CN111675746A - 科罗索酸及其衍生物在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了科罗索酸及其衍生物在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的应用，本发明对科罗索酸的抗柔嫩艾美耳球虫感染作用进行了细胞水平试验和动物试验，结果表明，科罗索酸具有显著的抑制柔嫩艾美耳球虫的效果，其抗虫指数高达177.5，抗虫效果显著优于常规抗虫药物磺胺氯吡嗪钠和地克珠利。本发明公开的科罗索酸在用于治疗柔嫩艾美耳球虫感染中的新应用，不仅在拓展了科罗索酸的发展与应用的同时，还促进了新的抗球虫药物的开发和利用。

Description

科罗索酸及其衍生物在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及科罗索酸及其衍生物在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的应用。

背景技术

球虫病是由一种或多种艾美耳球虫(Eimeria spp.)感染引起的寄生虫病。目前，球虫病已成为集约化养殖场中最常见、最易发生及危害严重的疾病之一，其发病率高达50％～70％，死亡率为20％～30％，在环境条件差，医疗条件不允许的环境下，其患病率最高可高达80％。球虫病会影响宿主的商品生产性能，如增重率下降，饲料报酬降低，产蛋鸡产蛋下降等。柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)是艾美耳球虫中致病力最强的病原之一，其寄生于鸡盲肠，又称盲肠球虫。患有柔嫩艾美耳球虫病或受柔嫩艾美耳球虫感染的主要病变病症为盲肠肿大、出血和肠道粘膜损伤等。目前，球虫病，尤其是鸡球虫病的防治仍依赖于抗球虫药物的使用，但随着鸡球虫耐药性问题的日益严重，大多数原有抗球虫药物的作用效果明显下降，鸡球虫病成为对家禽肠道有损害的寄生虫病中较难防治的疾病之一，生产实践中迫切需要新的抗球虫药物。

科罗索酸(Corosolic acid)存在于大花紫薇和枇杷叶中。现有的研究发现，科罗索酸具有抑制炎症、调血脂和抗肿瘤的作用。该化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₄，分子量472.7，CAS登录号：4547-24-4。

现有报道中，科罗索酸具有抑制炎症、调血脂和抗肿瘤的效果。但目前没有科罗索酸在抗柔嫩艾美耳球虫作用的报道，通过科罗索酸已知的性质无法推断其是否具有抗柔嫩艾美耳球虫的作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种抗柔嫩艾美耳球虫的化合物；

本发明的另一目的在于提供一种用于抗柔嫩艾美耳球虫的药物组合物；

本发明的另一目的在于提供上述化合物在制备球虫病治疗药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述化合物在预防柔嫩艾美耳球虫感染制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种抗柔嫩艾美耳球虫的化合物，该化合物的结构式为：

其中，R₁选自氢、甲基、卤素、烷基、卤代烷基中的至少一种；

R₂选自氢、甲基、卤素、烷基、卤代烷基中的至少一种；

R₃选自氢、甲基、卤素、烷基、卤代烷基中的至少一种。

进一步地，上述化合物是科罗索酸。

进一步地，上述化合物是科罗索酸的药学上可接受的盐、衍生物、水合物、溶剂合物或多晶型物。

本发明的第二个方面，提供：

一种用于抗柔嫩艾美耳球虫的药物组合物，该药物组合物包括上述的化合物。

进一步地，上述药物组合物的剂型包括注射剂、溶液剂、散剂、片剂、丸剂、乳剂。

本发明的第三个方面，提供：

上述化合物在制备球虫病治疗药物中的应用。

进一步地，上述球虫病为柔嫩艾美耳球虫引起的球虫病。

本发明的第四个方面，提供：

上述化合物在预防柔嫩艾美耳球虫感染制剂中的应用。

进一步地，上述预防柔嫩艾美耳球虫感染制剂的适用对象为鸡。

本发明的有益效果是：

本发明公开了科罗索酸在用于治疗柔嫩艾美耳球虫感染中的新应用，在拓展了科罗索酸的发展与应用的同时，还促进了新的抗球虫药物的开发和利用。本发明对科罗索酸的抗柔嫩艾美耳球虫感染作用进行了细胞水平试验和动物试验，结果表明，科罗索酸具有显著的抑制柔嫩艾美耳球虫的效果，其抗虫指数高达177.5，抗虫效果显著优于常规抗虫药物磺胺氯吡嗪钠和地克珠利。

附图说明

图1为科罗索酸对柔嫩艾美耳球虫繁殖的影响；

图2为磺胺氯吡嗪钠对柔嫩艾美耳球虫繁殖的影响；

图3为地克珠利对柔嫩艾美耳球虫繁殖的影响。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实验材料：

科罗索酸，购自北京百灵威科技有限公司。

对照药物：磺胺氯吡嗪钠，购自Sigma公司；地克珠利，购自北京百灵威科技有限公司。

球虫卵囊：柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)广东株孢子化卵囊，取自广东省农业科学院动物卫生研究所，使用前在无球虫雏鸡体内复壮。

细胞：MDBK细胞，由广东省农业科学院动物卫生研究所保存。

实施例1E.tenella MDBK细胞培养模型中的抗球虫效果评价

以E.tenella MDBK细胞培养模型评价抗球虫效果，具体试验步骤如下：

用0.25％的胰蛋白酶消化液消化生长至融合状态达到80％以上的MDBK细胞，以4×10⁵个/孔的细胞浓度铺板12孔细胞培养板，置于37℃含5％CO₂的培养箱中培养24h。

待12孔培养板的细胞生长至融合状态达80％及以上时，每孔接种10×10⁴个子孢子/ml，4h后弃去培养基，以PBS洗涤3次，洗掉悬浮的子孢子，每孔加入5％胎牛血清的MEM培养基，加入待检测药物，并设置3个重复，同时设置空白对照和阳性对照。置于37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养。

培养48h后弃去培养基，PBS洗涤3次，提取各孔样品的总RNA。

以RT-PCR检测各试验药物对球虫生长发育的影响：

试验分组：各药物组设5个药物浓度(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)梯度。每个浓度设3个重复，每份RNA样品以3个重复进行RT-PCR检测。

Real-time PCR引物：

特异性扩增柔嫩艾美耳球虫actin引物：

EtActin-F:5’-CACCACCGCCGAGAAAGA-3’(SEQ ID NO.1)；

EtActin-R:5’-GAACAACATTGCCGTAGAGG-3’(SEQ ID NO.2)；

特异性扩增宿主细胞actin引物：

Bactin-F:5’-GGATGAGGCTCAGAGCAAGAGA-3’(SEQ ID NO.3)；

Bactin-R:5’-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3’(SEQ ID NO.4)。

以ΔΔC_T方法计算各试验药物对细胞培养水平上球虫生长发育的效果。

Real-time PCR反应体系如下表：

表1 Real-time RT-PCR反应体系(单位：μL)

Real-time PCR反应程序如下：

阶段1：逆转录

次数：1，42℃，5min；

阶段2：预变性

次数：1，95℃，5min；

阶段3：循环反应

次数：40，95℃，10sec；

延伸：60℃，20sec；

阶段4：融解曲线

次数：1，预设值。

评价指标：通过Real-time RT-PCR获得实验组和对照组的ΔC_T

ΔC_T的计算公式为：

ΔC_T＝C_T(Et肌动蛋白)-C_T(H肌动蛋白)

最终获得待筛选药物的抗球虫作用效果的计算式为：

ΔΔC_T＝ΔC_T(试验组)-ΔC_T(对照组)。

实验结果：

本发明中的化合物对柔嫩艾美耳球虫均具有明显的抑制效果，科罗索酸的MIC₅₀值为10.1μM；对照药物磺胺氯吡嗪钠和地克珠利对柔嫩艾美耳球虫具有抑制效果，其MIC₅₀值分别为25.94μM和32.68μM。以上结果表明，科罗索酸具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫作用，且明显优于对照药物磺胺氯吡嗪钠和地克珠利。

实施例2动物实验

实验材料：

科罗索酸散剂型的制备：取10g科罗索酸(含量不低于99％)和90g淀粉混匀。

对照药物：常规抗球虫药物三字球虫粉(30％磺胺氯吡嗪钠)，由上海诺华动物保健有限公司生产；地克珠利，由浙江汇能动物药品有限公司生产。

球虫卵囊：柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)广东株孢子化卵囊，由广东省农业科学院动物卫生研究所保存，使用前在无球虫雏鸡体内复壮。

雏鸡：岭南黄肉鸡，由广东省农业科学院动物科学研究所提供，饲养于已消毒的专用动物房内；鸡笼和所用器皿均严格消毒，自由采食和饮用纯净水；试验前观察雏鸡有无临床症状及连续2天检查粪便有无球虫卵囊，备用。

饲料：由广东省新南都饲料科技有限公司定制育雏料，不含任何抗球虫药物。

实验方法：

分组：按试验分组及处理将150只岭南黄肉鸡饲养至10日龄，逐只称重，淘汰弱雏和体重过大者，将剩余雏鸡随机分成5组，每组30只，并适当调整使每组雏鸡总体重大致相等。

具体试验步骤如下：

除第1组(空白对照)外，其余各组雏鸡均经口灌服柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊l×10⁵个/羽；除第1组和第2组(阳性对照)外，其余各组鸡均于感染后立即饲喂含抗球虫药物的饲料，试验鸡的分组情况及药物的用法用量见表2。

表2实验分组情况

每天观察并记录鸡群的精神状况、采食量、粪便情况等；对死亡雏鸡称重，剖检，若为柔嫩艾美耳球虫感染引起死亡则病变记分为+4分；所有雏鸡于感染后第7天逐只称重，剖检，进行盲肠病变记分；最后计算各组雏鸡的增重和饲料报酬。

药效判定方法及标准抗球虫指数(ACI)按美国默克公司推荐的公式计算：

ACI＝(相对增重率+存活率)－(卵囊值+病变值)；

相对增重率＝(试验组增重÷空白对照组增重)×100％；

存活率＝(各组存活雏鸡数÷各组雏鸡总数)×100％。

病变按五级记分：

①无卵囊，盲肠正常，为0分；

②有卵囊，盲肠黏膜稍增厚，有少量散在出血或少量血样肠内容物，为+1分；

③有卵囊，盲肠黏膜增厚，有明显出血或明显血样肠内容物，为+2分；

④有卵囊，盲肠黏膜增厚，有大量凝血块或血样肠芯，为+3分；

⑤雏鸡因球虫病死亡或有大量卵囊，盲肠外观呈酱油色(或小肠中部有点状坏死灶，黏膜面呈绯红色)，肠管明显肿大，内容物形成明显的血样肠芯，为+4分。

病变值的计算公式为：

病变值＝每组平均病变记分×10；

卵囊值由盲肠内容物克粪便卵囊数(OPG)换算而来。药效判定标准是ACI<120为无效，120～160为弱效，160～180为中效，180以上为强效。

实验结果：

1.临床症状观察：

接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的对照组第2天，病鸡出现精神沉郁，呆立，食欲减退；第5天出现明显血便，并出现死亡，随后血便逐渐减少。

计算各组的抗球虫指数，结果见表3。

表3各组抗球虫指数

由表3可知，第5组的抗球虫指数均高于第3组和第4组，且科罗索酸的抗球虫指数(ACI)可达到175以上，具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫作用，且优于常规抗球虫药物三字球虫粉和地克珠利。

综上所述，本发明中的化合物在具有在制备预防柔嫩艾美耳球虫感染制剂以及球虫病治疗药物中的应用潜力，具有极高的经济价值以及医用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 科罗索酸及其衍生物在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccaccgcc gagaaaga 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaacaacatt gccgtagagg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatgaggct cagagcaaga ga 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgtcccagt tggtgacgat 20

Claims (9)

1.一种抗柔嫩艾美耳球虫的化合物，所述化合物的结构式为：

其中，所述R₁选自氢、甲基、卤素、烷基、卤代烷基中的至少一种；

所述R₂选自氢、甲基、卤素、烷基、卤代烷基中的至少一种；

所述R₃选自氢、甲基、卤素、烷基、卤代烷基中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是科罗索酸。

3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是科罗索酸的药学上可接受的盐、衍生物、水合物、溶剂合物或多晶型物。

4.一种用于抗柔嫩艾美耳球虫的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一所述的化合物。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括注射剂、溶液剂、散剂、片剂、丸剂、乳剂。

6.权利要求1-3任一所述化合物在制备球虫病治疗药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述球虫病为柔嫩艾美耳球虫引起的球虫病。

8.权利要求1-3任一所述化合物在预防柔嫩艾美耳球虫感染制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述预防柔嫩艾美耳球虫感染制剂的适用对象为鸡。

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