱图；

图8为本申请制备得到的目标化合物的HMBC谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

将滇山茶的茶果晾晒，去壳，以冷榨法脱去油脂后晾干并适当粉碎，即得到滇山茶饼。以体积分数为50％的乙醇水溶液于40℃条件下超声浸提3次，每次6h，料液比为1:4(m/v)，然后进行过滤、合并，得到提取液。将提取液减压浓缩至无醇旋出，得浓缩液。

选取大孔树脂的型号为D101型：粒径60-16目、比表面积≥550m²/g、比照吸附量(酚/干基)≥20mg/g。将2L大孔树脂与适量的水混合后装入柱体积为2L的层析柱中，用5L的100％乙醇脱色至颜色清亮，再用纯水冲洗直至完全无醇味。取浓缩液2L，将其缓慢的加入到大孔树脂层析柱中，然后用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇依次洗脱至无色，洗脱液用干净玻璃瓶进行收集，每瓶500mL，依次标记为A1、A2、A3、……，将标记好的洗脱液用高效液相色谱分析仪进行检测，收集含有目标化合物的A26-28洗脱液，得到粗流份段。

取1000g RP-C18填料加入适量乙醇水溶液进行超声，去除多余气泡后装入柱体积为1.2L的层析柱中，得到RP-C18填料层析柱；将粗流份段加入RP-C18填料层析柱，用乙腈-甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，其中，乙腈-甲酸水溶液体系为：流动相A为乙腈、流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液；洗脱梯度配比为：流动相A与流动相B的体积比依次为17：83、30：70、40：60、100：0，每个洗脱梯度洗脱至无色为止。洗脱过程中，洗脱液用干净玻璃瓶进行收集，每瓶200mL，按接收顺序分别编号B1、B2、B3……，对收集的洗脱液进行高效液相色谱分析，根据检测结果合并洗脱液，取B22-25洗脱液得到准流份段；将准流份段减压浓缩并用氮吹仪吹干，冷冻干燥后得到粗分离物，于-20℃条件下保存。

将粗分离物用体积比50：50的甲醇-0.1％甲酸水溶液溶解，浓度20mg/mL；使用LC3000型高效液相色谱仪、C18色谱柱、用甲醇-甲酸水溶液体系作为流动相进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物。其中，C18色谱柱的规格为：Venusil MP C18，尺寸10mm×250mm，填料粒径为5微米；甲醇-甲酸水溶液体系为：流动相C为甲醇，流动相D为体积分数0.1％的甲酸水溶液；其洗脱配比为：所述流动相C与所述流动相D的体积比为50：50。

使用Venusil MP C18色谱柱对B22-25洗脱液进行制备的HPLC谱图如图1所示，其中1号峰对应本申请目标化合物。

实施例2

将滇山茶的茶果晾晒，去壳，以冷榨法脱去油脂后晾干并适当粉碎，即得到滇山茶饼。以体积分数为60％的乙醇水溶液于30℃条件下超声浸提4次，每次6h，料液比为1:3(m/v)，然后进行过滤、合并，得到提取液。将提取液减压浓缩至无醇旋出，得浓缩液。

选取大孔树脂的型号为D101型：粒径60-16目、比表面积≥550m²/g、比照吸附量(酚/干基)≥20mg/g。将2L大孔树脂与适量的水混合后装入柱体积为2L的层析柱中，用4L的100％乙醇脱色至颜色清亮，再用纯水冲洗直至完全无醇味。取浓缩液2L，将其缓慢的加入到大孔树脂层析柱中，然后用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇依次洗脱至无色，洗脱液用干净玻璃瓶进行收集，每瓶500mL，依次标记为A1、A2、A3、……，将标记好的洗脱液用高效液相色谱分析仪进行检测，收集含有目标化合物的A26-28洗脱液，得到粗流份段。

取1000g RP-C18填料加入适量乙醇水溶液进行超声，去除多余气泡后装入柱体积为1.2L的层析柱中，得到RP-C18填料层析柱；将粗流份段加入RP-C18填料层析柱，用乙腈-甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，其中，乙腈-甲酸水溶液体系为：流动相A为乙腈、流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液；洗脱梯度配比为：流动相A与流动相B的体积比依次为17：83、30：70、40：60、100：0，每个洗脱梯度洗脱至无色为止。洗脱过程中，洗脱液用干净玻璃瓶进行收集，每瓶200mL，按接收顺序分别编号B1、B2、B3……，对收集的洗脱液进行高效液相色谱分析，根据检测结果合并洗脱液，取B22-25洗脱液得到准流份段；将准流份段减压浓缩并用氮吹仪吹干，冷冻干燥后得到粗分离物，于-20℃条件下保存。

将粗分离物用体积比50：50的甲醇-0.1％甲酸水溶液溶解，浓度20mg/mL；使用LC3000型高效液相色谱仪、C18色谱柱、用甲醇-甲酸水溶液体系作为流动相进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物。其中，C18色谱柱的规格为：Venusil MP C18，尺寸10mm×250mm，填料粒径为5微米；甲醇-甲酸水溶液体系为：流动相C为甲醇，流动相D为体积分数0.1％的甲酸水溶液；其洗脱配比为：所述流动相C与所述流动相D的体积比为50：50。

实施例3

将滇山茶的茶果晾晒，去壳，以冷榨法脱去油脂后晾干并适当粉碎，即得到滇山茶饼。以体积分数为55％的乙醇水溶液于35℃条件下超声浸提2次，每次6h，料液比为1:3.5(m/v)，然后进行过滤、合并，得到提取液。将提取液减压浓缩至无醇旋出，得浓缩液。

选取大孔树脂的型号为D101型：粒径60-16目、比表面积≥550m²/g、比照吸附量(酚/干基)≥20mg/g。将2L大孔树脂与适量的水混合后装入柱体积为2L的层析柱中，用4-5L的100％乙醇脱色至颜色清亮，再用纯水冲洗直至完全无醇味。取浓缩液2L，将其缓慢的加入到大孔树脂层析柱中，然后用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇依次洗脱至无色，洗脱液用干净玻璃瓶进行收集，每瓶500mL，依次标记为A1、A2、A3、……，将标记好的洗脱液用高效液相色谱分析仪进行检测，收集含有目标化合物的A26-28洗脱液，得到粗流份段。

取1000g RP-C18填料加入适量乙醇水溶液进行超声，去除多余气泡后装入柱体积为1.2L的层析柱中，得到RP-C18填料层析柱；将粗流份段加入RP-C18填料层析柱，用乙腈-甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，其中，乙腈-甲酸水溶液体系为：流动相A为乙腈、流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液；洗脱梯度配比为：流动相A与流动相B的体积比依次为17：83、30：70、40：60、100：0，每个洗脱梯度洗脱至无色为止。洗脱过程中，洗脱液用干净玻璃瓶进行收集，每瓶200mL，按接收顺序分别编号B1、B2、B3……，对收集的洗脱液进行高效液相色谱分析，根据检测结果合并洗脱液，取B22-25洗脱液得到准流份段；将准流份段减压浓缩并用氮吹仪吹干，冷冻干燥后得到粗分离物，于-20℃条件下保存。

将粗分离物用体积比50：50的甲醇-0.1％甲酸水溶液溶解，浓度20mg/mL；使用LC3000型高效液相色谱仪、C18色谱柱、用甲醇-甲酸水溶液体系作为流动相进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物。其中，C18色谱柱的规格为：Venusil MP C18，尺寸10mm×250mm，填料粒径为5微米；甲醇-甲酸水溶液体系为：流动相C为甲醇，流动相D为体积分数0.1％的甲酸水溶液；其洗脱配比为：所述流动相C与所述流动相D的体积比为50：50。

对实施例1-3得到的化合物单体的纯度进行测定，其测定条件为：使用LC3000型高效液相色谱仪、Venusil MP C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸水；控制流速1mL/min、检测器UV205nm、进样量2μL，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：起始，流动相A与流动相B的体积比为10：90；30min，流动相A与流动相B的体积比为100：0。其中实施例1得到纯度为95.3％，提取得率30.6mg/kg。纯度测定图如图2所示。实施例2-3得到的目标提取物纯度和得率均大于等于前述值。

对实施例1-3得到的化合物单体均进行LC-MS测定和核磁共振检测。

如图3所示，根据质谱数据m/z743.2402[M+H]⁺，质子碎片m/z581.1864[(M-162)+H]⁺，435.1288[(M-162-146)+H]⁺，289.0707[(M-162-146-146)+H]⁺。推测该化合物为二氢山奈酚糖苷，其分子式为C₃₃H₄₀O₁₉。

图4(¹H-NMR)中，δ5.95(H,s)与δ5.93(H,s)，符合苯环上间位氢的特征，推断其分属于二氢山奈酚A环H-6与H-8。δ7.39(2H,d,J＝8.4Hz)与δ6.88(2H,d,J＝8.4Hz)，通过积分面积可得该两组信号均包含2个质子，应属于对称结构，其化学位移、裂分及耦合常数符合苯环上邻位氢的特征，该结果与二氢山奈酚B环结构相符合，因此推断其分属于二氢山奈酚B环H-2'，6'与H-3'，5'。δ5.21(H,d,J＝10.5Hz)与δ4.57(H,d,J＝10.5Hz)，通过其化学位移及耦合裂分情况，推断其分别属于二氢山奈酚H-2以及H-3。δ5.24(H,s)、4.73(H,s)以及4.05(H,d,J＝7.4Hz)分属于三个糖端基质子，其中δ4.05(H,d,J＝7.4Hz)为葡萄糖端基质子信号，其余两组则分属于两个鼠李糖端基。δ1.23(3H,d,J＝5.8Hz)及δ1.29(3H,d,J＝6.0Hz)为两个鼠李糖甲基信号。δ4.0-3.0段多组信号为糖基其它质子信号，该结果与质谱推断相吻合。

图5(¹³C-NMR)中，δ105.35，73.85，71.70，70.72，77.13，62.03为一组葡萄糖苷信号，δ102.10，82.42，71.52，78.74，70.87，17.93以及δ101.78，71.84，74.23，78.28，70.24，17.88为两组组鼠李糖苷信号，其余信号与二氢山奈酚特征信号高度吻合，该结果与上述推断一致。

H-H COSY(见图6)中，δ7.39(2H,d,J＝8.4Hz)与δ6.88(2H,d,J＝8.4Hz)相互耦合，形成典型的对位取代苯的AA'BB'自旋耦合体系，符合二氢山奈酚B环结构；δ5.21(H,d,J＝10.5Hz)与δ4.57(H,d,J＝10.5Hz)相互耦合，符合二氢山奈酚H-2与H-3特征；δ4.05(H,d,J＝7.4Hz)与δ3.50(m)相互耦合，根据化学位移值可推断其δ4.05(H,d,J＝7.4Hz)归属于葡萄糖苷端基，通过其耦合常数(J＝7.4Hz＞7.0Hz)可以判断，该葡萄糖苷键为β构型。δ1.23(3H,d,J＝5.8Hz)、1.29(3H,d,J＝6.0Hz)均与δ3.00-4.00(m)相互耦合，符合鼠李糖苷甲基质子信号特征。

HSQC(见图7)中，δ83.46与δ5.21(H,d,J＝10.5Hz)对应，δ81.29与δ4.57(H,d,J＝10.5Hz)对应，δ97.41与δ5.95(H,s)对应，δ96.30与5.93(H,s)对应，δ130.15与δ7.39(2H,d,J＝8.4Hz)对应，δ116.51与δ6.88(2H,d,J＝8.4Hz)对应，δ102.10与δ4.73(H,s)对应，δ17.93与δ1.23(3H,d,J＝5.8Hz)对应，δ105.35与δ4.05(H,d,J＝7.4Hz)对应，δ62.03与δ3.71(H,d,J＝1.8Hz)对应，δ101.78与δ5.24(H,s)对应。δ17.88与δ1.29(3H,d,J＝6.0Hz)对应。

结合H-H COSY以及HSQC，通过HMBC(见图8)可确定不同片段的连接位点，δ4.73(H,s)与δ81.29，可知该鼠李糖苷Rha(1)与二氢山奈酚C-3相连；δ4.05(H,d,J＝7.4Hz)与δ82.42相关，可知该葡萄糖苷Glu与Rha(1)-C-2相连；δ5.24(H,s)与δ78.74相关，可知该鼠李糖苷Rha(2)与Rha(1)-C-4相连。

对H谱和C谱的峰进行归属如下：

¹³C-NMR:83.46(C-2),81.29(C-3),195.75(C-4),165.45(C-5),97.41(C-6),168.60(C-7),96.30(C-8),163.99(C-9),102.45(C-10),128.71(C-1’),130.15(C-2’,6’),116.51(C-3’,5’),159.17(C-4’),102.10(C-1”),82.42(C-2”),71.52(C-3”),78.74(C-4”),70.87(C-5”),17.93(C-6”),105.35(C-1”’),73.85(C-2”’),71.70(C-3”’),70.72(C-4”’),77.13(C-5”’),62.03(C-6”’),101.78(C-1””),71.84(C-2””),74.23(C-3””),78.28(C-4””),70.24(C-5””),17.88(C-6””)。

¹H-NMR:5.21(H,d,J＝10.5Hz,H-2),4.57(H,d,J＝10.5Hz,H-3),5.95(H,s,H-6),5.93(H,s,H-8),7.39(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.88(2H,d,J＝8.4Hz,H-3’,5’),4.73(H,s,H-1”),4.22(H,m,H-5”),1.23(3H,d,J＝5.8Hz,H-6”),4.05(H,d,J＝7.4Hz,H-1”’),3.71(H,d,J＝1.8Hz,H-6”’),5.24(H,s,H-1””),4.05(H,m,H-4.05(H,m),1.29(3H,d,J＝6.0Hz,H-6””)。

综合所有核磁谱图及质谱结果，该化合物鉴定为二氢山奈酚-3-[β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-[α-L-鼠李糖基(1-4)]-α-L-鼠李糖苷]，结构式为：

本申请提供的提取二氢山奈酚糖苷类化合物的方法，首次从自然界分离提取出了目标化合物，方法简单实用，适宜于规模化应用，产品纯度高，对于滇山茶的深度开发利用有着积极意义，也为二氢山奈酚糖苷的应用提供了一个稳定、绿色、高效的来源。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.一种二氢山奈酚糖苷类化合物的提取方法，其特征在于，所述二氢山奈酚糖苷类化合物的结构式为：

所述方法包括以下步骤:

A.将滇山茶饼用乙醇水溶液进行超声浸提，得到提取液；将所述提取液减压蒸馏至无醇得到浓缩液；

B.将所述浓缩液加入大孔树脂层析柱，依次用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得粗流份段；所述大孔树脂层析柱中的大孔树脂的型号为D101，粒径为60-16目、比表面积≥550m²/g、比照吸附量以酚/干基计算≥20mg/g；

C.将所述粗流份段加入RP-C18填料层析柱，用乙腈-甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得准流份段；减压浓缩、干燥得到粗分离物；

D.使用C18色谱柱、用甲醇-甲酸水溶液体系作为流动相，将所述粗分离物用溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔树脂使用前需用乙醇洗脱至颜色清亮，再用纯水洗脱至无醇味。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，所述大孔树脂层析柱的柱体积为2L；每500mL收集一次洗脱液并顺次标号，所述粗流份段由第A26-28号洗脱液合并得到。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RP-C18填料层析柱的制备方法为：取RP-C18填料加入乙醇溶液进行超声，去除多余气泡后装入层析柱中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤C中，所述乙腈-甲酸水溶液体系为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液；洗脱梯度配比为：流动相A与流动相B的体积比依次为17：83、30：70、40：60、100：0，每个洗脱梯度洗脱至无色为止。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤C中，所述RP-C18填料层析柱的柱体积为1.2L；每200mL收集一次洗脱液并顺次标号，所述准流份段由第B22-25号洗脱液合并得到。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤D中，所述C18色谱柱的规格为：VenusilMP C18，尺寸10mm×250mm，填料粒径为5微米；所述甲醇-甲酸水溶液体系为：流动相C为甲醇，流动相D为体积分数0.1％的甲酸水溶液；其洗脱配比为：所述流动相C与所述流动相D的体积比为50：50。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述滇山茶饼的制作方法为：将滇山茶果晾干、去壳，以冷榨法脱去油脂后晾干，粉碎即可；所述乙醇水溶液的体积分数为50-60％；所述浸提的方法为：料液比为1kg所述滇山茶饼对应3-4L所述乙醇水溶液，在30-40℃条件下超声浸提2-4次，过滤得到所述提取液。

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