CN108451964A - 白头翁皂苷b5在制备抗炎症性肠病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及白头翁皂苷B5在制备抗炎症性肠病药物中的应用。本发明还公开了一种抗炎药物，包括白头翁皂苷B5。本发明首次公开了白头翁皂苷B5在制备抗炎药物中的应用，药物可用于治疗炎症性肠病，并且首次公开了其可以进行注射给药。

Description

白头翁皂苷B5在制备抗炎症性肠病药物中的应用

技术领域

本发明涉及白头翁皂苷B5的应用，尤其涉及白头翁皂苷B5在制备抗炎症性肠病药物中的应用。

背景技术

目前IBD(炎症性肠病)的发病机制尚不明确，近年来认为IBD发生与携带遗传易感基因有关，核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2)是最早被发现参与IBD发病过程的肠道上皮屏障功能相关基因之一，它是NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)家族的一员，能够正向调节天然免疫反应。人类NOD2基因位于16q12，亦称CARD15基因。NOD2可以识别所有细菌都含有的成分胞壁酰二肽(MDP)。NODs单体发生构象变化并通过NOD结构域寡聚化，进而通过CARD结构域招募并激活受体相互作用蛋白2(RIP2)，通过转录后修饰途径(泛素化或磷酸化)修饰下游分子级联转导细菌信号，磷酸化的NF-κB抑制剂α(IκBα)在K48处聚泛素化并从NF-κB异二聚体中解离，NF-κB转位于核促进各种炎性因子的转录表达。NOD2功能失活突变导致机体对MDP的反应性降低，TNF-α，IL-6，IL-10和IL-1β等炎性细胞因子的分泌减少，清除细菌能力降低导致过度的细菌侵入，为NOD2功能失活引起炎症疾病的可能机制之一。有研究表明，NOD2缺陷小鼠回肠末端隐窝细胞清除细菌的能力减弱，导致回肠末端共生菌群的改变。NOD2受体在Paneth细胞(肠黏膜隐窝底部固有层特殊分化的细胞)中高表达，回肠末端Paneth细胞数量较多，也是CD容易累积的部位。因此，研发相应药物纠正其调控失常，进而恢复正常的固有免疫反应，将使IBD患者获得更有效的治疗。

白头翁皂苷B5，其为皂苷类成分，一般认为它有毒性和溶血性，不能注射给药。有文献报道了其对福尔马林致白化大鼠爪水肿的研究，其通过抑制前列腺素途径而具有抗炎作用。(Neeli Rose Beck*,Kamta Prasad Namdeo，UK Journal of Pharmaceutical andBiosciences Vol.4(1),36-40,2016)，但是目前并没有关于白头翁皂苷B5对炎症性肠病的治疗作用的相关报道。中国专利CN 105213410A公开了白头翁皂苷B4作为免疫调节剂在治疗急性炎症药物中的应用，药物用于治疗急性肝损伤、急性肺损伤、急性肾损伤。但其并不能用于治疗炎症性肠病。且白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5的结构有较大差异，苷元母核不一样，前者为羽扇豆烷型皂苷，后者为齐墩果烷型皂苷。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供白头翁皂苷B5在制备抗炎症性肠病药物中的应用。

在一方面，本发明公开了白头翁皂苷B5在制备抗炎症性肠病药物中的应用。

本发明中，白头翁皂苷B5也被称为hederasaponin-C，其结构式如下：

进一步地，炎症性肠病包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。

在本发明中，溃疡性结肠炎由乙酸诱导。克罗恩病由TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)诱导。

进一步地，抗炎药物的给药方式包括注射给药。

进一步地，白头翁皂苷B5通过抑制NOD2信号通路发挥抗IBD活性。

经本发明验证，白头翁皂苷B5在体外对动物无毒且无溶血性，因此可以进行注射给药。

在另一方面，本发明还公开了一种抗炎药物，包括白头翁皂苷B5。

进一步地，药物用于治疗炎症性肠病。

进一步地，炎症性肠病包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。

进一步地，抗炎药物的剂型为注射剂。

进一步地，抗炎药物中白头翁皂苷B5的注射剂量为2.5-10mg/kg，一天两次。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明首次公开了白头翁皂苷B5在制备抗炎药物中的应用，药物可用于治疗炎症性肠病，并且首次公开了其可以进行注射给药，克服了现有技术中白头翁皂苷B5具有溶血性、不可注射给药的技术启示，其作为抗炎药物时，安全可靠无毒副作用，对制备治疗炎症的药物具有潜在的开发价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是实施例5中，白头翁皂苷B5对LPS诱导的巨噬细胞中NOD2表达的影响测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1白头翁皂苷B5对体外溶血的影响

(1)2％红细胞悬液的制备

取新鲜兔血10mL，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液。加入生理盐水100mL，摇匀，1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液(红细胞2mL，加生理盐水至100mL)，得到2％红细胞悬液。

(2)溶血测试

取10mL干净玻璃试管6支，编号为1-6，其中，2至4号管为供试品，1号管为阴性对照管，6号管为阳性对照管(完全溶血对照)。向1-6号试管中加入等量的2％红细胞悬液，然后依次分别将2μM、20μM、200μM和2000μM白头翁皂苷B5溶液加入2-4号试管中。此外，1号管加入0.9％氯化钠溶液(生理盐水)，6号管加入蒸馏水，混匀后，立即置于37±0.5℃的恒温水浴中进行温育，观察并记录各管的溶血情况。开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，观察6小时，纪录每管每次观察的溶血情况，孵育结束后拍照纪录各组别的溶血实验结果(表1)。

表1溶血试验测试结果

表1中，“++”表示全溶血，溶液澄明，呈红色，管底无红细胞残留，“-”表示无溶血。

以上结果表明，白头翁皂苷B5在体外无溶血性，说明其可用于注射给药。

实施例2白头翁皂苷B5的安全性评价

采用急性毒性试验对白头翁皂苷B5的安全性进行评价。

将18-25g ICR小鼠随机分成白头翁皂苷B5给药组与生理盐水组，每组十只。白头翁皂苷B5给药组小鼠每日腹腔注射1.0g/kg白头翁皂苷B5，生理盐水组注射等量生理盐水，连续给药14天，每日称取小鼠体重，观察小鼠的生存状态。实验结果显示，与空白对照组相比，14天内白头翁皂苷B5给药组动物体重增长无显著性差异，动物活动状况良好，精神状态佳，毛色白而有光泽，大、小便正常，无死亡，无异常表现。

以上结果表明，白头翁皂苷B5无毒性，安全性良好，可用于注射给药。

实施例3白头翁皂苷B5对乙酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎的影响

(1)分组、造模及给药

分组：取SD大鼠40只，雄性，180～220g，随机分成六组，分别为正常对照组，模型组，阳性对照组(美沙拉嗪200mg/kg)，白头翁皂苷B5低剂量组(2.5mg/kg Bid)，白头翁皂苷B5中剂量(5mg/kg Bid)组和白头翁皂苷B5高剂量组(10mg/kg Bid)。Bid指的是每天两次给药。

实验前，各组大鼠48h内禁食不禁水，将0.5％肥皂水通过直径lmm硅胶管经肛门插入洗肠，再用清水冲洗。然后用戊巴比妥钠30m/kg腹膜内给药麻醉，正常对照组：将导管经肛门插进8cm，注入1mL生理盐水，大鼠头部朝下，肛门朝上手托20s后，再注入2mL生理盐水冲洗1次；模型组和其他给药组：将导管经肛门插进8cm，注入1mL 10乙酸，后同正常对照组。治疗小鼠每日给予足量颗粒饲料，饮水不限制。于第2次造模术后24h开始，白头翁皂苷B5低剂量组、中剂量组和高剂量组以及阳性对照组腹腔注射给药，每日两次。

(2)观测指标

疾病活动指数(DAI)于第2次造模术后1天(给药前)及7天(给药后)，观察小鼠的体质量、大便性状和隐血情况，按表2中标准进行评分。将体质量下降、大便性状和隐血情况的评分相加。得出每只小鼠的DAI，即DAI＝体质量下降分数+大便性状分数+便血分数，以评估疾病活动情况。表2中，正常便指形成颗粒样便；半稀便指糊状或半成形不粘肛便；稀便指水样粘肛便。

表2评分标准

DAI评分结果如表3所示，结果表明，模型组大鼠的体重明显下降，出现稀便，并伴有便血或者隐血情况。白头翁皂苷B5组(B5 2.5Bid、B5 5Bid和B5 10Bid)可以明显抑制大鼠体重的下降，改善大鼠的大便性状和便血情况。

表3不同实验组的DAI评分结果

此外，测试上述各组小鼠的结肠炎症反应情况，将各组小鼠在术后7天称体质量后处死，取全段结肠沿肠系膜剖开，生理盐水洗净，测量全结肠长度，滤纸吸干后，测试结肠湿质量，算出结肠系数(结肠的长度与质量的比值)，结果如表4所示，结果表明，模型组大鼠的结肠出现明显的水肿现象，严重者出现溃疡，所以结肠系数明显下降，而白头翁皂苷B5组(B5 2.5Bid、B5 5Bid和B5 10Bid)可以显著改善肠水肿及溃疡，表现为结肠系数升高。

表4各组小鼠的结肠系数测试结果

表3和表4中，B5 2.5Bid、B5 5Bid和B5 10Bid分别对应上述白头翁皂苷B5低剂量组、白头翁皂苷B5中剂量组和白头翁皂苷B5高剂量组。

实施例4白头翁皂苷B5对TNBS诱导的克罗恩病的影响

(1)分组、造模及给药

按照实施例3步骤(1)中的方法分组，分成6组。实验前，各组大鼠48h禁食不禁水，然后戊巴比妥钠30m/kg腹膜内给药麻醉，正常对照组：将导管经肛门插进8cm，注入1mL生理盐水，大鼠头部朝下，肛门朝上手托2min；模型组和其他给药组：将导管经肛门插进8cm，注入1mL 5％TNBS与乙醇1:1的混合液，后同正常对照组。治疗小鼠每日给予足量颗粒饲料，饮水不限制。于第2次造模术后24h开始，白头翁皂苷B5低剂量组、中剂量组和高剂量组以及阳性对照组腹腔注射给药，每日两次。

按照实施例3中步骤(2)中的观测指标进行DAI评分以及结肠系数测试，结果分别如表5和表6所示。表5和表6中，B5 2.5Bid、B5 5Bid分别对应白头翁皂苷B5低剂量组、白头翁皂苷B5中剂量组和白头翁皂苷B5高剂量组。结果表明，模型组大鼠的体重明显下降，出现稀便，并伴有便血或者隐血情况。白头翁皂苷B5组可以明显抑制大鼠体重的下降，改善大鼠的大便性状和便血情况。造模后，大鼠的结肠水肿，严重者出现溃疡，所以结肠系数明显下降，而白头翁皂苷B5组可以改善结肠系数。

表5不同实验组的DAI评分结果

表6各组小鼠的结肠系数测试结果

实施例5白头翁皂苷B5作为药物对IBD的治疗机理

将RAW264.7细胞以密度为2×10⁶种在培养皿里过夜。用白头翁皂苷B5(0.1-1μM)提前1h对细胞处理，再加入LPS(1μg/mL)共孵育4h。Western blotting检测白头翁皂苷B5对细胞内NOD2蛋白水平表达的影响。结果如图1所示，结果表明，LPS能够显著上调NOD2蛋白水平的表达，白头翁皂苷B5则能够显著抑制IBD易感基因NOD2的表达，此结果说明白头翁皂苷B5可能是通过抑制NOD2信号通路发挥抗IBD活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.白头翁皂苷B5在制备抗炎症性肠病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗炎药物的给药方式包括注射给药。

4.一种抗炎药物，其特征在于，包括白头翁皂苷B5。

5.根据权利要求4所述的抗炎药物，其特征在于：所述抗炎药物用于治疗炎症性肠病。

6.根据权利要求5所述的抗炎药物，其特征在于：所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。

7.根据权利要求4所述的抗炎药物，其特征在于：所述抗炎药物的剂型为注射剂。

8.根据权利要求7所述的抗炎药物，其特征在于：所述抗炎药物中白头翁皂苷B5的注射剂量为2.5-10mg/kg，一天两次。