CN105432673A - 一种高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法及应用，还提供了一种油茶抑菌提取物和两种油茶抑菌化合物。本发明通过优化高速逆流色谱的操作条件，分离得到了油茶中三种抑菌活性物质，操作简单，所得单体纯度高，实现了抑菌活性物质快速高效地分离，且分离得到的抑菌活性物质能有效的抑制细菌和真菌。

Description

一种高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法及应用
技术领域
本发明涉及高速逆流色谱分离纯化领域，具体涉及一种高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法及应用，还涉及一种油茶提取物。
背景技术
目前，对植物源中活性成分的提取大部分采用水提法、水蒸气蒸馏法、有机溶剂法、超滤膜法等，这些方法不同程度地存在得率低、提取时间长、流程多、能耗大、纯度低等缺点。
而高速逆流色谱是一种新型的液—液分配色谱技术，可以在较短的时间内实现样品在两个互不相溶的溶剂系统中的高效分配，从而实现样品高度分离。HSCCC最大的优点是每次分离样品的进样量比较大，可以达到毫克量级，甚至克量级；同时，HSCCC是一种不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术。它不需要任何固态载体，只是借助螺旋管的同轴行星式运动实现固定相的高保留以充分分配分离，避免了分离样品与固态载体表面发生化学反应而变性和不可逆吸附等情况。每次分离样品结束后，管道中残留溶剂均可冲出，不会对后续分离产生任何影响，因此分离样品均具有高回收率。
目前，应用HSCCC方法分离制备油茶中最强抑菌活性物质的研究还尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法及应用、油茶提取物。
第一方面，本发明提供了一种高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法，包括以下步骤：
(1)油茶粗提物的制备：连续相变萃取茶粉原料，获得油茶粗提物；
(2)高速逆流色谱法分离：采用含1-10％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液作为两相溶剂体系，在流速1.0～3.0mL/min，主机转速500～900r/min，进样量100mg～600mg的条件下，将步骤(1)制得的油茶粗提物进行高速逆流色谱法分离，并根据峰形分段收集流出液，获得油茶中的抑菌物质；其中，所述含1-10％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液中，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为1：2～4：4。
优选的，步骤(1)中所述的茶粉原料通过将油茶的茶叶或茶梗、根、花、籽粕粉碎制得。
进一步优选的，将油茶的茶叶或茶梗、根、花、籽粕粉碎至20-80目，得到茶粉原料。
优选的，步骤(1)所述的连续相变萃取茶粉原料，获得油茶粗提物的步骤包括：将茶粉原料装入萃取釜中，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，将萃取剂压缩为液体，在萃取温度50-90℃，萃取压力0.3-0.7MPa的条件下，流经萃取釜，连续萃取1-5h，所得萃取物流经解析釜，获得油茶粗提物。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂包括但不限于乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷，丙烷、丁烷中的一种或多种。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂的浓度为50-90％。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为70-90％的乙醇水溶液，萃取温度优选为70-90℃，萃取压力优选为0.4-0.6MPa，连续萃取1-3h。
优选的，所述步骤(1)中，所述流经萃取釜的流速为80-150L/h。
优选的，所述步骤(1)中，所述流经解析釜中解析并收集萃取物的条件为：解析温度为80-90℃，解析压力为0.05-0.2MPa。
进一步优选的，所述步骤(1)中，解析温度为90℃，解析压力为0.2MPa。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为70％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃，萃取压力0.4MPa，连续萃取1h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为70％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃，萃取压力0.5MPa，连续萃取2h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为70％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度90℃，萃取压力0.6MPa，连续萃取3h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度90℃，萃取压力0.5MPa，连续萃取1h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃，萃取压力0.6MPa，连续萃取2h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃，萃取压力0.4MPa，连续萃取3h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为90％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃，萃取压力0.6MPa，连续萃取1h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为90％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度90℃，萃取压力0.4MPa，连续萃取2h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为90％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃，萃取压力0.5MPa，连续萃取3h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃，萃取压力0.5MPa，连续萃取1h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃，萃取压力0.4MPa，连续萃取3h。
优选的，所述步骤(1)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃，萃取压力0.4MPa，连续萃取1h。
可以理解的是，本领域技术人员为了后续纯化，可进一步采用有机溶剂对步骤(1)获得的油茶粗提物进一步萃取提纯。所述有机溶剂包括但不限于石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、苯、氯仿、二氯乙烷，丙烷、丁烷中的一种或多种。
优选的，所述采用有机溶剂对步骤(1)获得的油茶粗提物进一步萃取提纯的步骤包括：
将步骤(1)所得油茶粗提物加入蒸馏水溶解后，加入石油醚，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物。
进一步优选的，采用有机溶剂对所得石油醚萃取物进一步萃取提纯的步骤包括：
将所得石油醚萃取物加入蒸馏水溶解后，加入乙酸乙酯，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。
更进一步优选的，采用有机溶剂对所得乙酸乙酯萃取物进一步萃取提纯的步骤包括：
将所得乙酸乙酯萃取物加入蒸馏水溶解后，加入正丁醇，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的正丁醇萃取液，直至正丁醇层澄清无色。将萃取液合并，减压浓缩得正丁醇萃取物。
优选的，步骤(2)中，采用含3％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液作为两相溶剂体系。
优选的，步骤(2)中，所述含1-10％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液中，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为1：4：4、1：3：4或1：2：4。
可以理解的是，步骤(2)中乙酸乙酯-正丁醇-水(含1-10％乙酸，优选含3％乙酸)溶剂体系的配制方法为本领域技术人员容易理解的常规技术，包括但不限于如下方法：将乙酸乙酯、正丁醇、水、乙酸按一定体积比用分液漏斗配制，充分振摇后静置过夜，分离上、下相，两相分别超声脱气15～30min，即得乙酸乙酯-正丁醇-水(含1-10％乙酸，优选含3％乙酸)溶剂体系，以上相溶液为高速逆流色谱的固定相，下相溶液为流动相。
优选的，步骤(2)中，所述流速为1.5～3.0mL/min，主机转速为800～850r/min，进样量为100～500mg。
进一步优选的，步骤(2)中，所述流速为1.5～1.7mL/min，主机转速为800～850r/min，进样量为100～500mg。
更进一步优选的，步骤(2)中，所述流速为1.5～1.7mL/min，主机转速为850r/min，进样量为500mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：4：4)作为两相溶剂，在流速3mL/min，主机转速800r/min，进样量100mg的条件下，根据峰形分段收集流出液。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：4：4)作为两相溶剂，所述流速为1.7mL/min，主机转速为850r/min，进样量为500mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：4：4)作为两相溶剂，流速1.5mL/min，主机转速850r/min，进样量500mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：3：4)作为两相溶剂，所述流速为1.5mL/min，主机转速为800r/min，进样量为100mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：3：4)作为两相溶剂，所述流速为2.0mL/min，主机转速为850r/min，进样量为300mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：3：4)作为两相溶剂，所述流速为3.0mL/min，主机转速为850r/min，进样量为500mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：2：4)作为两相溶剂，所述流速为1.5mL/min，主机转速为800r/min，进样量为100mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：2：4)作为两相溶剂，所述流速为2.0mL/min，主机转速为850r/min，进样量为300mg。
优选的，步骤(2)中，选用乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：2：4)作为两相溶剂，所述流速为3.0mL/min，主机转速为850r/min，进样量为500mg。
可以理解的是，步骤(2)高速逆流色谱分离的方法为本领域技术人员容易理解的常规技术，包括但不限于如下方法：将固定相以流速15mL/min泵入高速逆流色谱仪的分离柱中，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调节转速，顺时针旋转。待固定相冲入整个柱子后，将仪器柱子打开使之转动，设定进样量优选为100～600mg、流动相流速优选为1.0～3.0mL/min、主机转速优选为500～900r/min，当固定相在转动的柱内稳定后，泵入流动相。当流出液上、下相开始分层，并且流出液的上相不再改变，观察紫外检测器基线稳定，这时整个逆流色谱仪内系统已经达到动态平衡。此时将分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，开启紫外灯，将所述样品溶液用微孔直径优选为0.45μm的微孔滤膜过滤后注入进样环，色谱峰收集的流份优选在280nm波长下被检测。
优选的，本发明第一方面提供的方法还包括将步骤(2)中根据峰形分段收集的流出液采用高效液相色谱法进一步分离。
进一步优选的，所述高效液相色谱法采用C18柱，在流动相为30％甲醇溶液，检测波长210nm，流速10mL/min，进样量50μL，样品浓度15mg/mL的条件下进一步分离。
第二方面，本发明提供了一种油茶抑菌提取物，所述油茶抑菌提取物为采用如第一方面所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法所提取。
第三方面，本发明提供了一种油茶抑菌化合物，其结构式如下：
其中，R为
所述的一种油茶抑菌化合物分子式为C33H40O20，名称为山奈酚3-O-{β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-葡萄糖甙}，其结构式如下：
所述的一种油茶抑菌化合物，名称为山奈酚3-O-{β-D-吡喃木糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-葡萄糖甙，其结构式如下：
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法、如第二方面所述的油茶抑菌提取物、如第三方面所述的油茶抑菌化合物在制备抑菌剂中的应用。
本发明的有益效果：本发明通过优化高速逆流色谱的操作条件，分离得到了油茶中抑菌活性物质，操作简单，所得单体纯度高，实现了抑菌活性物质快速高效地分离，且分离得到的抑菌活性物质能有效的抑制细菌和真菌。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是以乙酸乙酯-正丁醇-水(3％乙酸)(1:4:4)为溶剂，在流速3ml/min,转速800r/min,波长405nm,进样量500mg的条件下，油茶粗提物的高速逆流色谱图；
图2是以乙酸乙酯-正丁醇-水(3％乙酸)(1:3:4)为溶剂，在流速3ml/min,转速800r/min,波长405nm,进样量500mg的条件下，油茶粗提物的高速逆流色谱图；
图3是以乙酸乙酯-正丁醇-水(3％乙酸)(1:2:4)为溶剂，在流速3ml/min,转速800r/min,波长405nm,进样量500mg的条件下，油茶粗提物的高速逆流色谱图；
图4是以正己烷-正丁醇-水(3％乙酸)(3:4:7)为溶剂，在流速3ml/min,转速800r/min,波长405nm,进样量500mg的条件下，油茶粗提物的高速逆流色谱图；
图5是以乙酸乙酯-正丁醇-水(3％乙酸)(1:4:4)为溶剂，在流速1.7ml/min,850rpm/min,波长405nm,进样量500mg的条件下，油茶粗提物的高速逆流色谱图；
图6是以乙酸乙酯-正丁醇-水(3％乙酸)(1:4:4)为溶剂，在流速1.5ml/min,转速850rpm/min,波长405nm进样量500mg的条件下，油茶粗提物的高速逆流色谱图；
图7是F1\F2\F3组分的全波长扫描图谱；
图8是NL2组分及F1\F2\F3的薄层层析图；
图9是NL2组分分析液相图；
图10是F1组分分析液相图；
图11是F2组分分析液相图；
图12是F3组分分析液相图；
图13是F2的核磁氢谱图；
图14是F2的质谱图；
图15是J2的核磁氢谱图；
图16是J2的质谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本领域技术人员可以理解的是，连续相变萃取的具体步骤如下：采用连续相变萃取法提取油茶中抑菌物质，是先将油茶的茶叶或茶梗、根、花、籽粕粉碎后装入连续相变萃取装置的萃取釜中，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，高压泵将萃取剂压缩为液体，以一定流速流经萃取釜萃取提取物粗品，进入解析釜中，在解析釜中通过加热、减压使萃取剂相变为气体，再通过即时冷却降温，萃取剂变为液体回到溶剂回收桶中，桶中的液态萃取剂通过加压泵再次流经萃取釜，对物料再次萃取，如此循环多次。
连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的工艺流程如下：
本发明采用的仪器如下
实施例1乙醇浓度对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
(1)原料处理：将油茶籽粕粉碎至20-80目，得到茶粉原料。
(2)连续相变萃取：将步骤(1)所得茶粉原料1.5kg并装入萃取釜中，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，将浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂压缩为液体，在萃取温度80℃、萃取压力0.4MPa的条件下，以100L/h的流速流经萃取釜，连续萃取2h，萃取油茶中抑菌物质后，在解析温度80℃、解析压力0.2MPa的条件下，流经解析釜中，分别获得油茶中的抑菌物质287g、293g、300g、310g、303g。
(3)细菌抑菌实验
选用大肠杆菌，金黄色葡萄球菌作为供试菌，以上菌种均为华南农业大学食品学院微生物实验室保藏，均为广东省微生物所提供。
培养基的配置：LB固体培养基的制法：分别称取胰蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、氯化钠10.0g、琼脂20g，加热搅拌溶于1000ml的水中，分装，高压湿热灭菌(121℃，20min)，备用。
菌种的活化：将培养基等放入高温灭菌锅中以121℃灭菌20min，冷却后，用接种环从菌株平板挑单菌落于3-5mlLB液体培养基中，于37℃、250r/min恒温摇床中培养过夜。
菌悬液的配制：再吸取30μl以上菌悬液转接于3ml新鲜LB液体培养基中再次活化，于37℃、250r/min恒温摇床中培养3-5h，测OD值，用LB液体培养基稀释为OD600＝0.01-0.1(即菌液浓度为10-10cfu/ml)。
抑菌圈法测抑菌活性大小的操作方法：吸取40μl大肠杆菌稀释液(或20μl金黄色葡萄球菌)至直径为9cm的培养皿中，加入10ml经溶解灭菌并冷却至40-50℃的LB固体培养基，迅速振荡摇匀，致使菌体分散均匀，冷却后用直径2.7mm的打孔器打孔，每孔加入5μl待测液，所述待测液为步骤(2)所得的抑菌物质，以灭菌发酵培养基为对照，静置片刻，37℃倒置培养过夜，通过十字交叉法测量抑菌圈直径。
(4)霉菌抑菌实验
选取黑曲霉作为供试菌，以上菌种为华南农业大学食品学院微生物实验室保藏，均为广东省微生物所提供。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的配置：将200g马铃薯去皮，切成小块，加水煮软，用纱布过滤，再加20g蔗糖和15g琼脂，融化后补足水分至1000ml，分装，高压湿热灭菌(121℃，20min)，备用。
菌种的活化：将洗净烘干的培养皿包扎好，放入高温灭菌锅中以121℃灭菌20min，后取出培养皿，待其干燥后，倒入统一灭菌的培养基，培养基凝固，用接种环从冻干管中取出该菌种，在凝固好的培养基划线接种，然后放入恒温培养箱内，28℃培养48h，备用。
孢子的收集：在长满成熟孢子的真菌平板加3-5ml灭菌蒸馏水，用接种环轻轻划平板表面，然后吸取孢子悬液经4层灭菌纱布过滤至小三角瓶，用5ml的灭菌水将纱布上面的孢子冲下去，得孢子液稀释至OD600＝0.01-0.1范围(即菌液浓度为105-106cfu/ml)。
抑菌圈法测抑菌活性大小的操作方法：取孢子悬液20μl加至直径为9cm的培养皿中，加入10ml经溶解并冷却至40-50℃的PDA培养基，迅速震荡摇匀，使孢子分散均匀，冷凝后用直径2.7mm的打孔器打孔，每孔加入5μl待测液，以灭菌发酵培养基为对照，静置片刻，30℃倒置培养过夜，测量抑菌圈直径，具体如表1所示。
实验结果显示：随着乙醇浓度的逐渐升高，连续相变萃取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈均有增大的趋势，且当乙醇浓度为80％时，所述连续相变萃取物的抑菌圈最大，说明其抑菌活性最强。
表1不同乙醇浓度对连续相变萃取物抑菌活性大小的影响(X±SD，n＝3)
实施例2萃取压力对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，将实施例1步骤(2)中的50％、60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂替换成浓度为80％乙醇萃取剂，将实施例1步骤(2)中的萃取压力0.4MPa替换成0.3MPa、0.4MPa、0.5MPa、0.6MPa、0.7MPa，分别获得油茶中的抑菌物质291g、302g、311g、301g、297g，具体如表2所示。
实验结果显示：随着系统萃取压力的逐渐升高，抑菌圈直径的大小有所变化，但规律性不明显，当压力在达到0.5MPa后，萃取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌效果在较高的水平上。因此，萃取压力为0.5MPa用于正交实验设计，过低的压力不利于提取介质的流动，过高的压力不利于抑菌活性物的溶出。
表2不同压力对油茶中抑菌物质的抑菌活性大小的影响(X±SD，n＝3)
实施例3萃取温度对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，将实施例1步骤(2)中的50％、60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂替换成浓度为80％乙醇萃取剂，将实施例1步骤(2)中的萃取温度80℃替换成50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，分别获得油茶中的抑菌物质293g、296g、302g、317g、310g，具体如表3所示。
实验结果显示：随着萃取温度的逐渐升高，提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌圈增大，当温度超过80℃以后，呈现逐步下降的趋势，可能是在一定的温度范围内，温度的升高有利于物料中抑菌活性物的渗出，但过高的温度会损伤抑菌物的活性，因此，取温度为80℃为连续相变萃取的提取温度。
表3不同温度对油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响(X±SD，n＝3)
实施例4萃取时间对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，将实施例1步骤(2)中的50％、60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂替换成浓度为80％乙醇萃取剂，将实施例1步骤(2)中的萃取时间2h替换成1h、2h、3h、4h、5h，分别获得油茶中的抑菌物质294g、308g、312g、317g、323g，具体如表4所示。
实验结果显示：随着萃取时间的逐渐加长，提取物对三种菌的抑菌圈变化明显，在提取2h时达到最大，当萃取时间超过2h以后，抑菌圈的直径没有明显的增大，即提取时间对抑菌活性的影响不显著，延长提取时间跟提取物的得率关系很大。因此，选取2h时为正交试验的提取时间。
表4不同时间对油茶中抑菌物质抑菌活性大小的影响(X±SD，n＝3)
实施例5连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的正交试验
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，根据实施例1-4所得的最优萃取条件，以萃取物的抑菌活性为考察指标，以乙醇浓度(A)、萃取时间(B)、萃取压力(C)、萃取温度(D)为因素，设计L9(34)正交试验。研究不同乙醇浓度(A)、萃取时间(B)、萃取压力(C)、萃取温度(D)因素与萃取物抑菌能力的关系，并根据极差分析、直观分析优化最佳提取工艺条件。正交试验的实验数据见表6。
表5连续相变萃取提取的油茶中抑菌物质的L9(34)正交试验因素水平表
实验结果显示：通过对正交实验数据表6的直观分析，萃取物对大肠杆菌有最强抑菌活性的提取工艺条件是A2B1C2D1；萃取物对金黄色葡萄球菌有最强抑菌活性的提取工艺条件是A2B3C1D2；萃取物对黑黄霉有最强抑菌活性的提取工艺条件也是A2B3C1D2。因此，从上面的三个组合可以看出，因素(A)乙醇的浓度对提取抑菌活性物的影响是比较大，也是比较确定的，都是80％浓度的醇，其他三个因素的影响，因指标不一而有所变化，且对金黄色葡萄球菌与黑曲霉的抑制而言，两者的提取因素水平亦是相同。
从整体考虑因素水平对实验指标的影响。从表6可以看出，A2B1C3D2对大肠杆菌的抑菌活性影响最大，对金黄色葡萄球菌而言，影响最大的因素水平是A2B3C1D2，对黑曲霉而言，影响最大因素水平是A2B1C1D2。从表6可以看出，乙醇浓度及萃取温度对三种菌的抑菌活性影响是一致的，都是80％的乙醇及80℃，而萃取时间和萃取压力两个因素中，对三种菌而言，同时对两种菌影响比较大的是B1及C1，即是1h和0.4MPa。相比较之前的直观分析，在萃取时间和萃取压力的选择上，对两种菌一致的是B3和C1，即3h及0.4MPa，可以确定同时对三种菌比较优势的压力水平是C1，即0.4MPa。因引对于因素B的水平选择，可以参考实施例1-4，萃取时间对抑菌物抑菌活性的大小影响不大，可能是由于高温，太长的萃取时间对抑菌活性物有一定的破坏作用，因此萃取时间选取1h，进行验证。
通过正交实验设计，拟确定的因素最优水平是提取介质是80％乙醇，萃取时间为1h，萃取压力为0.4MPa，萃取温度为80℃，对此因素水平进行实验验证。重复实施例1的步骤，将实施例1步骤(2)中的连续相变萃取条件替换成80％乙醇，萃取时间1h，萃取压力0.4MPa，萃取温度80℃，获得油茶中的抑菌物质303g。
实验结果显示：其萃取物冻干后对大肠杆菌的抑菌圈直径为13.6mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15.1mm，对黒曲霉的抑菌圈直径为13.8mm，达到最好的抑菌效果。
表6连续相变萃取提取油茶籽粕中抑菌物质的正交实验数据表(X±SD，n＝3)
实施例6一种油茶中抑菌物质的纯化方法
(1)原料处理：将油茶籽粕粉碎至20-80目，得到茶粉原料。
(2)连续相变萃取：将步骤(1)所得茶粉原料1.5kg并装入萃取釜中，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，将浓度为80％的乙醇萃取剂压缩为液体，在萃取温度80℃、萃取压力0.4MPa的条件下，以100L/h的流速流经萃取釜，连续萃取1h，萃取油茶中抑菌物质后，在解析温度80℃、解析压力0.2MPa的条件下，流经解析釜中，获得萃取物303g。
(3)将步骤(2)所得的抑菌物质浓缩干燥后，加入蒸馏水溶解，摇匀，转入分液漏斗中，加入4倍体积的石油醚，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的石油醚萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物(SYM)。
(4)将步骤(3)所得石油醚萃取物(SYM)加入蒸馏水溶解后，加入4倍体积的乙酸乙酯，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物(YSYZ)。
(5)将步骤(4)所得乙酸乙酯萃取物(YSYZ)加入蒸馏水溶解后，加入4倍体积的正丁醇，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的正丁醇萃取液，直至正丁醇层澄清无色，将萃取液合并，减压浓缩得正丁醇萃取物(ZDC)。
(6)将步骤(2)中所得萃取物浓缩干燥后，采用水萃取，减压浓缩获得提取物，标记为SZF(即为水提取物)。
(7)重复实施例1步骤(3)中的细菌抑菌实验和步骤(4)中的霉菌抑菌实验，将实施例1步骤(3)和(4)中的待测液替换成所述的萃取物、石油醚萃取物(SYM)、乙酸乙酯萃取物(YSYZ)、正丁醇萃取物(ZDC)和水提取物(SZF)，实验结果如表7所示。
实验结果显示：对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黒曲霉三种菌中，正丁醇提取物(ZDC)的抑菌圈最大，均大于其余三个提取物及萃取物的抑菌圈，因此推测正丁醇萃取组分中含有最强抑菌活性物质或含有最多的抑菌活性物质。
表7不同极性溶剂提取物的抑菌活性大小(X±SD，n＝3)
实施例7高速逆流色谱溶剂系统的选择
在高速逆流色谱(HSCCC)分离纯化中，溶剂体系的选择相当重要。溶剂体系的选择主要应考虑溶剂对分离物质的溶解性、分配系数K、分离因子α、分层时间、分离过程中固定相保留率等。根据参考文献和前期经验发现，对HSCCC最合适的K值范围是0.5～2，当K＞＞2时，会使分离时间延长，峰展宽现象严重，目标化合物的纯度降低；当K＜＜0.5时，目标化合物与杂质峰重叠无法分离。分离因子α应在1.5～2之间为好。另外，溶剂系统的乳化现象会将固定相带出，因此其分层时间应小于30s。
本实验中，根据文献和前期的经验，选取以下几种溶剂系统：正己烷-正丁醇-水(含3％乙酸)，氯仿-甲醇-正丁醇-水(含3％乙酸)，乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水(含3％乙酸)，乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)，通过测定分配系数K和分层时间来进行筛选。再根据实验结果调节其配比系数比来优化溶剂系统。结果发现，由于油茶籽粕粗提物的茶皂素的含量很高，而茶皂素是一种很强的表面活性剂，会造成严重的乳化，因此在溶剂体系中加入少量乙酸来改善乳化现象。4种溶剂体系的分配系数及分离因子列于表8。
表8不同溶剂体系的分配系数、分离因子和分层时间
实验结果：从表8可知，以正己烷-正丁醇-水(含3％乙酸)作溶剂系统时，分配系数K太小，会使各色谱峰及杂质峰拥挤在一起；以氯仿-甲醇-正丁醇-水(含3％乙酸)作溶剂系统时，分配系数K太大，峰展宽严重，会降低目标产物的纯度。乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水(含3％乙酸)体系的分配系数合理，但两个分配系数较接近导致分离因子不符合最优值。当以乙酸乙酯-正丁醇-水(1:3:4、1:4:4，V/V，含3％乙酸)为溶剂系统时，分配系数K、分离因子α及沉降时间均为最优值，有利于HSCCC的分离。综上所述，本实验选择HSCCC溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)。
实施例8乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)溶剂配比的选择
为了进一步确认乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)溶剂系统最合适的配比，对乙酸乙酯：正丁醇：水(含3％乙酸)分别为1：4：4，1：3：4，1：2：4的溶剂体系，在流速为3ml/min，转速为800r/min，设定检测波长为405nm，进样量100mg的条件下进行了实际上机实验，如图1、2、3所示；同时，作为对照，也在同样的条件下对正乙烷：正丁醇：水(含3％乙酸)为(3：4：7)进行了实验，如图4所示。
由实际上机实验可知，当以乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)为1:3:4(V/V)为溶剂系统时，HSCCC的固定相保留率为31％；而乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)为1:4:4(V/V)时，固定相保留率为46％。且由图1、2、3可以看出，以乙酸乙酯：正丁醇：水(含3％乙酸)为1：4：4(V/V)为溶剂系统时，色谱图的噪音值较低且分离度更好。
实验结果：从图1、2、3、4可以看出，油茶籽粕粗提物在不同的溶剂系统条件下，分离情况不一样。当溶剂系统为正乙烷-正丁醇-水时，不同的物质几乎不能分开，用乙酸乙酯-正丁醇-水时，图谱中可以看到出现不同的峰尖，当乙酸乙酯:正丁醇:水的体积比为1:2:4时，第一个峰和后面的物质就可分开，随着溶剂系统极性的增大，物质的出峰时间也拉开了距离，当乙酸乙酯：正丁醇：水的体积比为1:4:4时，出现了三个明显的峰尖，再改用其他的溶剂系统时，都不能获得更好的图谱，这表明，要分离的物质的极性是相当大的，需要比较大极性的溶剂系统才能有效的将其分离。因此，确定高速逆流色谱纯化油茶籽粕抑菌物质的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)，其体积比为1:4:4。
实施例9分离物抑菌活性的研究
为了追踪最强抑菌活性物质和确定下一步分离纯化的目标，将在乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％乙酸)(1：4：4)溶剂系统中的流出液分段接收，采用刃天青法进行抑菌活性试验，有出峰的跟没出峰的分别接收。下表是溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水所得各组分的抑菌表。从进样运行到第一个峰出现的样品收集命名为NL1，从开始出峰到所有峰出完收集的样品命名为NL2，峰后的所有样品收集命名为NL3，用刃天青法对其抑菌活性进行检测。得到其抑菌活性如表9。
实验结果：NL2组分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的最低抑菌浓度最小，说明其抑菌活性是最强的。
表9乙酸乙酯-正丁醇-水系统不同分离组分的抑菌活性(X±SD，n＝3)
实施例10高速逆流色谱条件的优化
为了将NL2组分中的物质进一步分开，对HSCCC操作条件进行了优化。影响HSCCC分离效果的因素主要有流动相流速、主机转速及进样量等，而柱温对分离时间及分离度的影响均不显著。
通过选择实验，在乙酸乙酯：正丁醇：水体积比为1：4：4溶剂系统中，当流速为3mL/min时，且转速为800r/min时峰没有完全分开，如图4所示；当流速为1.7mL/min，转速为850r/min时，活性最强的组分分离出3个完整的峰，如图5所示，表明降低流速，提高转速可以有效的延迟样品的出峰时间；为了进一步的完全分开三个峰的距离，便于提高样品收集的纯度，将逆流色谱的流整降低为1.5mL/min，保持转速为850r/min，这时第三个峰完全出完的时间由150min延长到280min，如图6所示，有利于样品的分离。且通过多次试验，表明低转速会导致固定相的损失，降低固定相保留率，不利于目标物的分离。当流速为1.5mL/min、转速为850r/min时，3个峰完全分开，固定相保留率为40％。
实验结果：通过反复实验验证，得到HSCCC最佳操作条件：流动相流速1.5mL/min、固体转速850r/min、进样量500mg、进样液3mL。分别收集三个峰对应的组分，浓缩冻干物分别命名为F1，F2，F3；其中，F2为50g。
实施例11HPLC验证F1、F2、F3纯度
为了验证F1、F2、F3的纯度，采用HPLC对NL2，F1，F2，F3进行检测。为了确定HPLC的检测波长，对收集的三个组分F1、F2、F3进行全波长(200-800nm)扫描，如图7，其最长吸收波长均在210nm。为了摸索三个组分F1，F2，F3的极性，对NL2组分进行了胿胶薄层层析，见图8，其中1是NL2，2是F1，3是F2，4是F3。HPLC操作条件为：色谱柱选用C18色谱柱柱，洗脱液为40％的甲醇，进样量20μl，色谱检测波长为210nm，NL2、F1、F2、F3的分析液相图分别如图9-12所示。
实验结果：F1组分中含有的物质极性很强，40％的甲醇溶液不易洗脱，直到用90％的甲醇浓度都不能很好的分离；F2组分是极性中等的物质，其纯度为98.5％，几乎是很纯的单体物质；F3组分亦是中等极性物质，纯度为85％。
实施例12分离物抑菌活性的研究
为了继续追踪最强抑菌活性物质，采用刃天青法对F1、F2、F3进行抑菌活性试验，得到其抑菌活性如表10。
实验结果：第一个峰F1的最低抑菌浓度比NL2要高，F2及F3的最低抑菌浓度均比NL2要低，因此，F2，F3的抑菌活性是比较强的。
表10NL2组分中分离的不同组分的抑菌活性表(X±SD，n＝3)
注：“－”表示无明显抑菌效果
将分离得到的化合物F2进行表征，其核磁氢谱图如图13所示，质谱图如图14所示，所述的化合物F1的分子式为C33H40O20，名称为山奈酚3-O-{β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-葡萄糖甙}，其结构式如下：
为了继续追踪最强抑菌活性物质，将F3采用高效液相色谱(HPLC)进一步分离，HPLC操作条件：谱柱选用C18色谱柱，流动相选用30％的甲醇溶液，检测波长为210nm，流速10mL/min，进样量为50μL，样品浓度15mg/mL；冷冻干燥后得到J1、J2；其中，J2为48g。
采用刃天青法进行抑菌活性进行检测，采用大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、黑曲霉作为供试菌，最低抑菌浓度如表11所示。
实验结果：经HPLC检测所得产品J2的纯度为98.7％，J1的含量不仅极低，且其抑菌活性不如J2，亦不如F2。
表11组分F3及其分离物的抑菌活性(X±SD，n＝3)
将分离得到的化合物J2进行表征，其核磁氢谱图如图15所示，质谱图如图16所示，化合物J2名称为山奈酚3-O-{β-D-吡喃木糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-葡萄糖甙，其结构式如下：

Claims (10)

1.一种高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)油茶粗提物的制备：连续相变萃取茶粉原料，获得油茶粗提物；
(2)高速逆流色谱法分离：采用含1-10％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液作为两相溶剂体系，在流速1.0～3.0mL/min，主机转速500～900r/min，进样量100mg～600mg的条件下，将步骤(1)制得的油茶粗提物进行高速逆流色谱法分离，并根据峰形分段收集流出液，获得油茶中的抑菌物质；其中，所述含1-10％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液中，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为1：2～4：4。
2.如权利要求1所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法，其特征在于，步骤(1)所述的连续相变萃取茶粉原料，获得油茶粗提物的步骤包括：将茶粉原料装入萃取釜中，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，将萃取剂压缩为液体，在萃取温度50-90℃，萃取压力0.3-0.7MPa的条件下，流经萃取釜，连续萃取1-5h，所得萃取物流经解析釜，获得油茶粗提物。
3.如权利要求1所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法，其特征在于，步骤(1)所述的连续相变萃取茶粉原料，获得油茶粗提物的步骤包括：将茶粉原料装入萃取釜中，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，将萃取剂压缩为液体，在萃取温度50-90℃，萃取压力0.3-0.7MPa的条件下，流经萃取釜，连续萃取1-5h，所得萃取物流经解析釜，获得初级油茶粗提物；然后依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对获得的初级油茶粗提物进一步萃取提纯，得到油茶粗提物。
4.如权利要求1所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含1-10％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液中，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为1：4：4、1：3：4或1：2：4。
5.如权利要求1所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述流速为1.5～3.0mL/min，主机转速为800～850r/min，进样量为100～500mg。
6.如权利要求1所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述流速为1.5～1.7mL/min，主机转速为800～850r/min，进样量为100～500mg。
7.如权利要求1所述的高速逆流色谱油茶中抑菌物质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述流速为1.5～1.7mL/min，主机转速为850r/min，进样量为500mg。
8.一种油茶抑菌提取物，其特征在于，所述油茶抑菌提取物为采用如权利要求1-7任一项所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法所提取。
9.一种油茶抑菌化合物，其特征在于，结构式如下：
其中，R为
10.一种如权利要求1-7任一项所述的高速逆流色谱提取油茶中抑菌物质的方法、如权利要求8所述的油茶抑菌提取物、如权利要求9所述的油茶抑菌化合物在制备抑菌剂中的应用。
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