CN105213410B - 白头翁皂苷b4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用,白头翁皂苷B4的抗炎作用可能是直接通过抑制淋巴细胞激活及抑制炎性因子分泌产生的,本发明的白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用属于首次公开,属于纯天然制剂,安全可靠无毒副作用,对治疗急性炎症药物具有潜在的开发价值。
Description
技术领域
本发明涉及白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用。
背景技术
炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所产生的防御反应,典型的反应是出现红、肿、热、痛等临床症状,是机体对内外环境中有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应。炎症反应是一种保护性防御反应,又是引起人类多种重大疾病的共同通路,参与人体感染、肿瘤、心脑血管病、老年痴呆和神经退行性疾病、变态反应疾病、精神病等许多重大疾病的发生和发展过程。临床上,抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物。
由于现有的合成化学抗炎药包括非甾体抗炎药和甾体抗炎药,其中甾体抗炎药具有明显的不良反应。中草药因其资源丰富、疗效确切、副作用小等优点,从天然药物中开发新型抗炎药物逐渐成为研究热点。在形形色色的免疫调节剂中,天然免疫调节剂引起人们极大的兴趣。很多天然药物活性成分在多种炎症模型上显示出不同程度的抗炎效果,目前发现的抗炎天然产物活性成分的类别主要包括:单萜与二萜类、三萜及其苷类、苯丙素类、蒽醌类、黄酮及其苷类、生物碱类、多糖类等化合物。
药理研究表明皂苷具有显著的抗炎活性,从植物中筛选活性皂苷化合物是当今药物开发的一个方向。李晓辉等研究三七总皂苷(PnS),发现60,120,240 mg/kg PnS 3个剂量组均能一定程度地降低肺泡灌洗液中白细胞数、蛋白含量、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及一氧化氮(NO)含量,提示PnS具有良好抗炎活性,并且其机制与抑制肺泡灌洗液中炎性细胞因子TNF-α及NO水平的升高有密切关系。对黄芪总皂苷基础研究发现其对关节炎有抑制作用,且无明显的毒副作用,可用于类风湿关节炎的治疗。杨沁等研究其抗炎作用机制与其降低血管通透性和抑制白细胞游出、降低磷脂酶A2(PLA2)活性、减少白介素(IL)-8,前列腺素E2(PGE2),NO等炎症介质的产生及抑制氧自由基生成有关。桔梗皂苷D为桔梗科植物桔梗的全草中提取出的五环三萜皂苷类活性成分。早期的大鼠足肿胀及佐剂诱导大鼠关节炎的模型研究表明,桔梗皂苷是其主要的抗炎活性成分。最近的动物实验证实,桔梗皂苷D具有明显的抗炎活性,其抗炎机制可能是调控炎症早期介质,如对佛波酯(TPA)所致的炎症模型,桔梗皂苷D能抑制PGE2产生;对脂多糖(LPS)所致炎症模型,桔梗皂苷D能抑制NO产生和肿瘤坏死因子TNF-α的分泌。
白头翁是毛茛科(Ranunculaceae)白头翁属植物白头翁(Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel)的干燥根,具有清热解毒、凉血止痢的功效。白头翁的主要药理活性包括抗菌作用、抗阿米巴原虫作用、抗病原体作用、抗癌作用、杀精子作用和镇静镇痛作用。白头翁的主要有效成分包括白头翁素和白头翁皂苷等,其中白头翁皂苷可通过水提或醇提得到。现代药理研究发现,白头翁皂苷具有增强免疫功能、抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用,因此受到广泛的研究和关注,但目前尚未有抗炎活性的白头翁皂苷单体化合物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用。
白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用。
其中所述药物是治疗急性肝损伤的药物。
其中所述药物是治疗肺损伤的药物。
其中所述药物是治疗肾损伤的药物。
白头翁皂苷B4的抗炎作用可能是直接通过抑制淋巴细胞激活及抑制炎性因子分泌产生的,本发明的白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用属于首次公开,属于纯天然制剂,安全可靠无毒副作用,对治疗急性炎症药物具有潜在的开发价值。
本发明通过具体实施例中的实验证明了白头翁皂苷B4作为免疫调节剂具有治疗急性炎症的作用。
附图说明
图1:具体实施例1中白头翁皂苷B4对LPS诱导的小鼠肝损伤的影响。
附图标记:##表示与正常对照组相比较,P < 0.01;*表示与LPS组相比较,P < 0.05;**表示与LPS组相比较P < 0.01。
图2:具体实施例1中白头翁皂苷B4对LPS诱导的急性肝损伤小鼠模型肝组织病理学的影响 (HE ×400)。
附图标记:A. 模型组; B. LPS组; C.B4+LPS高剂量组; D. B4+LPS中剂量组E.B4+LPS低剂量组; F. 地塞米松+LPS组.
图3:具体实施例2中白头翁皂苷B4对LPS诱导的小鼠外周血白细胞数的影响。
附图标记:#表示与正常对照组相比较,P < 0.05;*表示与LPS组相比较,P <0.05。
图4:具体实施例2中白头翁皂苷B4对LPS处理的小鼠肺湿重比的影响。
附图标记:##表示与正常对照组相比较,P < 0.01;*表示与LPS组相比较,P < 0.05;**表示与LPS组相比较P < 0.01。
图5:具体实施例2中白头翁皂苷B4对LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织病理学的影响 (HE ×400)。
附图标记:A. 模型组; B. LPS组; C.B4+LPS高剂量组; D. B4+LPS中剂量组E.B4+LPS低剂量组; F. B4高剂量组.
图6:具体实施例3中白头翁皂苷B4对LPS诱导的小鼠肾损伤的影响。
附图标记:##表示与正常对照组相比较,P < 0.01;*表示与LPS组相比较,P < 0.05;**表示与LPS组相比较P < 0.01。
图7:具体实施例3中白头翁皂苷B4对LPS诱导的急性肾损伤小鼠模型肾组织病理学的影响 (HE ×400)。
附图标记:A. 模型组; B. LPS组; C.B4+LPS高剂量组; D. B4+LPS中剂量组E.B4+LPS低剂量组; F. 地塞米松+LPS组.
图8:具体实施例4中白头翁皂苷B4对刀豆素A (Con A)激活的淋巴细胞增殖的影响
附图标记:##表示与阴性对照组相比较,P < 0.01;**表示与刀豆素A组相比较P < 0.01。
图9:具体实施例4中白头翁皂苷B4对Con A激活的淋巴细胞分泌细胞因子的影响。
附图标记:##表示与阴性对照组相比较,P < 0.01;**表示与刀豆素A组相比较P < 0.01。
具体实施例
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明,但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制,而是由权利要求加以限定。
实施例1:
血生化检测白头翁皂苷B4对LPS刺激后小鼠血清中急性肝炎症的指标的影响。
将体重为18-22 g的ICR小鼠随机分为6组,每组10只,分别为空白对照组,LPS造模组(10 mg/kg)、LPS+阳性对照药组 (地塞米松,5 mg/kg),LPS+白头翁皂苷B4低剂量组(50mg/kg)、LPS+白头翁皂苷B4中剂量组(100 mg/kg)、LPS+白头翁皂苷B4高剂量组(200 mg/kg)。在LPS造模前3小时给予B4治疗,造模后3小时及6小时再分别给予阳性对照药、白头翁皂苷B4进行治疗,治疗3小时后眼球取血。将取出的小鼠全血室温静置2小时,3500 rpm/min,离心15min,取上清200μl利用血生化分析仪检测与肝损伤相关的生化指标。分离每只小鼠肝脏,随机取三只小鼠肝脏放入10%的甲醛缓冲溶液中使其脱水。然后将固定的组织被嵌入石蜡,并制成切片,用苏木精、曙红染色,之后进行形态检查。
实验结果表明,LPS处理组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)相比于空白对照组升高。肝内ALT活性远远超过其它脏器的活性,主要存在于肝细胞质的可溶性部分,故测定ALT反映肝脏损害具有特殊意义。急性肝炎能够导致血清ALT活性增高。白头翁皂苷B4治疗后能下调因LPS诱导的血清中ALT的升高。门冬氨酸氨基转移酶(AST)过去称谷草转氨酶(GOT),临床AST测定主要用于诊断急性心肌梗塞、肝细胞及骨骼肌疾病。急性心肌梗塞发作后6~8小时开始升高,24 小时达高峰,约3~5天恢复正常。升高还见于肺栓塞,充血性心力衰竭,病毒性肝炎,中毒性肝炎,肝硬化,肝癌(早期正常),胆道阻塞,溶血性疾病、骨骼肌疾病如进行性肌营养不良、皮肌炎(神经性肌炎正常)、挤压性肌肉损伤,坏疽,急性胰腺炎等。LPS处理组小鼠血清AST相比于空白对照组升高,白头翁皂苷B4给药后能够下调小鼠血清中因LPS造成的AST活性升高。这些结果表明白头翁皂苷B4对LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有良好的治疗效果(如说明书附图1所示)。
分析不同给药组肝组织病理学检测结果发现,LPS 注射后肝脏细胞间大量炎症细胞浸润,并伴有明显水肿现象;白头翁皂苷B4中剂量治疗组肝脏组织病变局限,几乎未见肝水肿及炎性细胞浸润现象,治疗效果最佳。空白对照组肝脏组织结构完整,无炎症细胞浸润、水肿现象(如说明书附图2所示)。
实施例2:
白头翁皂苷B4对LPS诱导的急性炎症反应及肺损伤的影响:
将体重为18-22 g的ICR小鼠随机分为6组,每组10只,分别为空白对照组,LPS造模组(10 mg/kg)、LPS+阳性对照药组 (地塞米松,5 mg/kg)、LPS+白头翁皂苷B4低剂量组(50mg/kg)、LPS+白头翁皂苷B4中剂量组(100 mg/kg)、LPS+白头翁皂苷B4高剂量组(200 mg/kg)。在LPS造模后立即给予B4治疗,造模后3小时再给予B4进行治疗,造模前1小时给予阳性药物地塞米松治疗,造模6小时后眼球取血(取血管预加入抗凝剂),剖杀,分离每只小鼠全肺,随机取三只小鼠肺脏放入10%的甲醛缓冲溶液中使其脱水。然后将固定的组织被嵌入石蜡,并制成切片,用苏木精、曙红染色,之后进行形态检查。将取出的小鼠全血利用五类血分析仪检测不同组别小鼠血液中各细胞的含量。称取小鼠全肺湿重,并将全肺放入65℃的烘箱中72 h,再称小鼠全肺干重,计算不同组别肺湿重/干重的比值。
血常规实验检测给药小鼠血液中白细胞的个数发现,LPS诱导组与正常对照组相比,小鼠血液中白细胞个数明显升高。病理性白细胞增高多见于急性化脓性感染、尿毒症、白血病、组织损伤、急性出血等。阳性对照药物地塞米松及白头翁皂苷B4低剂量给药组较LPS组小鼠中白细胞个数明显降低,说明白头翁皂苷B4具有良好的抗炎症疗效(如说明书附图3所示)。
由不同给药组小鼠体重、肺湿重比的变化结果我们发现,各给药组与空白对照组小鼠体重基本没有差异。对比肺湿重比数据我们发现LPS腹腔给药6小时后,小鼠肺湿重比明显升高(P<0.01),说明肺脏在LPS刺激后出现肺出血及肺水肿现象,并且LPS造模并给予白头翁皂苷B4高剂量及阳性药物治疗组小鼠肺湿重比相比于LPS造模组极显著降低(P<0.01),这说明白头翁皂苷B4高剂量组及阳性对照药地塞米松均能显著缓解肺部出血及肺水肿(如说明书附图4所示)。
分析不同给药组肺组织病理学检测结果发现,LPS 注射后肺泡间隔明显增厚,大量炎症细胞浸润,明显肺出血及肺水肿;白头翁皂苷B4高剂量组肺组织病变局限,肺水肿及炎性细胞浸润较LPS组明显减轻,治疗效果最佳。空白对照组及白头翁皂苷B4组肺组织结构完整,无出血、水肿现象(如说明书附图5所示)。
实施例3:
白头翁皂苷B4对LPS诱导的急性肾损伤的影响:
将体重为18-22 g的BALB/C小鼠随机分为7组,每组10只,分别为空白对照组,LPS造模组(10 mg/kg)、LPS+阳性对照药组 (地塞米松,5 mg/kg),LPS+白头翁皂苷B4低剂量组(50 mg/kg)、LPS+白头翁皂苷B4中剂量组(100 mg/kg)、LPS+白头翁皂苷B4高剂量组(200mg/kg)、B4高剂量组(200 mg/kg)。在LPS造模前3小时给予B4治疗,造模后3小时及6小时再分别给予阳性对照药、白头翁皂苷B4进行治疗,治疗3小时后眼球取血。将取出的小鼠全血室温静置2小时,3500 rpm/min,离心15min,取上清200μl利用血生化分析仪检测与肾损伤相关的生化指标。分离每只小鼠肾脏,随机取三只小鼠肾脏放入10%的甲醛缓冲溶液中使其脱水。然后将固定的组织被嵌入石蜡,并制成切片,用苏木精、曙红染色,之后进行形态检查。
实验结果表明,LPS处理组小鼠血清尿素氮升高,肾功能损伤,急性肾小球肾炎,肾盂肾炎,肾衰竭等肾脏疾病尿素氮均升高,表明LPS处理后肾功能受损。B4给药后小鼠血清中尿素氮与LPS造模组相比均明显降低,说明B4对LPS引起的肾脏急性损伤有明显的恢复作用(如说明书附图6所示)。LPS处理的小鼠肌酐显著上升,说明肾脏功能损伤严重,可能引发尿毒症并伴有重度充血性新功能不全,B4高剂量给药组小鼠血清中肌酐显著下调(如说明书附图6所示),说明B4对于LPS引发的肾脏炎症有良好的治疗效果。
分析不同给药组肺组织病理学检测结果发现,LPS 注射后肾脏实质细胞间大量炎症细胞浸润,并伴有明显水肿现象;白头翁皂苷B4中剂量治疗组肾组织病变局限,几乎未见肾水肿及炎性细胞浸润现象,治疗效果最佳。空白对照组肾组织结构完整,无炎症细胞浸润、水肿现象(如说明书附图7所示)。
实施例4:
白头翁皂苷B4对Con A激活的体外培养的淋巴细胞的抑制作用。
白头翁皂苷B4对LPS刺激的急性炎症反应有明显的抑制作用,接下来我们将检测其对体外培养的淋巴细胞的直接影响。
无菌分离ICR小鼠脾脏,将其放入RPMI 1640 培养基 (Gibco BRL, Rockville,MD)中洗涤,脾淋巴单细胞通过200目筛网分离入50 ml离心管中,1000 rpm离心10min,弃上清。用两倍于细胞沉淀体积的红细胞裂解液重悬淋巴细胞,室温静置5min,1000 rpm离心10min,弃上清。用RPMI 1640 培养基将淋巴细胞洗涤两遍,取10 μl细胞悬液计数,以105/100 μl接种96孔板,在5 % CO2 ,37 °C培养箱中放置4-6 h。用不同浓度白头翁皂苷B4(3.75, 7.5, 15, 30 and 60 μg/ml)处理细胞24 h后加入10 μL CCK8 (DojindoMolecular Technologies, Kumamoto, Japan),培箱中放置4 h,450 nm波长处检测细胞增殖效果。用Con A刺激淋巴细胞时与白头翁皂苷B4共同给药24 h,阳性对照组给予1 μM环孢素A(Cyclosporine A)处理。
分析淋巴细胞增殖结果发现,不同浓度的白头翁皂苷B4对淋巴细胞的增殖没有明显影响,但能明显抑制Con A刺激的淋巴细胞增殖作用,并且低剂量白头翁皂苷B4抑制淋巴细胞激活的效果最佳(如说明书附图8所示)。
收集药物处理后淋巴细胞上清液,利用ELISA检测细胞分泌的炎症相关因子TNF-α及IL-4的表达。不同浓度的白头翁皂苷B4对淋巴细胞分泌的细胞因子没有明显影响,但对Con A刺激的淋巴细胞分泌的因子TNF-α及IL-4有明显的抑制作用(如说明书附图9所示)。说明白头翁皂苷B4对激活的脾淋巴细胞有明显的抑制增殖及抑制炎症因子分泌的效果。
Claims (1)
1.白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在制备治疗急性炎症药物中的应用,其中所述药物是治疗肺损伤的药物,其中所述药物是治疗肾损伤的药物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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