CN111718356B - 一种分离制备墨旱莲单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药有效成分的高效制备技术领域，具体涉及一种分离制备墨旱莲单体的方法，尤其是一种高速逆流色谱分离纯化墨旱莲中香豆草醚类单体的方法，该方法主要是将粉碎后墨旱莲药材采用甲醇超高压提取后，再采用高速逆流色谱方法对其中的香豆草醚类单体进行分离纯化。本发明方法克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点，本方法效率高，操作简单，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。

Description

一种分离制备墨旱莲单体的方法

技术领域

本发明属于中药有效成分的高效制备技术领域，具体涉及一种分离制备墨旱莲单体的方法，尤其是一种高速逆流色谱分离纯化墨旱莲中香豆草醚类单体的方法。

背景技术

墨旱莲，墨旱莲为菊科植物鳢肠(Eclipta prostrataL.)的干燥地上部分，分布于全国大部分地区。墨旱莲味甘、酸，性寒。归肾、肝经。具有滋补肝肾，凉血止血的功效。用于肝肾阴虚，牙齿松动，须发早白，眩晕耳鸣，腰膝酸软，阴虚血热吐血、衄血、尿血，血痢，崩漏下血，外伤出血等。研究发现墨旱莲具有多种药理作用，如止血，调节免疫，保肝抗炎，抗肿瘤，抗纤维化，抗骨质疏松，抗氧化等。就制剂而言，国内的墨旱莲类药物主要为复方制剂，墨旱莲的单方制剂如片剂、外用软膏未见于国内外市场。临床多用于外伤出血、蛇毒咬伤、须发早白、牙齿松动等症，是一种具有广泛开发前景的植物药。

目前从墨旱莲中分离到的主要化学成分为三萜皂苷类、黄酮类、香豆草醚类、噻吩类和甾体生物碱类等化合物，其中香豆草醚类成分为其抗炎、抗肿瘤作用的有效成分。目前文献报道，墨旱莲中该类活性成分的分离纯化方法为柱层析，如硅胶柱层析法。该方法不足之处是：分离周期长，回收率低，分离效果不理想，在使用硅胶柱层析分离时因长时间与硅胶填料接触而致使该类成分结构发生变化。

高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相的分离方法，是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术。它早起源于20世纪50年代的逆流分溶法(CCD)，但由于其设备庞大复杂、易碎，容积体系容易乳化等而被一种新的液-液分配方法-“逆流色谱”代替。20世纪70～80年代，美国国立卫生院的Ito博士研制出了早期的逆流色谱仪器，包括螺旋管行星式离心分离仪(CPC)、螺旋形逆流色谱仪、流通型螺旋管行星式离心分离仪、连续洗脱型离心分离仪等。高速逆流色谱是逆流色谱技术历了近60年发展的结果，不用固体支撑体作固定相，避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅可全部回收样品，而且样品的制备量大大提高，是一种适用于中药和天然产物研究的现代化仪器，具有适用范围广、制备量大、操作简单、高效快速等优点，在生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高速逆流色谱分离纯化墨旱莲中香豆草醚类单体的方法，从而克服现有技术的不足，提供一种操作简单，产品纯度高，样品损失量小的高效快速方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种高速逆流色谱分离纯化墨旱莲中香豆草醚类单体的方法，步骤如下：

(1)墨旱莲粗提物的制备：取墨旱莲药材，粉碎，采用甲醇溶液超高压提取，减压旋蒸，冷冻干燥，得到墨旱莲粗提物；

(2)将步骤(1)获得的墨旱莲粗提物采用水溶解，采用乙酸乙酯萃取，萃取液过滤，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取段；

(3)香豆草醚类单体的分离：采用高速逆流色谱方法对步骤(2)中的乙酸乙酯萃取段进行香豆草醚类化合物的分离纯化；其中，溶剂系统组成为：按照体积比，石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水＝3～4:6～8:4～6:4～6，转速为700～900rpm，流速为1～2mL/min。对乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得异去甲蟛蜞菊内酯和蟛蜞菊内酯。

步骤(1)中，墨旱莲的预处理对后续香豆草醚类化合物的提取分离比较重要，墨旱莲采用甲醇超高压提取，相比于其他溶剂的提取，能够使得墨旱莲中香豆草醚类单体最大程度的提取出来。

从分离效果来讲，优选的，甲醇溶液的质量浓度为80～100％，采用超高压提取方法，压力为100-300Mpa，固液比为1：10～30，固液比的单位采用g/mL或者kg/L，提取次数1～2次，时间分别为3～9min，减压旋蒸，冷冻干燥，得墨旱莲粗提物。甲醇溶液是指甲醇与水的混合液。

根据本发明的一个优选的实施方式，采用质量浓度为80％甲醇溶液超高压提取，固液比为1:20，提取1次，时间为3min，减压旋蒸，冷冻干燥，得墨旱莲粗提物。

步骤(2)中，选择乙酸乙酯进行萃取，可进一步将步骤(1)中的醇提物进行极性粗分，将此2种香豆草醚类成分进行富集，相比于其他溶剂的萃取，可使此2种成分最大限度集中。该萃取溶剂比较重要，是保证HSCCC能够有效分离2种香豆草醚类化合物的前提条件。

步骤(3)中，溶剂系统的配置过程为：按各溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡设定时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相。

为了减少进样时固定相的损失，将步骤(2)中的乙酸乙酯萃取段溶解于上相和下相备用，进一步的，乙酸乙酯萃取段溶解于体积比为1：1的上相和下相的混合液中备用；所述乙酸乙酯萃取段与混合液的用量关系为：(0.3～0.5)g/10mL。

溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。到目前为止溶剂系统的选择还没有充分的、较完整的和具有指导意义的理论体系，而是根据实际积累的丰富经验来选择。本发明针对墨旱莲中的香豆草醚类单体的分离，经过大量的实验分析和验证，对不同的溶剂系统进行选择，得到了石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的溶剂系统以及精确了各个溶剂的比例，得到石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水的体积比＝3:7:5:5时，各个香豆草醚类单体的分离效果最好。若是采用其他溶剂系统，比如将石油醚替换为正己烷，或者其他配比量的溶剂系统会导致这两种香豆草醚类单体不能完全分开。

优选的，紫外检测波长为254nm。

优选的，上样量为0.3～0.5g，进一步优选的为0.3g。

由于高速逆流色谱是无需任何固态载体支撑的液液色谱，其中，作为固定相的液体在色谱柱中的保留程度对于高速色谱的分离过程是十分重要的。优选的，固相保留率为50～60％，进一步优选的，固相保留率为53％。

在流动相流速方面，流动相流速快不利于固定相的保留，且出峰时间太快会导致峰与峰间的分离度较差，而低流速虽然可以满足提高固定相保留率的要求，但是分离洗脱时间太长，且峰形变宽，耗费大量的流动相，故选择合适的流速对整个分离体系非常重要。本发明经过大量的实验分析和验证，选择流动相流速为1～3mL/min。优选的为1.5mL/min。

分离柱的转速以及它产生的离心力场对两相的混合程度具有决定性的影响，本发明选择了较高的转速，为700～900rpm，以使固定相和流动相之间能够剧烈的混合，从而促进分配和减少质点传递的阻力。为了达到更好的分离效果，优选的转速为800rpm。

本发明确定了高速逆流色谱方法对墨旱莲香豆草醚类单体的最佳分离条件：溶剂系统为石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水的体积比例＝3:7:5:5，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.3g，分离柱转速为800rpm，流动相流速1.5mL/min，固定相保留率53％，紫外检测波长254nm。

上述技术方案具有如下有益效果：

(1)墨旱莲粗取物分离后各馏分经HPLC进行纯度检测，可得到95％以上的纯品异去甲蟛蜞菊内酯和蟛蜞菊内酯，该方法适用于从墨旱莲中一步纯化制备出高纯度的香豆草醚类成分异去甲蟛蜞菊内酯和蟛蜞菊内酯。

(2)为了较好的分离墨旱莲香豆草醚类化合物，本发明筛选优化得到一套针对墨旱莲原料分离香豆草醚类化合物的工艺参数，采用本发明筛选优化后的工艺参数，能够分离得到纯度较高的香豆草醚类化合物。

(3)本发明方法克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点。本方法效率高，操作简单，稳定性好，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。

附图说明

图1为墨旱莲乙酸乙酯粗提物的高效液相色谱图；

图2为高速逆流色谱分离纯化墨旱莲的色谱图；

图3为分离纯化得到蟛蜞菊内酯的高效液相色谱图；

图4为分离纯化得到异去甲蟛蜞菊内酯的高效液相色谱图；

图5为异去甲蟛蜞菊内酯单体的结构式；

图6为蟛蜞菊内酯单体的结构式。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例1

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

取墨旱莲药材，粉碎至40-60目，80％甲醇超高压提取，压力为300Mpa，固液比为1:20，提取1次，时间为3min，减压旋蒸，冷冻干燥，得墨旱莲粗提物；将墨旱莲粗提物用水打散，用乙酸乙酯萃取，萃取液过滤，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取段，乙酸乙酯萃取部位的HPLC分析图，如图1所示。

应用高速逆流色谱对所得墨旱莲乙酸乙酯部位进行香豆草醚类化合物的分离纯化：

采用石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水＝3:7:5:5为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.3g，分离柱转速为800rpm，流速1.5mL/min，固定相保留率53％，检测波长254nm。对墨旱莲乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得相应高纯度化合物，如图2所示，A为第一个峰保留时间对应的流出液，为异去甲蟛蜞菊内酯；B为第二个峰保留时间对应的流出液：为蟛蜞菊内酯。

具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.3g墨旱莲乙酸乙酯萃取段，溶解于5mL上相和5mL下相中待用。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为1.5mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，不停泵，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图(图2)接收目标成分，得异去甲蟛蜞菊内酯(6.8mg，图3)，蟛蜞菊内酯(23.5mg，图4)，HPLC分析纯度均为95％以上。

利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters

C18柱(250mm×4.6mmi.d.,5μm)，紫外检测波长351nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0–10min，20％B；10–40min，20–60％B；40–45min，60–100％B；45–60min，100％B。

结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行NMR谱的测定，所得数据如下，结构式见图6：

异去甲蟛蜞菊内酯(A):1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):7.25(1H,s),7.17(1H,s),6.62(1H,d,J＝2.0Hz),6.47(1H,d,J＝2.0Hz).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ(ppm):161.3(C-6),159.5(C-3),157.9(C-1),155.4(C-8),155.4(C-9),148.6(C-15),145.2(C-11),144.3(C-12),113.8(C-14),104.5(C-10),100.7(C-2),99.2(C-5),98.9(C-13),95.3(C-4),94.7(C-7).

蟛蜞菊内酯(B):1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):7.21(1H,s),7.15(1H,s),6.41(1H,s),6.34(1H,s).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ(ppm):162.7(C-7),159.5(C-1),158.2(C-9),155.8(C-3),155.6(C-5),149.3(C-15),145.9(C-11),144.8(C-12),114.2(C-14),105.0(C-10),102.1(C-2),99.3(C-13),98.6(C-8),97.2(C-4),93.6(C-6),56.2(C-16).

实施例2

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

取墨旱莲药材，粉碎至40-60目，90％甲醇超高压提取，压力为200Mpa，固液比为1:10，提取2次，每次时间为5min，减压旋蒸，冷冻干燥，得墨旱莲粗提物；将墨旱莲粗提物用水打散，用乙酸乙酯萃取，萃取液过滤，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取段。

应用高速逆流色谱对所得墨旱莲乙酸乙酯部位进行香豆草醚类化合物的分离纯化：

采用石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水＝4:8:4:6为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.5g，分离柱转速为900rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率60％，检测波长254nm。对墨旱莲乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得相应高纯度化合物。

具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.5g墨旱莲乙酸乙酯萃取段，溶解于5mL上相和5mL下相中待用。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达900rpm时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，不停泵，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得异去甲蟛蜞菊内酯(6.6mg)，蟛蜞菊内酯(23.6mg)，HPLC分析纯度均为95％以上。

利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters

C18柱(250mm×4.6mmi.d.,5μm)，紫外检测波长351nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0–10min，20％B；10–40min，20–60％B；40–45min，60–100％B；45–60min，100％B。

结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行NMR谱的测定，所得数据如实施例1，结构式见图6。

实施例3

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

取墨旱莲药材，粉碎至40-60目，甲醇超高压提取，压力为100Mpa，固液比为1:30，提取1次，时间为9min，减压旋蒸，冷冻干燥，得墨旱莲粗提物；将墨旱莲粗提物用水打散，用乙酸乙酯萃取，萃取液过滤，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取段。

应用高速逆流色谱对所得墨旱莲乙酸乙酯部位进行香豆草醚类化合物的分离纯化：

采用石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水＝3.5:6:6:4为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.4g，分离柱转速为700rpm，流速1.0mL/min，固定相保留率55％，检测波长254nm。对墨旱莲乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得相应高纯度化合物。

具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.4g墨旱莲乙酸乙酯萃取段，溶解于5mL上相和5mL下相中待用。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达700rpm时，设置流动相流速为1.0mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，不停泵，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得异去甲蟛蜞菊内酯(6.7mg)，蟛蜞菊内酯(23.6mg)，HPLC分析纯度均为95％以上。

利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters

C18柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm)，紫外检测波长351nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0–10min，20％B；10–40min，20–60％B；40–45min，60–100％B；45–60min，100％B。

结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行NMR谱的测定，所得数据如实施例1，结构式见图6。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (1)

1.一种高速逆流色谱分离纯化墨旱莲中香豆草醚类单体的方法，其特征是，步骤如下：

取墨旱莲药材，粉碎至40-60目，80％甲醇超高压提取，压力为300Mpa，固液比为1:20，提取1次，时间为3min，减压旋蒸，冷冻干燥，得墨旱莲粗提物；

将墨旱莲粗提物用水打散，用乙酸乙酯萃取，萃取液过滤，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取段；

应用高速逆流色谱对所得墨旱莲乙酸乙酯部位进行香豆草醚类化合物的分离纯化：采用石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水＝3:7:5:5为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.3g，分离柱转速为800rpm，流速1.5mL/min，固定相保留率53％，检测波长254nm；对墨旱莲乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得相应高纯度化合物；

具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.3g墨旱莲乙酸乙酯萃取段，溶解于5mL上相和5mL下相中待用；采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，首先将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为1.5mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，不停泵，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得异去甲蟛蜞菊内酯和蟛蜞菊内酯。

Images