CN102234305A - 一种制备高纯度白头翁皂苷b4的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备高纯度白头翁皂苷B₄的方法，属于天然药物领域。方法包括：(1)制备上相固定相、下相流动相的溶剂体系；(2)使色谱仪柱子中充满固定相，调整主机转速，将流动相泵入柱内；(3)由进样阀进样，根据检测器紫外图谱接收目标成分，将流分进行浓缩结晶，得到高纯度白头翁皂苷B₄单体。本发明制得的白头翁皂苷B₄能够达到较高的纯度，且制备方法简单、效率高、成本低、易于重复、分离制备量大。

Description

一种制备高纯度白头翁皂苷B₄的方法

技术领域：

本发明涉及中药有效成分的分离纯化方法，具体地说，涉及一种制备高纯度白头翁皂苷B₄的方法。

背景技术：

白头翁为多年生草本植物白头翁Pulsatilla Chinensis(Bge.)Regel.的干燥根，始载于《神农本草经》，列为下品，是常用中药。具有清热解毒、凉血止痢的功效，传统主要用于治疗阿米巴痢疾、细菌性痢疾和阴道滴虫等疾病。现代研究认为白头翁除抗菌和抗原虫作用外，还具有提高机体免疫力、抑制巨噬细胞分泌IL-6、抗癌、抗炎、抗毒、止泻、镇静、镇痛、杀灭滴虫和球虫、抑制肠运动、抗内毒素血症等作用。白头翁的主要化学成分为皂苷和内酯类等，多以皂苷类化合物为药效成分，其中白头翁皂苷B₄含量较多，现行2010年版《中国药典》也以B₄作为质量评价的标准。张振华等以白头翁皂苷B₄对照品作为指标对十七种不同产地白头翁进行了质量考察，发现白头翁皂苷B4含量≥5.0％有9种；≤5.0％有8种，其中4种不含该成分属伪品。

白头翁皂苷B₄，英文名Anemoside B₄，别名：Chinensioside A；Pulchinenoside C；Pulchinenoside B₄；CAS RN：129741-57-7，分子式：C₅₉H₉₆O₂₆；分子量：1221.38，结构式如下：

R¹＝β-L-ara-(1→2)-α-L-ara

R²＝α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-(1→6)-β-D-glc

现有文献对白头翁总皂苷的含量测定和提取方法报道较多，但是对单个主要成分报道很少。白头翁皂苷B₄多采用传统色谱柱层析，分离周期长、得率低。在国家知识产权局相关检索和中国期刊网的检索中，未发现采用高速逆流色谱法分离纯化白头翁皂苷B₄的文献。逆流色谱分离方法可达到纯度高、得率高而优于创痛的柱色谱等分离方法。高速逆流色谱技术(HSCCC)是近三十年发展起来的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，其原理是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固体相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。它避免了固态支持或载体带来的各种问题——样品易被吸附、损耗和变性，使用其它液相色谱技术进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大。HSCCC能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损耗、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。HSCCC已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。

发明内容：

本发明的目的是提供一种制备高纯度白头翁皂苷B₄的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。

一种制备高纯度白头翁皂苷B₄的方法，其特征在于它包括(1)制备上相固定相、下相流动相的溶剂体系；(2)使色谱仪柱子中充满固定相，调整主机转速，将流动相泵入柱内；(3)由进样阀进样，根据检测器紫外图谱接收目标成分，将流分进行浓缩结晶，得到高纯度白头翁皂苷B₄单体。

所述的溶剂体系由A、B、C、D四部分组成；A组分为氯仿、乙酸乙酯或乙酸丁酯；B组分为正丁醇、正丙醇或异丙醇；C组分为甲醇、乙醇；D组分为水，四组分体积比2～5∶1.5～4.5∶0.5～2∶5～6。

所述样品为通过大孔树脂、硅胶柱色谱、制备高效液相色谱法或其它现有工艺制备得到的白头翁总皂苷，总皂苷含量为30％-90％。

本发明采用高速逆流色谱仪，配以适宜的溶剂体系对白头翁皂苷进行分离纯化，由于不用固态支撑体，避免了不可逆吸附所造成的损失，提高了回收率。同时克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有制备量大、分离效率高、产品纯度好等优点，易于推广使用。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行说明。

实施例1：

选取氯仿-正丙醇-甲醇-水体系在逆流色谱仪分离纯化白头翁皂苷B₄，先按2∶1.5∶0.5∶5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后，静置，待平衡30min后，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，称取100mg白头翁总皂苷粉末溶于10ml上相和10ml下相中待用。进样前，先用固定相泵入色谱柱中，使充满整个柱子，调整主机转速为900r/min，以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待流动相从出液端流出且两相建立动态平衡后，由进样阀将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在201nm波长处对流出液连续检测，与白头翁皂苷B₄标准图谱进行对比，接收目标成分，得到白头翁皂苷B₄流分，浓缩冻干后进行结晶，得白头翁皂苷B₄，经HPLC测定其纯度达到98％。

实施例2：

选取乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水体系在逆流色谱仪分离纯化白头翁皂苷B₄，先按4∶2∶1∶5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后，静置，待平衡35min后，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，称取100mg白头翁总皂苷粉末溶于10ml上相和10ml下相中待用。进样前，先用固定相泵入色谱柱中，使充满整个柱子，调整主机转速为750r/min，以4.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待流动相从出液端流出且两相建立动态平衡后，由进样阀将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在201nm波长处对流出液连续检测，与白头翁皂苷B₄标准图谱进行对比，接收目标成分，得到白头翁皂苷B₄流分，浓缩冻干后进行结晶，得白头翁皂苷B₄，经HPLC测定其纯度达到98％。

实施例3：

选取乙酸丁酯-异丙醇-乙醇-水体系在逆流色谱仪分离纯化白头翁皂苷B₄，先按2.5∶3.5∶0.5∶6体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后，静置，待平衡40min后，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，称取150mg白头翁总皂苷粉末溶于10ml上相和10ml下相中待用。进样前，先用固定相泵入色谱柱中，使充满整个柱子，调整主机转速为650r/min，以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待流动相从出液端流出且两相建立动态平衡后，由进样阀将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在201nm波长处对流出液连续检测，与白头翁皂苷B₄标准图谱进行对比，接收目标成分，得到白头翁皂苷B₄流分，浓缩冻干后进行结晶，得白头翁皂苷B₄，经HPLC测定其纯度达到98％。

实施例4：

选取乙酸乙酯-正丙醇-乙醇-水体系在逆流色谱仪分离纯化白头翁皂苷B₄，先按5∶4∶1∶5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后，静置，待平衡30min后，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，称取200mg白头翁总皂苷粉末溶于20ml上相和20ml下相中待用。进样前，先用固定相泵入色谱柱中，使充满整个柱子，调整主机转速为850r/min，以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待流动相从出液端流出且两相建立动态平衡后，由进样阀将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在201nm波长处对流出液连续检测，与白头翁皂苷B₄标准图谱进行对比，接收目标成分，得到白头翁皂苷B₄流分，浓缩冻干后进行结晶，得白头翁皂苷B₄，经HPLC测定其纯度达到98％。

实施例5：

选取氯仿-正丁醇-乙醇-水体系在逆流色谱仪分离纯化白头翁皂苷B₄，先按3∶4.5∶2∶6体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后，静置，待平衡45min后，分别取上、下相，将上相作为固定相，下相作为流动相，称取200mg白头翁总皂苷粉末溶于20ml上相和20ml下相中待用。进样前，先用固定相泵入色谱柱中，使充满整个柱子，调整主机转速为950r/min，以5.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待流动相从出液端流出且两相建立动态平衡后，由进样阀将样品溶液注入色谱系统中，同时在出液端接紫外检测器，在201nm波长处对流出液连续检测，与白头翁皂苷B₄标准图谱进行对比，接收目标成分，得到白头翁皂苷B₄流分，浓缩冻干后进行结晶，得白头翁皂苷B₄，经HPLC测定其纯度达到98％。

Claims (2)

1.一种制备高纯度白头翁皂苷B₄的方法，其特征在于它包括(1)制备上相固定相、下相流动相的溶剂体系；(2)使色谱仪柱子中充满固定相，调整主机转速，将流动相泵入柱内；(3)由进样阀进样，根据检测器紫外图谱接收目标成分，将流分进行浓缩结晶，得到高纯度白头翁皂苷B₄单体。

2.根据权利要求1所述的一种制备高纯度白头翁皂苷B₄的方法法，其特征在于所述的溶剂体系由A、B、C、D四部分组成；A组分为氯仿、乙酸乙酯或乙酸丁酯；B组分为正丁醇、正丙醇或异丙醇；C组分为甲醇、乙醇；D组分为水，四组分体积比2～5∶1.5～4.5∶0.5～2∶5～6。