CN109549944B - 白头翁皂苷b4在制备抗炎症性肠病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白头翁皂苷B4在制备抗炎症性肠病药物中的应用。本发明还公开了一种抗炎症性肠病药物,包括白头翁皂苷B4。本发明首次公开了白头翁皂苷B4在制备抗急性炎症性肠病药物中的应用,属于纯天然制剂,安全可靠无毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及白头翁皂苷B4的应用,尤其涉及白头翁皂苷B4在制备抗炎症性肠病药物中的应用。
背景技术
炎症通常可依病程经过分为两大类:急性炎症和慢性炎症。急性炎症起病急骤,持续时间短,仅几天到一个月,以渗出病变为其特征,炎症细胞浸润以粒细胞为主。慢性炎症持续时间较长,常数月到数年,常以增生病变为主,其炎症细胞浸润则以巨噬细胞和淋巴细胞为主。
炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。IBD发病隐匿,以腹痛、腹泻、粘液便、粘膜血便等为主要临床表现,病变反复发作,呈慢性病程。目前研究发现其发病主要与环境、遗传、免疫以及微生物感染等因素密切相关,致使机体发生免疫异常、肠道菌群失调、氧化应激效应等最终引起IBD的发生发展。
临床上用于治疗炎症性肠病的药物主要有四类:氨基水杨酸类、免疫制剂、糖皮质激素、TNF-α单克隆抗体,但是存在疗效不理想、价格昂贵、甚至伴有严重副作用的问题。中草药因其资源丰富、疗效确切、副作用小等优点,从天然药物中开发新型抗炎药物逐渐成为研究热点。很多天然药物活性成分在多种炎症模型上显示出不同程度的抗炎效果,目前发现的抗炎天然产物活性成分的类别主要包括:苯丙素类、蒽醌类、单萜与二萜类、黄酮及其苷类、生物碱类、多糖类等化合物。
白头翁是毛茛科(Ranunculaceae)白头翁属植物白头翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)的干燥根,具有清热解毒、凉血止痢的功效,为治痢之要药,临床上白头翁及其制剂常用来治疗肠道疾病。白头翁的主要药理活性包括抗菌作用、抗阿米巴原虫作用、抗病原体作用、抗癌作用、杀精子作用和镇静镇痛作用。白头翁的主要有效成分包括白头翁素和白头翁皂苷等,其中白头翁皂苷可通过水提或醇提得到。现代药理研究发现,白头翁皂苷具有增强免疫功能、抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用,因此受到广泛的研究和关注。CN201510678057公开了白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用,但是仅公开其在在制备治疗急性肝损伤、肺损伤和肾损伤中的应用,而炎症性肠病的病症和治疗机理与以上几种组织损伤并不相同,与上述几种组织损伤并不能等同视之。此外,CN2018107093170公开了白头翁皂苷B5在制备抗炎症性肠病药物中的应用,但是白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5的化学结构差别很大,二者的活性基团不同,对于白头翁皂苷B4对于抗炎症性肠病的治疗效果还不能根据现有技术简单推断后得出。
紧密连接是一种由多种蛋白质构成的、动态的、多功能复合体,呈一狭长的带状结构,它将相邻的细胞以“拉链样”结构相吻合,使相邻的细胞膜紧靠在一起。紧密连接蛋白按分布部位不同分为两类:一类为细胞膜蛋白,它们位于细胞膜上,多为跨膜蛋白,如claudin、occludin、JAM、CAR蛋白等,它们是构成紧密连接选择性屏障的功能蛋白;一类为细胞质蛋白,它们位于细胞质中,如ZO-1、ZO-2、ZO-3、cinglin、symplekin等,它们可与多种蛋白质结合,起到连接膜蛋白与细胞骨架,传递信号分子的作用。紧密连接封闭肠上皮细胞间隙,形成选择性渗透屏障。在正常情况下,肠上皮的紧密连接对肠道中的有害物质和抗原,如细菌、细菌内毒素、细菌产物和食物残渣等发挥着有效的隔离、屏障作用。当紧密连接被破坏,肠粘膜屏障的完整性受损,肠粘膜屏障对大分子物质的通透性增加,肠道中的抗原物质可以穿过肠粘膜屏障引起机体免疫反应,从而导致炎症性肠病。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供白头翁皂苷B4在制备抗炎症性肠病药物中的应用。
本发明的第一个目的是公开白头翁皂苷B4在制备抗炎症性肠病药物中的应用。
本发明中,白头翁皂苷B4的结构式如下:
进一步地,炎症性肠病为急性结肠损伤。
进一步地,炎症性肠病包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。
进一步地,抗炎症性肠病药物的给药方式为注射给药。
白头翁皂苷B4通过维持肠粘膜屏障功能发挥抗IBD活性。
本发明的第二个目的是提供一种抗炎症性肠病药物,包括白头翁皂苷B4,炎症性肠病为急性结肠损伤。
进一步地,述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。
进一步地,抗炎症性肠病药物的剂型为注射剂。
进一步地,抗炎症性肠病药物中白头翁皂苷B4的注射剂量为2.5-20mg/kg,一天两次。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:
本发明的白头翁皂苷B4在制备治疗急性炎症性肠病药物中的应用属于首次公开,白头翁皂苷B4属于纯天然制剂,安全可靠无毒副作用,对急性炎症性肠病药物具有潜在的开发价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1图示了实施例1中白头翁皂苷B4对乙酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎DAI评分的影响。
图2图示了实施例1中白头翁皂苷B4对乙酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎肠重系数的影响。
图3图示了实施例1中白头翁皂苷B4对乙酸诱导的溃疡性结肠炎大鼠模型结肠组织病理学的影响(HE×100)。
图4图示了实施例2中白头翁皂苷B4对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎DAI评分的影响。
图5图示了实施例2中白头翁皂苷B4对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎肠重系数的影响。
图6图示了实施例2中白头翁皂苷B4对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型结肠组织病理学的影响(HE×100)。
图7图示了实施例3中白头翁皂苷B4对TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)诱导的大鼠克罗恩病结肠炎DAI评分的影响。
图8图示了实施例3中白头翁皂苷B4对TNBS诱导的大鼠克罗恩病结肠炎肠重系数的影响。
图9图示了实施例3中白头翁皂苷B4对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠模型组织病理学的影响(HE×100)。
图10图示了基于活性探针分析的蛋白组学分析(ABPP)探索白头翁皂苷B4结合蛋白的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1:白头翁皂苷B4对乙酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎的影响
将SD大鼠40只,雄性,180~220g,随机分成五组,分别为正常对照组(Normal),模型组(Model),阳性对照组(美沙拉嗪200mg/kg,Mesalazine),白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组(B45mg/kg bid)和白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组(B4 10mg/kg bid)。
实验前,各组大鼠48h内禁食不禁水,将0.5%肥皂水通过直径为lmm的硅胶管经肛门插入洗肠,再用清水冲后用戊巴比妥钠30m/kg腹膜内给药麻醉,然后对各组进行以下处理:
正常对照组:将导管经肛门插进8cm,注入1mL生理盐水,大鼠头部朝下,肛门朝上手托20s后,再注入2mL生理盐水冲洗1次;模型组和其他给药组:将导管经肛门插进8cm,注入1mL 10%乙酸,后同正常对照组。各组大鼠每日给予足量颗粒饲料,饮水不限制。于第2次造模术后24h开始,白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组、白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组(Bid表示每日给药两次),腹腔注射给药,每日两次,阳性对照组腹腔注射给药,每日一次。
疾病活动指数(DAI)于第2次造模术后1天(给药前)及7天(给药后),观察小鼠的体质量、大便性状和隐血情况,按表一中标准进行评分。将体质量下降、大便性状和隐血情况的评分相加。得出每只小鼠的DAI,即DAI=体质量下降分数+大便性状分数+便血分数,以评估疾病活动情况。表一中,正常便指形成颗粒样便;半稀便指糊状或半成形不粘肛便;稀便指水样粘肛便。
表一评分标准
将各组大鼠在术后7天处死,取全段结肠沿肠系膜剖开,生理盐水洗净,测量全结肠长度,滤纸吸干后,测试结肠湿质量,算出肠重系数(结肠的长度与质量的比值),随机取三只大鼠结肠放入4%的多聚甲醛缓冲溶液中使其脱水。然后将固定的组织被嵌入石蜡,并制成切片,用苏木精、曙红染色,之后进行组织病理学检测。
DAI测试结果如图1所示,实验结果表明,模型组大鼠的体重明显下降,出现稀便,并伴有便血或者隐血情况。白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组和白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组可以明显抑制大鼠体重的下降,改善大鼠的大便性状和便血情况。统计肠重系数发现(图2),造模后肠重系数明显上升,说明大鼠的结肠水肿,白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组、白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组和阳性对照组显著降低了肠重系数,说明白头翁皂苷B4改善了肠重系数。
分析不同给药组结肠组织病理学检测结果(图3)发现,模型组上皮细胞丢失,组织形态破坏严重;白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组结肠组织病变局限,上皮细胞形态恢复,排列有序,治疗效果最佳。正常对照组结肠组织结构完整,无炎症细胞浸润、水肿现象。图3a、b、c、d分别表示正常对照组、模型组、白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组和阳性对照组。
实施例2:白头翁皂苷B4对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响
将50只BALB/c小鼠,雄性,18-22g,随机分成五组,分别为正常对照组,模型组,阳性对照组(美沙拉嗪400mg/kg),白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组和白头翁皂苷B4(20mg/kgBid)组。模型组、阳性对照组(美沙拉嗪400mg/kg),白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组和白头翁皂苷B4(20mg/kg Bid)组给予含25g/L DSS的饮水6天,然后换上正常饮水,正常对照组小鼠给予正常饮水。造模后第一天白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组、白头翁皂苷B4(20mg/kgBid)组腹腔注射给药,每日两次,阳性对照组腹腔注射给药,每日一次。
疾病活动指数(DAI)于造模第1天至给药第11天,观察小鼠的体质量、大便性状和隐血情况,按表一中标准进行评分。将各组小鼠在造模后10天处死,按照实施例1中观测指标进行DAI评分、肠重系数测试及组织病理学检测。
结果表明,模型组大鼠的体重明显下降,出现稀便,并伴有便血或者隐血情况。白头翁皂苷B4组可以明显抑制大鼠体重的下降,改善大鼠的大便性状和便血情况(图4)。造模后,大鼠的结肠水肿,严重者出现溃疡,所以肠重系数明显上升,而白头翁皂苷B4组可以改善肠重系数(图5)。
分析不同给药组结肠组织病理学检测结果发现,模型组细胞大量丢失,炎性浸润、水肿明显,白头翁皂苷B4给药后,细胞形态恢复,排列有序。空白对照组结肠组织结构完整,无炎症细胞浸润、水肿现象(如说明书附图6所示)。图6a、b、c、d分别表示正常对照组、模型组、白头翁皂苷B4(20mg/kg Bid)组和阳性对照组。
实施例3:白头翁皂苷B4对TNBS诱导的大鼠克罗恩病的影响
将SD大鼠40只,雄性,180~220g,随机分成六组,分别为正常对照组,模型组,阳性对照组(美沙拉嗪200mg/kg),白头翁皂苷B4(2.5mg/kg Bid)组、白头翁皂苷B4(5mg/kgBid)组和白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组。
实验前,各组大鼠48h内禁食不禁水,将0.5%肥皂水通过直径lmm硅胶管经肛门插入洗肠,再用清水冲洗。然后用戊巴比妥钠30m/kg腹膜内给药麻醉,然后对各组进行以下处理:
正常对照组:将导管经肛门插进8cm,注入1mL生理盐水,大鼠头部朝下,肛门朝上手托2min;模型组和其他给药组:将导管经肛门插进8cm,注入1mL 5%TNBS与乙醇1:1的混合液,后同正常对照组。各组小鼠每日给予足量颗粒饲料,饮水不限制。于第2次造模术后24h开始,白头翁皂苷B4(2.5mg/kg Bid)组、白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组和白头翁皂苷B4(10mg/kg Bid)组以及阳性对照组腹腔注射给药,每日两次。按照实施例1中观测指标进行DAI评分、肠重系数测试及组织病理学检测。
结果表明,模型组大鼠的体重下降明显,出现稀便,并伴有便血或者隐血情况。白头翁皂苷B4组可以明显抑制大鼠体重的下降,改善大鼠的大便性状和便血情况(图7)。造模后,肠重系数明显上升,说明大鼠的结肠水肿,严重者出现溃疡,所以,而白头翁皂苷B4组可以改善肠重系数(图8)。
不同给药组结肠组织病理学检测结果发现,模型组细胞大量丢失,炎性浸润、水肿明显,白头翁皂苷B4给药后,细胞形态恢复,排列有序。空白对照组结肠组织结构完整,无炎症细胞浸润、水肿现象(如说明书附图9所示)。图9a、b、c、d分别表示正常对照组、模型组、白头翁皂苷B4(5mg/kg Bid)组和阳性对照组。
实施例4:基于活性探针分析的蛋白组学分析(ABPP)探索白头翁皂苷B4结合蛋白
ABPP方法的核心是设计一个可以在化合物中发生共价反应的“活性分子探针”。于白头翁皂苷B4中连接上生物素基团(Biotin),则白头翁皂苷B4结合的蛋白被生物素标记,标记后的蛋白既可以通过免疫印迹法检测,还可以被特异的富集出来,然后通过生物大分子质谱进行分析,确定这些被探针标记的蛋白成分。本实施例中将293T细胞裂解液与40μg生物素化的白头翁皂苷B4孵育过夜,竞争组同时加入800μg的游离的白头翁皂苷B4。在使用PierceTMNeutrAvidinTMAgarose富集探针标记的蛋白后,使用0.5mM游离的白头翁皂苷B4洗脱下探针标记的蛋白,通过生物大分子质谱进行分析确定被探针标记的蛋白成分。
分析结果发现了8种白头翁皂苷B4结合蛋白(如说明书附图10所示),分别为PKP1、AZGP1、LACRT、IGHA1、HBB、JUP、PIRAK、IGHA1,且结合蛋白中,与白头翁皂苷B4结合最多的是PKP1。PKP1是犰狳蛋白家族中的重要组成成员,一端与桥粒跨膜蛋白相结合,另一端是胞质内中间纤维的附着处,对桥粒及细胞连接的稳定性起到重要作用,研究发现,PKP1-/-mice紧密连接形成受到抑制、屏障功能受损;PKP1与ZO-1互作,可以改变ZO-1的分布,干扰紧密连接的功能,破坏肠道屏障。说明白头翁皂苷B4可能作用于PKP1维持紧密连接功能,恢复肠粘膜屏障,起到治疗IBD的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.白头翁皂苷B4作为唯一活性成分在制备抗炎症性肠病药物中的应用,所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗炎症性肠病药物的给药方式为注射给药。
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