CN106554385B - 多肽类化合物及其在畜禽方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多肽类化合物及其在畜禽方面的应用。本发明提供多肽类化合物联合使用作为抗生素的应用，相对于那西肽而言，联合使用的抑菌效果显著增强；本发明提供多肽类化合物作为防治畜禽球虫药物方面的应用，且相对于化学合成的药物，多肽类化合物为大分子物质，动物体内不吸收，无可检测残留，在肉鸡所有组织中均未发现可检测残留，多肽类化合物在动物的排泄物中被降解为小肽类物质，饲喂含有多肽类化合物饲料的肉鸡所排出的分泌物在常温10周后即无可检测残留，分解后的小肽类物质对土壤微生物的活动也没有任何不良影响；本发明提供多肽类化合物作为抗病毒药物方面的应用，所述多肽类化合物在体内对病毒具有显著抑制作用，且反弹较小。

Description

多肽类化合物及其在畜禽方面的应用

技术领域

本发明属于畜禽用药品技术领域，尤其是涉及多肽类化合物及其在畜禽方面的应用。

背景技术

那西肽是一种含硫多肽类抗生素，英文名Nosiheptide。由法国科学家在Streptomyces actuosus 40037发酵液中发现，后由罗纳普朗克公司时行研究和生产，被作为动物抗生素使用，由于初期其产量低，成本太高而未能大规模推广。直到80年代，其生产工艺取得突破后才得以推广。

那西肽在我国1998年被批准为国家三类新兽药，2001年，农业部发文将那西肽列为可在饲料中长时间添加使用的饲料添加剂。2002年，杭州汇能生物技术有限公司与复旦大学药学院对那西肽进行了产业化研究，同年取得产品批号，商品名“诺农”，于2003年大批量投放市场。

那西肽被作为抗生素使用对大多数革兰氏阳性菌有效，尤其对金黄色葡萄球、链球菌和魏氏梭菌具有较高的活性，目前那西肽被广泛用于畜禽以及水产饲料中。

发明内容

本发明的目的在于，针对以上存在的问题，提供多肽类化合物及其在畜禽发明的应用。

为此，本发明提供以下解决方案：

本发明提供多肽类化合物，所述多肽类化合物的化学式为：

其中，R为羟基或氨基或烷基或卤代烷基或芳香基或卤代芳香基。当R为羟基时，命名此多肽类化合物为汇诺肽。

本发明提供多肽类化合物作为抗生素的应用，多肽类化合物联合使用。

优选地，当那西肽和汇诺肽联合使用作为抗生素的应用时，两种多肽类化合物的比例优选为3:7～7:3。

本发明提供多肽类化合物在防治畜禽球虫病方面的应用。所述的畜禽具体包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、猪、牛、羊或马等经济动物，所述的鸡包括蛋鸡、种鸡、火鸡或者珍珠鸡等。

本发明提供多肽类化合物在抗病毒药物方面的应用。所述病毒包括鸭乙型肝炎病毒和人乙型肝炎病毒。

优选地，所述多肽类化合物单独使用或者联合使用。

本发明提供一种多肽类化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：取那西肽和酸化剂在室温条件下混合搅拌，加入溶剂，回流反应3～4h，反应结束后，冷却，过滤得到滤饼，并用去离子水洗涤滤饼多次，经干燥后得到产品。

优选地，所述酸化剂优选为35％wt的盐酸。

优选地，所述溶剂为有机高沸点溶剂，优选为N,N-二甲基甲酰胺。

优选地，所述回流时间优选为3h。

以上所述方法中，那西肽由浙江汇能生物股份有限公司提供，酸化剂与溶剂均购于华东医药股份有限公司器材化剂分公司。

本发明提供了一类多肽类化合物新物质，并提供了其在畜禽方面的应用，所述多肽类化合物联合使用作为抗生素的应用时，相对于那西肽而言，联合使用的抑菌效果显著增强；所述多肽类化合物可以应用于防治畜禽球虫方面，且相对于化学合成的药物，多肽类化合物为大分子物质，动物体内不吸收，无可检测残留，在肉鸡所有组织(肝、肾、心脏、肌肉、脂肪、皮肤以及骨骼)中均未发现可检测残留，多肽类化合物在动物的排泄物中被降解为小肽类物质，饲喂含有多肽类化合物饲料的肉鸡所排出的分泌物在常温10周后即无可检测残留，分解后的小肽类物质对土壤微生物的活动也没有任何不良影响，多肽类化合物对目标动物安全，经过研究，多肽类化合物口服LD50大于10000mg/kg体重，用含有多肽类化合物6000mg/kg的饲料喂养大鼠3个月进行一般临床试验，血液检查，生化学检查均没发现多肽类化合物的毒性；所述多肽类化合物可以应用于抗病毒药物方面，所述多肽类化合物在体内对病毒具有显著抑制作用，且反弹较小。

附图说明

图1为本发明所提供的多肽类化合物中取代基为羟基时，即是汇诺肽的核磁H¹谱图；

图2为本发明所提供的汇诺肽的核磁C¹³谱图；

图3为本发明所提供的汇诺肽的质谱图；

图4为本发明所提供的汇诺肽的红外谱图。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明做进一步详细地说明。

实施例1：汇诺肽的制备方法

取10g那西肽(90％wt)和10ml盐酸(35％wt)于室温条件下混合搅拌，加入N,N-二甲基甲酰胺100ml，回流反应3小时，反应结束后，冷却，过滤，滤饼用去离子水洗涤到中性干燥后即得到汇诺肽，经HPLC检测含量为98.1％(面积归一法)。

实施例2：汇诺肽对常见病原菌体外抑制试验(汇诺肽抗菌谱)

为了评价汇诺肽的抗菌活性，采用倍比稀释法对不同测试菌株的最低抑菌浓度(MIC)进行检测，在MH肉汤培养基中，37℃培养18～24小时后，观察并记录细菌的生长情况，进而得到最低抑菌浓度(μg/ml)。

汇诺肽对不同菌株的MIC值见表1，由表中数据可知，汇诺肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抑菌作用。

表1汇诺肽的抗菌活性分析

实施例3：汇诺肽与那西肽以1:9含量比例配伍时的体外抗菌作用

为了评价汇诺肽与那西肽复配后的抗菌活性，采用倍比稀释法对不同测试菌株的最低抑菌浓度(MIC)进行检测，在MH肉汤培养基中，37℃培养18～24小时后，观察并记录细菌的生长情况，进而得到最低抑菌浓度(μg/ml)。

单独以那西肽为抗菌制剂时的MIC值见表2。汇诺肽：那西肽为1:9时，对不同菌株的MIC值见表3，由表中数据可知，与单独使用那西肽相比，以1:9配伍使用对革兰氏阳性菌的抑菌效果差异不大，但对革兰氏阴性菌的抑菌效果有一定的促进作用。

表2那西肽的抗菌活性分析

表3汇诺肽:那西肽＝1:9的抗菌活性分析

实施例4：汇诺肽与那西肽以3:7含量比例配伍时的体外抗菌作用

体外抗菌试验方法同实施例2。

汇诺肽：那西肽为3:7时，对不同菌株的MIC值见表4，由表中数据可知，与单独使用那西肽相比，以3:7配伍使用对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果均有促进作用，尤其是对产气荚膜梭菌的抑菌作用显著增强。可见，汇诺肽与那西肽以3:7配伍使用，对体外抑菌效果达到了协同促进的作用。

表4汇诺肽：那西肽＝3:7的抗菌活性分析

实施例5：汇诺肽与那西肽以5:5含量比例配伍时的体外抗菌作用

体外抗菌试验方法同实施例2。

汇诺肽：那西肽为5:5时，对不同菌株的MIC值见表5，由表中数据可知，与单独使用那西肽相比，以5:5配伍使用对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果均有较大的促进作用，尤其是对产气荚膜梭菌的抑菌作用显著增强。可见，汇诺肽与那西肽以5:5配伍使用，对体外抑菌效果达到了协同促进的作用。

表5汇诺肽：那西肽＝5:5的抗菌活性分析

实施例6：汇诺肽与那西肽以7:3含量比例配伍时的体外抗菌作用

体外抗菌试验方法同实施例2。

汇诺肽：那西肽为7:3时，对不同菌株的MIC值见表6，由表中数据可知，与单独使用那西肽相比，以7:3配伍使用对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果均有促进作用，尤其是对革兰氏阴性菌和产气荚膜梭菌的抑菌作用显著增强。可见，汇诺肽与那西肽以7:3配伍使用，对体外抑菌效果达到了协同促进的作用。

表6汇诺肽：那西肽＝7:3的抗菌活性分析

实施例7：汇诺肽与那西肽以9:1含量比例配伍时的体外抗菌作用

体外抗菌试验方法同实施例2。

汇诺肽：那西肽为9:1时，对不同菌株的MIC值见表7，由表中数据可知，与单独使用那西肽相比，以9:1配伍使用对革兰氏阳性菌的抑菌效果差异不大，但对革兰氏阴性菌的抑菌效果有一定的促进作用。

表7汇诺肽:那西肽＝9:1的抗菌活性分析

实施例8：汇诺肽对肉鸡球虫病的临床试验

选用同一批240只健康鸡苗，公母各半、体重均匀、未经鸡球虫苗等任何疫苗免疫，在清洁通风的条件下网上平养，喂不添加抗生素、抗球虫药物的配合饲料和清洁自来水，自由采食。饲养至12日龄时，随机分成8组，每组30只。除阴性对照组外，各组鸡经嗉囊人工接种鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊悬浮液1.0ml(含柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1.0×10⁵个)，接种卵囊2h后，汇诺肽药物组和地克珠利药物对照组开始给药，并记录为试验的第一天。汇诺肽药物组和地克珠利药物对照组混饲给药，连用七天，每天观察和记录试验鸡精神、食欲等状况。试验第4天开始每天检查粪便，记录血粪情况，直至扑杀。试验第7天进行克粪卵囊计数，第8天剖检，重点检查盲肠病变，根据病变标准进行计分。

效果判定：观察鸡只精神、食欲，记录存活率、增重及相对增重率、病变记分值、卵囊计数值，通过计算药物抗球虫指数(ACI)等进行综合判定。

抗球虫指数(ACI)＝(相对增重率+存活率)×100-(病变值+卵囊值)

表8试验鸡分组及处理方法

试验结果显示：阴性对照组鸡精神状态良好，食欲正常，羽毛光泽，粪便正常无血粪，粪检无卵囊或者有少量卵囊；阳性对照组感染孢子化卵囊后，于试验第4天有血粪排出，试验第5天和第6天更为严重，试验第7天扑杀仍见血粪。在血粪出现并增多的同时，鸡的其它症状日渐严重，主要表现为精神萎顿、食欲下降、羽毛松乱、翅下垂，部分鸡离群呆立、缩颈闭眼。用药组，包括汇诺肽药物组和地克珠利药物对照组，鸡血粪数量明显减少，鸡群较活泼，食欲正常。各试验组对球虫感染鸡只的治疗效果见表9。

表9各试验组对球虫感染鸡只的治疗效果表

从以上结果可以看出，汇诺肽的ACI大于180，效果优秀。

实施例9：汇诺肽对仔猪球虫病的临床试验

实验选择100头哺乳仔猪(3-8日龄)用于试验，上述仔猪已经过粪便镜检确诊为患球虫。主要症状为腹泻，粪便呈水样或糊状，显黄色至白色，偶尔由于潜血而呈棕色，粪便镜检发现卵囊。随机分为5组，空白对照组不用任何药物；实验1、2、3和4组分别服用本发明汇诺肽产品，按照一定比例混入猪饲料中饲喂，常规饲喂，连用7日，统计各组的治疗效。

表10各组断奶仔猪不同时间平均OPG值检出结果

从表10看出，仔猪饲喂5mg/kg汇诺肽3天后，卵囊减少率为100％，说明汇诺肽对仔猪球虫疗效显著。

实施例10：不同浓度的汇诺肽抗乙肝病毒体外药效试验

实验方法：取Hep G₂ 2.2.15细胞株，以每孔10×10⁵个细胞接种于24孔板，在5％CO₂孵箱中37℃培养，72小时后，分别将生长液换成含不同药物浓度的药物培养液，每组药物培养液设置5个浓度1～100μg/ml，每个浓度设4个平行孔，继续培养9天，每3天换液一次。阳性对照组药物为拉米呋啶(3TC)，浓度50μg/ml，同时以不含药物的培养液作为空白对照组，两个对照组各设置1孔，除生长液相应的换成拉米呋啶药物与不含药物的培养液外，两对照组与药物培养液的操作相同。收集上清液用ELISA试剂盒检测HBsAg及HBeAg含量，同时用MTT法测定上述两组化合物不同浓度药物对细胞的毒性。其结果如表11。

表11不同浓度汇诺肽的细胞毒性及抗乙肝病毒测试结果

备注：与阴性对照组比较，*：p<0.05，**：p<0.01

实验结果：不同浓度的汇诺肽及3TC的细胞毒性以及对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用测定结果见表11。

1、MTT细胞毒性分析对于不同配比的汇诺肽抗乙肝病毒的分析，实验采用1、5、10、50、100μg/ml五个浓度作用于HepG₂ 2.2.15细胞，采用MTT法分析样品不同浓度对细胞毒性的影响。MTT的结果显示，不同配比的汇诺肽在浓度为1、5、10、50、100μg/ml五个浓度时，细胞存活率均＞95％。

2、不同配比的汇诺肽对HepG₂ 2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用随着浓度的增加，汇诺肽对HBsAg和HBeAg的抑制率增加。表明不同药物浓度配比的汇诺肽对乙肝表面抗原HBsAg和乙肝核心抗原HBeAg均有显著的抑制效果，且呈现浓度依耐性。

结论：与治疗乙肝的临床药物3TC相比，1、5、10μg/ml剂量的汇诺肽组比试验剂量(50μg/ml)的3TC组抗乙肝病毒效果稍差；50、100μg/ml剂量的汇诺肽组比试验剂量(50μg/ml)的3TC组抗乙肝病毒效果稍好。

试验表明1～100μg/ml剂量的汇诺肽均可以有效的抑制乙肝病毒HBsAg和HbeAg，50～100μg/ml剂量的汇诺肽抑制效果更佳，但50μg/ml和100μg/ml剂量的汇诺肽抑制效果差异不显著。

实施例11：汇诺肽的抗鸭乙型肝炎病毒作用

鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝DNA病毒科，两者的病毒大分子结构与复制有很多相似之处。先天感染DHBV的鸭因其病毒血症持续时间较长且较稳定，无明显的自然转阴现象，是研究人类乙型肝炎发病机制、病毒复制过程及筛选有效治疗药物的理想动物模型。

我们采用先天感染鸭乙型肝炎病毒(duck Hepatitis Bvirus，DHBV)的龙岩麻鸭为模型，以汇诺肽为实验药物，以拉米呋啶(3TC)为对照药物，研究了其体内抗乙肝病毒的作用。

实验方法：1日龄龙岩麻鸭购回后适应性喂养2d，于4日龄胫静脉取血，离心，收集血清，斑点杂交法检测DHBV DNA，第13天出结果，筛选出先天自然感染鸭。将DHBV DNA阳性鸭随机分为3组：阴性对照组、阳性对照组(拉米呋啶组)和汇诺肽组，每组10只。汇诺肽组每天按50mg·kg-1剂量口服给药，拉米呋啶组每天按50mg·kg-1剂量口服给药，阴性对照组以生理盐水代替。

汇诺肽组和拉米呋啶组每天按50mg·kg-1剂量口服给药，给药体积为1mL/次，模型组以生理盐水代替。开始给药时鸭体重115～125g/只。每5d称体重1次，按体重调整给药量，连续给药10d。血样采集为13日龄用药前(T0)、用药第5天(T5)、用药第10天(T10)及停药后第3天(P3)，自鸭胫静脉取血，分离血清，-70℃冻存待检。采用DHBV DNA Dot Blot法测定。通过在酶标检测仪上测定OD值，计算鸭血清中DHBV DNA密度。

表12汇诺肽对DHBV DNA的抑制作用

备注：与阴性对照组比较，*：p<0.05，**：p<0.01

实验结果：阳性药物拉米呋啶灌胃50mg·kg^-1·d^-1，连续10天给药，可显著抑制血清HBV DNA，停药5天后，DHBV DNA显著回升，与临床结果相吻合，说明本次实验的有效性。受试药物汇诺肽用药10天后，与阴性对照组比较，血清DHBV DNA变化差异也有显著性意义(P<0.01)，停药5天后，DHBV DNA有所增加，但反弹较小，提示汇诺肽在鸭体内对DHBV DNA有显著抑制作用，且反弹较小。

实施例12：汇诺肽对仔猪生长性能的影响

那西肽、汇诺肽为试验药物。选择窝别、胎次接近的7窝健康的杜长大仔猪，每窝栏约20头猪，平均体重约11kg。按随机设计原则分为5个处理组和2个对照组，每组2栏。药物添加组分为：每千克饲料添加1mg、10mg、20mg、50mg、100mg汇诺肽。阳性对照组使用基础日粮添加20mg/kg那西肽。阴性对照组使用基础日粮并不添加任何药物。

试验仔猪采用分栏群饲，自由采食和饮水，进行常规仔猪免疫程序，饲养管理按常规进行，试验前对猪舍常规进行消毒，预试期5d后称重，正试期35d。试验期间每天观察猪群采食情况、健康状况。试验结束后，禁饲24h称重，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)、成活率及腹泻率。并对结果进行差异显著性分析，分析结果见表13和表14。

表13汇诺肽对仔猪生产性能的影响

^a,b,c,d:同一列内不同内标表示差异显著(P<0.05)。

试验结果表明：与阴性对照组相比，在饲料中添加1～100mg/kg剂量的汇诺肽，可以促进仔猪增重，降低料肉比。与那西肽组相比，1mg/kg剂量的汇诺肽组的饲养效果稍差，10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg汇诺肽组的仔猪日增重与阳性对照组相比较平均日增重显著增加(P<0.05)，料重比有所降低，但差异不显著。

表14汇诺肽对仔猪成活率和腹泻指数的影响

^a,b,c:同一栏内不同内标表示差异显著(P<0.05)。

试验结果表明：与阴性对照组相比，在饲料中添加10～100mg/kg剂量的汇诺肽，可以显著地提高仔猪成活率，降低仔猪腹泻率。20～100mg/kg剂量组的汇诺肽比那西肽组可以更好的预防仔猪腹泻。

结论：汇诺肽添加在仔猪饲料中能显著促进仔猪生长，提高饲料利用率，维护其肠道健康并预防仔猪腹泻。

实施例13：汇诺肽对肉鸡生产性能的影响

选择7000只1日龄健康“AA”肉鸡，随机分为5个处理组和2个对照组。每组1000只，且每组分为5个重复。药物添加组分为：1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。阳性对照组使用基础日粮添加10mg/kg那西肽。阴性对照组使用基础日粮并不添加任何药物。各组的基础日粮和添加剂(多种维生素、微量元素、氨基酸等)完全相同。

各试验组在同一饲养和管理条件下，采用网上平养。试验前对所有鸡舍进行严格消毒并空置一周以上。试验全期鸡群自由采食，自由饮水，舍温按常规饲养标准控制，按常规免疫程序进行免疫接种。试验期为49d。试验开始和结束时，以重复为单元，对鸡只进行空腹称重，获得其初重和末重，记录整个试验期供料量、剩余料量和损失料量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。并对结果进行差异显著性分析，分析结果见表15。

表15汇诺肽对肉鸡生产性能的影响

^a,b:同一栏内不同内标表示差异显著(P<0.05)。

试验结果表明：与阴性对照组相比，在饲料中添加1～100mg/kg剂量的汇诺肽，可以有效的促进肉鸡增长，降低料肉比。与那西肽组相比，1mg/kg剂量的汇诺肽组的饲养效果稍差，10～100mg/kg汇诺肽组的仔猪日增重与那西肽组饲喂效果相当。

结论：汇诺肽在肉鸡饲料中能显著促进肉鸡生长，提高饲料报酬。

实施例14：汇诺肽 对蛋鸡生产性能的影响

选择630只22周龄健康海兰蛋鸡，随机分为5个处理组和2个对照组。每组90只，分为3个重复，每个重复30只鸡。药物添加组分为：1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。阳性对照组使用基础日粮添加2.5mg/kg那西肽。阴性对照组使用基础日粮并不添加任何药物。各组的基础日粮和添加剂(多种维生素、微量元素、氨基酸等)完全相同。预饲期7d，正式试验30d。

分别统计总产蛋个数，产蛋率，平均蛋重，料蛋比。对结果进行差异显著性分析，分析结果见表16。

表16汇诺肽对蛋鸡生产性能的影响

^a,b,c:同一栏内不同内标表示差异显著(P<0.05)。

表16显示：在蛋鸡饲料中添加不同剂量汇诺肽后，各组蛋鸡平均产蛋率、平均蛋重和料蛋比与阳性对照组相比，均有所改善，且20mg/kg、50mg/kg组有明显改善，差异显著(P＜0.05)。

结果表明：汇诺肽在蛋鸡上的添加量为20～50mg/L时能显著提高蛋鸡平均产蛋率，平均蛋重，降低料蛋比。

结论：在蛋鸡饲料中添加汇诺肽能显著提高蛋鸡产蛋率、平均蛋重，降低料蛋比。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例而已，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种多肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：取那西肽和酸化剂在室温条件下混合搅拌，加入溶剂，回流反应3～4h，反应结束后，冷却，过滤得到滤饼，并用去离子水洗涤滤饼多次，经干燥后得到产品；

所述多肽类化合物的化学式为：

其中，R为羟基；

所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

2.根据权利要求1所述的多肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述酸化剂为35％wt的盐酸。

3.根据权利要求1所述的多肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述回流时间为3h。

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