CN114989152B - 铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法，所述方法包括：以铁皮石斛叶为原料，经过超声提取、液液萃取、液液色谱分离，得到芹菜素‑6‑C‑β‑D‑吡喃葡萄糖‑8‑C‑β‑D‑木糖苷和芹菜素‑6‑C‑β‑D‑木糖‑8‑C‑α‑L‑阿拉伯糖苷；本发明操作简便，高效快捷，溶剂消耗少，所得样品纯度高，且分离过程中样品回收率高。
Description
技术领域
本发明涉及铁皮石斛叶中分离制备芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷和芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷的方法。
背景技术
芹菜素(Apigenin)，是一种天然的类黄酮化合物，一种天然抗氧化剂，有降血压和舒张血管、预防动脉粥样硬化、抑制肿瘤等作用。研究发现它通过在G2/M阶段阻止细胞周期来抑制细胞增殖。芹菜素可溶于二甲基亚砜(DMSO)及稀KOH溶液等，但难溶于水，限制了其广泛应用。但它可与其他糖基相连接，因而表现多种生物学活性和药理作用。
铁皮石斛叶是生产铁皮石斛鲜条(枫斗)的副产品。铁皮石斛叶的生物量大，产量仅次于茎，每年可达上千吨，但是由于缺乏针对其化学成分与药理功效的系统研究，对其功能价值认识不足，每年会造成大量铁皮石斛叶浪费。
芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷(Vicenin-3，化合物1)和芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(Apigenin-6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside，化合物2)为铁皮石斛叶中含量较高的两种化合物，结构十分相似，不易分离，结构式如下。糖基的连接使得芹菜素的脂溶性降低，能够有效地提高生物利用度和药效挥发，因此具有非常广阔的应用前景。
研究发现，由于这两个化合的结构相似，因此其在液相色谱的硅胶柱上很难分离，峰形有部分重叠。液液色谱(Countercurrent Chromatography)，是一种连续的不需要固体载体的现代色谱分离技术，结合液-固相色谱选择性和液-液萃取载样能力，充分发挥混合动力学的优势，大大提高了制备性分离性能，相比高效液相色谱而言，进样量大，溶剂体系组成多样化，避免了不可逆吸附和变性，解决固体固定相构象限制和非特异性相互作用等问题，生产成本低，是分离纯化同分异构体的一种理想的制备色谱技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用液液色谱从铁皮石斛叶中分离制备芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷和芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷的方法，利用天然产物中各组分的分配行为差异从而快速分离纯化这两种化合物，具有更强的目的性，快捷高效，工艺简单。
本发明的技术方案如下：
一种铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法，包括以下步骤：
(1)原料铁皮石斛叶烘干后粉碎，用70％(v/v)甲醇的水溶液超声提取，得到甲醇粗提物；
具体的，所述超声提取的方法为：将粉碎后的铁皮石斛叶用其10～20倍干重的70％甲醇的水溶液超声提取，提取温度25～35℃，提取时间1h，趁热过滤，滤渣重复提取1～3次，合并提取液，真空回收溶剂得到甲醇粗提物；
(2)甲醇粗提物用纯水溶解，用石油醚萃取，弃去上相石油醚萃取液，下相用乙酸乙酯萃取，弃去上相乙酸乙酯萃取液，下相用正丁醇萃取，将正丁醇萃取液真空回收溶剂，得到正丁醇萃取物；
(3)在分液漏斗中加入水、正丁醇和乙酸乙酯，组成混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相作为液液色谱的固定相，下相作为流动相；
所述混合溶剂体系中，水、正丁醇和乙酸乙酯的体积份数分别为4～6份、2～4份、1～3份，优选分别为5份、3份、2份；
(4)取步骤(2)所得正丁醇萃取物用步骤(3)所述固定相和流动相溶解，得到样品溶液；
所述固定相和流动相的体积相等，两者合计用量以铁皮石斛叶正丁醇萃取物样品的质量计为0.10～0.14mL/mg；
(5)取固定相注满液液色谱仪的分离柱，开启速度控制器，使分离柱正转，在500～1000r/min转速下，以0.5～5mL/min的流速注入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时将样品溶液由进样阀注入分离柱，波长210～280nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，收集得到的洗脱液通过高效液相进行检测，分别合并与芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷标准品、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷标准品保留时间相同的洗脱液，减压蒸除溶剂，得到芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷；
所述样品溶液的进样体积通常小于分离柱柱体积的30％，优选进样体积为分离柱柱体积的5～10％；
在用高效液相色谱检测洗脱液中的目标物质时，检测条件为：H&E SP ODS-A C18column(250×4.6mm,5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-水(B)溶液，梯度洗脱模式：0～6min，25％～30％A；6～25min，30％～45％A；25～40min，45％～60％A；流速：1mL/min；检测波长：340nm；进样量：20μL。
本发明的有益效果在于：
本发明分离纯化过程的条件温和、操作简便、分离过程高效快捷、溶剂消耗少、分离制备量大、样品无损失；第一步液液萃取分离除去小极性组分，纯化得到高纯度的两种芹菜素混合样品，第二步液液色谱，两相溶剂对两种化合物的分离目的性强，分离效果明显优于传统分离方法，具有很高的经济效益。
附图说明
图1：实施例1的液液色谱(CCC)图。
图2：实施例2的液液色谱(CCC)图。
图1～图2中，1号峰代表芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷，2号峰代表芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷。
图3：芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷和芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷标准品混合物的高效液相(HPLC)图。
图4：图1～图2中1号峰的高效液相(HPLC)图。
图5：图1～图2中2号峰的高效液相(HPLC)图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例中采用制备型液液色谱仪(分离柱柱体积为190mL、300mL)，液液色谱仪分离系统由恒流泵、紫外检测器、记录仪等组成。
实施例1：
取50g干燥的铁皮石斛叶，经粉碎后，采用1000mL的70％甲醇溶液经超声波提取3次，超声波提取工作时间1h，合并提取液，提取液趁热过滤、真空回收溶剂得到甲醇粗提物5.6g；取1g甲醇粗提物溶于100mL纯水中，用100mL的石油醚萃取，重复三次。弃去石油醚萃取物，下相用100mL乙酸乙酯萃取，重复三次。弃去乙酸乙酯萃取物，下相用100mL正丁醇萃取，重复三次。将正丁醇萃取液合并，真空回收溶剂得到正丁醇萃取物662.5mg。
液液色谱，配制水、正丁醇和乙酸乙酯按照体积比5：3：2于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相流动相；称取正丁醇萃取物40mg，用5mL固定相和流动相体积比1:1的混合液溶解，得到样品溶液；
采用制备型液液色谱仪对铁皮石斛叶样品进行分离，分离柱的柱体积为190mL。首先将固定相以10mL/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为800r/min，设置流动相的流速为2mL/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器3分钟/管的速度接收洗脱液，用液相色谱(流动相为甲醇和水)跟踪检测至洗脱液中无化合物1和2组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过高效液相进行检测，合并与化合物1和2的标准品保留时间(26.10min、26.56min)相同洗脱液，洗脱液减压蒸去溶剂得到芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷2.97mg和芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷2.56mg。其中芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷的纯度为93.57％，芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷的纯度为98.38％。
高效液相色谱的检测条件为：H&E SP ODS-A C18 column(250×4.6mm,5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-水(B)溶液，梯度洗脱模式(0～6min，25％～30％A；6～25min，30％～45％A；25～40min，45％～60％A)，流速：1mL/min；检测波长：340nm；进样量：20μL。
实施例2：
铁皮石斛叶正丁醇萃取物的制备与实施例1相同。
液液色谱，配制水、正丁醇和乙酸乙酯按照体积比5：3：2于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相流动相；称取实施例1所述铁皮石斛叶正丁醇萃取物80mg，用10mL固定相和流动相体积比1:1的混合液溶解，得到样品溶液；
采用制备型液液色谱仪对枇杷叶样品进行分离，分离柱的柱体积为300mL。首先将固定相以20mL/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为850r/min，设置流动相的流速为3mL/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器3分钟/管的速度接收洗脱液，用液相色谱(流动相为甲醇和水)跟踪检测至洗脱液中无化合物1和2组分，停止收集。收集得到的洗脱液通过高效液相进行检测，合并与化合物1和2的标准品保留时间(26.10min、26.56min)相同洗脱液，洗脱液减压蒸去溶剂得到芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷7.87mg和芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷8.32mg。其中芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷的纯度为91.30％，芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷的纯度为97.46％
高效液相色谱的检测条件为H&E SP ODS-A C18 column(250×4.6mm,5μm)；柱温30℃；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-水(B)溶液，梯度洗脱模式(0～6min，25％～30％A；6～25min，30％～45％A；25～40min，45％～60％A)，流速：1mL/min；检测波长：340nm；进样量：20μL。
对比例：
中国专利CN106543248 A，吴磊等报道了以高速逆流色谱分离纯化莲子心中黄酮苷类化合物的方法，得到芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-葡萄糖苷；中国专利CN112457261 A，王跃虎等报道了一种从铁皮石斛叶中制备生物碱的方法，包括萃取、硅胶与凝胶柱层析等步骤。
未曾有专利对铁皮石斛叶中的芹菜素糖苷进行分离制备的方法。本方法应用液液色谱分离，可以实现完全回收样品以及试剂，得到的芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷和芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷纯度高，操作步骤少，操作简单，试剂温和，成本低。
Claims (5)
1.一种铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)原料铁皮石斛叶烘干后粉碎，用70％甲醇的水溶液超声提取，得到甲醇粗提物；
(2)甲醇粗提物用纯水溶解，用石油醚萃取，弃去上相石油醚萃取液，下相用乙酸乙酯萃取，弃去上相乙酸乙酯萃取液，下相用正丁醇萃取，将正丁醇萃取液真空回收溶剂，得到正丁醇萃取物；
(3)在分液漏斗中加入水、正丁醇和乙酸乙酯，组成混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相作为液液色谱的固定相，下相作为流动相；
所述混合溶剂体系中，水、正丁醇和乙酸乙酯的体积份数分别为5份、3份、2份；
(4)取步骤(2)所得正丁醇萃取物用步骤(3)所述固定相和流动相溶解，得到样品溶液；
(5)取固定相注满液液色谱仪的分离柱，开启速度控制器，使分离柱正转，在500～1000r/min转速下，以0.5～5mL/min的流速注入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时将样品溶液由进样阀注入分离柱，波长210～280nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，收集得到的洗脱液通过高效液相进行检测，分别合并与芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷标准品、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷标准品保留时间相同的洗脱液，减压蒸除溶剂，得到芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷。
2.如权利要求1所述的铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声提取的方法为：将粉碎后的铁皮石斛叶用其10～20倍干重的70％甲醇的水溶液超声提取，提取温度25～35℃，提取时间1h，趁热过滤，滤渣重复提取1～3次，合并提取液，真空回收溶剂得到甲醇粗提物。
3.如权利要求1所述的铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述固定相和流动相的体积相等，两者合计用量以铁皮石斛叶正丁醇萃取物样品的质量计为0.10～0.14mL/mg。
4.如权利要求1所述的铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述样品溶液的进样体积小于分离柱柱体积的30％。
5.如权利要求1所述的铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法，其特征在于，步骤(5)中，在用高效液相色谱检测洗脱液中的目标物质时，检测条件为：H&E SP ODS-A C18column；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-水(B)溶液，梯度洗脱模式：0～6min，25％～30％A；6～25min，30％～45％A；25～40min，45％～60％A；流速：1mL/min；检测波长：340nm；进样量：20μL。
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| 周桂芬等. 铁皮石斛叶中黄酮碳苷类成分的高效液相指纹图谱及指标成分的含量测定.中国药学杂志.2012,第47卷(第11期),889-893. * |
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