KR20180039589A - 폴리펩티드를 함유한 생체 다중효과를 가진 약제학적 조성물 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리펩티드(polypeptide)를 함유한 생체 다중효과를 가진 약제학적 조성물 및 그 용도에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1이거나 그 상동성 서열인 것을 특징으로 한다. 상기 폴리펩티드는 다원유전자 전사 또는 다중표적 발현을 제어하는 능력이 있기 때문에 상기 폴리펩티드를 함유한 약제학적 조성물은 개체의 다수 부위에 사용되어 다원유전자 표적으로 작용할 수 있으므로, 염증 또는 염증반응이 있는 질환을 치료하고, 간지방 침착 질환, 지방 축적 관련 질환을 억제하며, 근위축 질환을 예방하거나 치료하고, 당뇨합병증을 저하시키는 등의 효능을 나타낼 수 있다.

Description

폴리펩티드를 함유한 생체 다중효과를 가진 약제학적 조성물 및 그 용도 {A PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH MULTIPLE BIOLOGICAL EFFECTS CONTAINING POLYPEPTIDE AND THE PURPOSE THEREOF}
본 발명은 폴리펩티드(polypeptide)의 이차적 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폴리펩티드를 함유한 생체 다중효과를 가진 약제학적 조성물 및 그 용도에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 번호가 SEQ ID No.1 서열이거나 하나 또는 다수 개의 폴리펩티드의 치환, 결실, 보강으로 파생된 상동성 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
바이오의약 기술이 발달함에 따라, 수많은 연구를 통해 각기 다른 유전자, 성장인자, 신경통로, 표적이 질환의 발생과 진행에 미치는 영향이 이미 밝혀졌으며, 연구원들은 표적과 질환의 관계를 이해함으로써 특정 표적에 직접적으로 작용할 수 있는 표적 약물을 개발해냈다. 현재 표적 약물은 가장 일반적으로 암질환의 치료에 사용되고 있는데, 상기 표적 약물은 암을 유발하는 암 유전자에 직접적으로 작용해 암 질환을 치료하는 효과를 내고 있다. 예를 들어, 내피 성장인자 수용체 변이의 폐암 환자에게 이레사(Iressa) 또는 테쎄바정(Tarceva) 등의 표적 약물을 투여해 비교적 효과적으로 치료할 수 있으며, 종래의 약물이 개체에 일으키는 부작용을 감소시킬 수 있다.
또한, 페메트렉시드(Pemetrexed)는 일라이 릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Company)에서 연구개발에 성공한 새로운 항대사성 항암약물인 다중표적 항암약물로서, 작용을 나타내는 표적은 모두 엽산 대사경로 중의 몇 가지 건효소(key enzyme)이며, 상기 경로는 암세포의 DNA 합성과 암질환의 진행에 현저한 영향을 미친다. 따라서 암질환 억제에 대한 페메트렉시드의 작용이 상당히 우수할 뿐만 아니라 여러 유형의 암질환에도 치료효과를 나타낸다는 것이 연구를 통해 검증되었다. 현재 페메트렉시드는 이미 미국 식약청(FDA)으로부터 승인을 받았으며 악성 중피종 및 말기 비소세포 폐암 치료에 사용된다. 더 나아가, 대규모의 다기관 공동 3상 임상연구 결과에 따르면, 수술로 절개할 수 없는 악성 중피종의 경우 시스플라틴(cisplatin) 화학요법과 페메트렉시드를 함께 사용하면 치료효과를 높이고 환자의 생존시간을 연장할 수 있는 것으로 나타났다. 또 다른 대규모 3상 임상연구에 따르면, 말기 비소세포 폐암 환자에게 1차 화학요법을 실패한 경우 페메트렉시드 치료를 진행하면 종래에 일반적으로 사용하던 도세탁셀(docetaxel)의 치료효과보다 낮지 않으며, 일부 부작용은 심지어 도세탁셀보다 우수하다는 것이 검증되었다. 또한, 페메트렉시드는 위암, 유방암, 췌장암 등과 같은 여러 유형의 악성 종양 치료에도 일정한 치료효과를 나타냈으며, 폐암과 중피종의 경우에는 사용하는 환자 범위가 확대되었다.
또 다른 연구에 따르면, CDA-2 비뇨 제제는 다원유전자 제어 능력을 가지고 있는 것으로 나타났다. 바꿔 말하면, CDA-2 비뇨 제제는 암세포 메틸전달효소 비정상 상태를 해결할 수 있으므로 암세포가 지속적으로 분열하지 않도록 하며, 암세포가 말단분화하거나 세포자살을 하도록 유도함으로써, 암질환 치료 목적을 달성할 수 있다. 암세포 실험에서 알 수 있듯이, CDA-2 비뇨 제제는 혈액암세포 HL-60 및 NB4 및 간암세포 Hep3B가 세포자살을 일으키도록 유도하는 작용을 하며, 동시에 카스파제3(caspase3)의 활성을 저하시킬 수 있다. 또한 동물실험 결과에서 축소된 종양 전이 종양에서 알 수 있듯이, CDA-2 비뇨 제제는 세포 증식과 관련된 유전자를 감소시키는 능력을 가지고 있는데, 여기에는 TGF-2, PCNA, c-myc, c-jin, c-fos, N-ras 등이 포함된다. CDA-2 비뇨 제제는 P16, P21 및 P27과 같은 세포주기를 억제하는 유전자를 증가시키고 세포주기 호르몬 사이클린 D1(cyclin D1)을 감소시킴으로써, 암세포가 세포 성장주기인 G1(G1 phase, G1 arrest)에 머물도록 한다.
또한 CDA-2 비뇨 제제는 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)와 같은 혈관 성장인자의 발현을 억제할 수 있고, Her-2./ neu 단백질과 같은 R인자의 발현을 억제할 수 있다. CDA-2 비뇨 제제는 MMP-9(Matrix metalloproteinase-9), 인테그린 β1(Integrin β1)과 같은 전이 관련 단백질을 감소시킴으로써 전이를 억제할 수 있다. 또한, CDA-2 비뇨 제제는 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ)를 활성화시켜 암세포가 정상세포 상태로 돌아가도록 만듦으로써 암 질환을 억제할 수 있다.
따라서 CDA-2 비뇨 제제는 각기 다른 표적에 작용할 수 있기 때문에 종래의 약물에 비하여 CDA-2 비뇨 제제의 질환 활용 범위는 광범위하고, 암세포 성장, 전이를 억제하고 부작용을 감소시키는 능력을 가지고 있으므로, 효과적으로 암질환을 치료하고 환자의 수명을 연장시키며 환자의 생활 품질을 개선할 수 있다. 여기에서 알 수 있듯이, 약제학적 조성물이 다양한 표적에 작용할 수 있거나 그 작용하는 표적이 다른 질환의 진행에 영향을 미치거나 제어할 수 있을 경우, 상기 약제학적 조성물을 특정 표적에 투여함으로써 다른 질환을 치료하는 목적을 달성할 수 있다.
표적 약물을 암치료에 사용하는 것 이외에, 종래에 있어서 표적 약물을 사용하는 질환에는 암을 제외한 질환도 포함한다. 바꿔 말하면 표적 약물이 작용하는 표적은 더 이상 암 질환과 관련된 대상으로만 제한되지 않는다는 것이다. 구체적으로 중화민국 특허 제I360576호 “레스베라트롤(resveratrol)을 사용하여 종양 줄기세포에서 일으키는 비정형 기형종/간상 종양(atypical teratoid/rhabdoid tumor)을 치료하는 약제학적 조성물”은 Sirt1 유전자 발현을 억제함으로써 줄기세포(stem cells) 유전자 또는 약물내성 유전자의 발현을 약화시켜 종양줄기세포의 방사선 치료 효과를 더욱 향상시켜 준다. Sirt1 단백질은 성숙한 지방세포에서 지방분해를 촉발시켜 지방함량을 감소시킬 수 있고, 골격근 대사작용 연구에서 검증된 바와 같이, 레스베라트롤 등과 같은 Sirt1 활성제는 Sirt1 유전자 활성화를 통하여 PCG-1α 단백질을 탈아세틸화하여 활성화시키고, 이로써 미토콘드리아 생합성 유전자를 활성화하고 에너지 대사 유전자 참여 제어 효과를 나타낼 수 있다.
Sirt1 유전자는 사람 염색체 10번 염색체에 위치하며 줄기세포핵 및 세포질 내에 분포하고, 분자량이 약 81.7kDa인 Sirt1 단백질로 전사된다. Sirt1 단백질은 제3류 NDA+ 탈아세틸화 계열에 속하며, 단백질의 기전을 제어함으로써 단백질 재생 자극, 항염증 반응, 뉴런 보호, 항세포자살을 일으켜 건강을 회복하고 수명을 연장시키는 효과를 나타낸다.
종래 기술연구에 따르면, Sirt1 단백질은 비공유 단백질-2(uncoupling protein-2, UCP2)의 촉진제와 직접 결합하여 비공유 단백질-2의 발현을 억제함으로써 인슐린 분비 및 당지질 물질대사 제어 효과를 나타낸다. 간세포 배양 연구에서는 Sirt1 단백질이 세포핵 내의 FOXO1과 작용하여 FOXO1을 탈아세틸화시킴으로써, 간장 내의 포도당신합성(gluconeogenesis)을 촉진시켜 세포 생존에 필요한 에너지를 제공할 수 있다. 또한, PCG-1α(PPAR-γ Coactivator 1-α)는 PPAR-γ의 공생 활성제이며, Sirt1 단백질의 기질 중 하나이기도 하다. 정상적인 생리 상황에서 Sirt1 단백질은 PCG-1α와 상호작용하여 PCG-1α의 활성을 강화시킴으로써, 간장 당질 신생 유전자의 발현 및 골격근 지방산 산화 작용을 향상시킨다. 따라서 종래의 다수 표적 약물은 Sirt1 유전자를 표적으로 한다.
또한, 대만 특허 제I406668호 “헬리코박터 파일로리(helicobacter pylori) 생장 억제 및 헬리코박터 파일로리의 위상피세포 염증반응 유발 억제에 사용하는 약제학적 조성물”에 있어서, 헬리코박터 파일로리가 세포핵 인자 κB 활성화를 유도하는 기전을 억제함으로써 헬리코박터 파일로리가 위상피세포의 염증반응을 유발하는 것을 억제하는 효과를 나타낸다. 세포핵 인자 κB(nuclear factor-Kappa B，NF-κB)는 일종의 핵전사 인자로서 이차 분자로 구성된 이합체 단백질이며, 여기에서 이차 분자는 p50, p65, p52, RelB, c-Rel 등의 단백질을 포함한다. 종래의 연구에서 알 수 있듯이, 세포핵 인자 κB는 염증반응, 세포자살, 세포괴사 및 암 생성과 밀접한 관계를 가지고 있다. 세포질에 있어서, 세포핵 인자 κB는 자신을 억제하는 음성조절 단백질(이하 “IκB”이라 함)과 결합하여 세포가 외부에서 자극을 받을 경우 음성조절 단백질이 인산화를 거쳐 기능이 저하되어 활성을 잃으며, 이때 세포핵 인자 κB가 세포핵으로 진입하여 조절인자의 촉진제와 결합하여 상기 유전자의 발현을 활성화시킨다. 예를 들어, 유전자에서 IKK(IκB kinase)가 제거된 큰 쥐에 있어서, 척수에 손상을 입힌 경우 IKK가 IκB를 억제할 수 없기 때문에, NF-κB는 세포핵으로 방출되어 진입하는 경로를 차단하여 손상 후의 염증 반응을 감소시킬 수 있다. 반대로, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 외부 물질 또는 세포 자극 후 방출된 물질이 IκB를 억제할 경우 세포핵 인자 κB는 활성화되어 세포핵으로 진입하여 발현해 염증인자를 생성할 수 있다.
상기 내용을 종합하여 설명하면, Sirt1 단백질 또는 세포핵 인자 κB와 같이 여러 유형의 유전자, 성장인자, 신경통로 등은 모두 표적 약물의 표적이 될 수 있다. 그러나 상기 특허에서 제안한 기술은 단일한 질환에 대해서만 치료 효과를 가지고 있기 때문에 여러 유형의 질환에 동시에 사용할 수 없어 약물 개발의 비용을 증가시킨다. 종래 기술의 단점을 보완하기 위하여, 본 발명에서는 여러 부위, 다원유전자, 다중표적에 사용할 수 있는 폴리펩티드를 제조하여 생리기능의 특성을 조절하는 목적을 달성하고자 한다. 예를 들어 Sirt1 단백질이 세포핵인자 κB의 이차 분자(p65, p52)를 탈아세틸화함으로써 세포핵 인자 κB와 세포핵 내 염증반응 관련 유전자가 결합하지 않도록 하여 종양 괴사 인자 α(TNF-α), IL-1β 등 염증인자 발현을 감소시켜 염증반응을 억제하는 것이다. 본 발명에서는 일종의 약제학적 조성물을 개발하여 관련 질환을 개선 또는 치료하는데 사용할 수 있고 동시에 여러 유형의 치료 효과를 가지도록 함으로써, 공공의 이익을 더욱 확대하면서 개발비용도 절감할 수 있도록 하는 데에 목적을 둔다.
본 발명은 폴리펩티드(polypeptide)를 함유한 생체 여러 부위, 다원유전자, 다중표적을 제어하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 여기에서 상기 폴리펩티드는 번호가 SEQ ID No.1 아미노산 서열이거나 하나 또는 여러 아미노산의 치환, 결실, 보강으로 파생된 상동성 아미노산 서열이다.
또한 본 발명은 상기 약제학적 조성물의 용도에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 생체 여러 부위, 다원유전자, 다중표적을 제어하는 기능을 가지고 있기 때문에, 유효 용량의 상기 약제학적 조성물을 하나의 개체에 투여하여 상기 개체가 가지고 있는 적어도 한 가지 유형의 질환을 치료 또는 예방하는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 실시예에서는 폴리펩티드를 함유한 생체 여러 부위, 다원유전자, 다중표적을 제어하는 약제학적 조성물에 관하여 설명하며, 상기 폴리펩티드는 번호가 SEQ ID No.1 아미노산 서열이거나 또는 하나 또는 여러 아미노산의 치환, 결실, 보강으로 파생된 상동성 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드의 아미노산은 번호가 SEQ ID No.1인 서열이다.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 번호가 SEQ ID No.1인 서열과 유사도가 90%보다 높다.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 다원유전자 조절제이고, 예를 들어 상기 다원유전자는 적어도 하나의 특정 전사인자(transcription factor)를 포함하고, 예를 들어 PCG-1α(PPAR-γ Coactivator 1-α), 세포핵 인자 κB, Sirt1 유전자 또는 상기 적어도 이유전자와 같다.
본 발명의 기타 실시예는 상기 약제학적 조성물의 용도에 관한 것으로서, PCG-1α, 세포핵 인자 κB 또는 Sirt1 유전자 등 염증 전자인자 관련 질환을 치료하는 데에 사용된다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 염증 또는 염증반응을 동반한 질환 치료에 사용된다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 대사증후군 관련 질환 치료에 사용된다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 비만증 치료에 사용된다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 근위축증 예방 또는 치료에 사용된다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 당뇨합병증의 발생을 저하시키는 데에 사용된다.
도 1은 단백질 전기영동을 통하여 박과 식물(cucurbitaceous plant) 추출액에 함유된 혈당 조절가능 폴리펩티드(polypeptide) 상동성 단백질에 속한다는 결과;
도 2는 폴리펩티드 자동합성 장치를 통하여 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 합성한 결과;
도 3은 재조합 생물체 생산플랫폼을 통하여 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 생산한 결과;
도 4의 A는 생체영상을 통하여 각 군의 작은 쥐의 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 활성을 관찰한 결과;
도 4의 B는 각 군의 작은 쥐의 냉발광값 통계분석 결과;
도 5는 냉발광 영상을 통하여 각 군의 작은 쥐의 각 장기에서 방출하는 광자 수를 측정 및 분석한 결과;
도 6은 각 군의 작은 쥐 장기에 대하여 면역염색 분석을 진행한 결과;
도 7의 A는 각 군의 작은 쥐 장기조직에 대하여 H&E 염색을 진행한 결과;
도 7의 B는 각 군의 작은 쥐 장기조직에 대하여 ORO(oil red O stain) 염색을 진행한 결과;
도 8은 A는 각 군의 작은 쥐 장기조직에 대하여 H&E(4-hydroxy-2-noneal) 항체로 면역조직염색을 진행한 결과;
도 8은 B는 각 군의 작은 쥐 장기조직에 대하여 말론디알데히드(malondialdehyde) 항체로 면역조직염색을 진행한 결과;
도 9는 실험군 작은 쥐 및 대조군 작은 쥐의 외관;
도 10은 실험군 작은 쥐 및 대조군 작은 쥐의 지방조직;
도 11은 실험군 작은 쥐 및 대조군 작은 쥐의 지방조직에 대하여 염색을 진행한 결과;
도 12는 실험군 작은 쥐 및 대조군 작은 쥐의 근육조직에 대하여 H&E 염색을 진행한 결과.
별도로 정의를 내린 경우를 제외하고는, 본 발명의 명세서 및 특허청구범위에서 사용한 기술 및 과학적 명사의 의미는 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 의미가 동일하다. 모순되는 부분이 있을 경우 본 발명의 내용을 기준으로 한다.
본 발명에 있어서 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드(polypeptide) 또는 상기 상동성 아미노산 서열은 다원유전자 전사 또는 다중표적 발현의 기능을 가지고 있기 때문에, 상기 폴리펩티드 또는 상기 상동성 아미노산 서열은 다음과 같은 효과를 가지고 있다.
첫째, 생체 여러 부위에 응용되고 다원유전자 표적에 작용한다.
둘째, 염증 또는 염증을 동반한 질환을 치료한다.
셋째, 간지방 침착 질환을 억제한다.
넷째, 지방 축적을 억제하는 효과를 나타한다.
다섯째, 근위축을 예방하는 효과를 나태한다.
여섯째, 당뇨합병증 발생을 감소시키는 효과를 나타낸다.
따라서 유효 용량의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 또는 상기 상동성 아미노산 서열의 약제학적 조성물을 하나의 생명체에 투여함으로써, 상기 다원유전자 전사 또는 다중표적 단백질 발현 관련 질환을 개선 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있는데, 여기에는 지방대사 관련 질환, 근육합성 관련 질환, 염증인자 관련 질환 등이 포함되는데, 구체적으로는 염증반응, 근위축증, 비만증, 대사증후군, 지방간 등이 있다.
본 발명에 있어서 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 또는 상기 상동성 아미노산 서열은 식물추출법, 인공합성방식, 재조합 생물체 생산플랫폼 또는 상기 두 가지 이상의 방법을 조합하여 획득할 수 있다.
상기 “상동성 아미노산 서열”은 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 다수 개의 아미노산을 치환, 결실, 보강하여 파생시킨 아미노산 서열을 말한다.
상기 “식물추출법”은 각기 다른 용매의 각기 다른 용해도를 이용하여 식물에서 상기 물질을 분리해 내는 것을 말하며, 여기에서 분리정제 기술은 본 발명이 속한 분야의 당업자가 알고 있는 일반적인 기술이며, 예를 들어 단백질 전기영동 분리법을 이용하여 특정 크기의 폴리펩티드를 분리해내거나 액체크로마토그래피를 이용하거나 각기 다른 크기의 여과막을 이용하여 분리할 수 있다. 종래 기술연구에 따르면, 박과 식물(cucurbitaceous plant) 추출액에서 혈당 조절이 가능한 여러 유형의 폴리펩티드를 획득할 수 있는데 여기에는 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 또는 상기 상동성 폴리펩티드가 포함되고, 박과 식물에는 고과(balsam pear), 산고과(dioecism momordica root), 호박, 수박, 오이, 조롱박, 천화분(radices trichosanthis)이 포함되나 이에 한정되지 않으며, 단백질 전기영동을 통하여 박과 식물의 추출액에 함유된 혈당을 조절할 수 있는 폴리펩티드가 상동성 단백질이라는 것이 증명되었으며, 이는 도 1에서 도시하는 바와 같다. 또한, 본 발명에 있어서 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 또는 상기 상동성 폴리펩티드는 박과 식물이 아닌 다른 식물의 추출물에서도 획득할 수 있는데, 예를 들어 백일홍(Zinnia elegans), 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula), 자몽, 포도, 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra), 벼, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 또는 상기 적어도 임의의 두 가지 식물의 조합 등이 될 수 있다. 여기에서 알 수 있듯이 본 발명에 있어서 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 또는 상기 상동성 폴리펩티드의 출처는 박과 식물에 의해 제한되지 않는다.
상기 “인공합성방식”은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 일반적으로 알고 있는 기술로서, 인공방식을 통하여 아미노산을 서열에 따라 연결하나 하나의 폴리펩티드로 합성하는 것이며, 여기에서 인공합성방식에는 화학합성법 및 펩티드 합성기가 포함된다. 인공합성법은 일반적으로 합성과정에서 폴리펩티드의 1차 구조를 편리하게 변경하고, 특수한 아미노산을 첨가하며, 폴리펩티드의 말단을 수정할 수 있는 등의 장점을 가지고 있다. 일반적으로 화학합성법은 고상 펩티드 합성법 및 액상 펩티드 합성법으로 나눌 수 있으며, 여기에서 액상 합성법은 반드시 각 하나의 아미노산을 연결한 후 추출을 진행한다. 그러나 추출하여 획득한 폴리펩티드 중간산물은 통상적으로 혼합물이기 때문에 크로마토그래피 정제 단계를 진행해야 하므로, 액상 합성을 통하여 폴리펩티드를 합성할 경우 반드시 번거로운 추출 및 크로마토그래피 정제 단계를 거쳐야만 고순도의 산물을 획득할 수 있다. 고상 합성법은 용매 내에서 고체 중합체 과립(또는 중합 지지물)에 펩티드의 결합반응을 진행한다. 상기 방법은 먼저 폴리펩티드의 N단 아미노산을 중합체 과립 상에 공유결합한 후, 다시 특이결합을 통하여 후속 아미노산을 서열에 따라 연결하고, 마지막으로 상기 폴리펩티드를 합성한다. 상기 중합체 과립은 용매에 용해되지 않기 때문에, 반응이 종료된 후에는 세정 및 여과 작업을 진행하여 상기 중합체 과립( 및 상기 중합체 과립 상에 연결되는 폴리펩티드)을 반응시약 및 부산물과 분리할 수 있다. 따라서 고상 펩티드 합성법은 중간산물을 정제할 필요가 없기 때문에 수율이 비교적 높고 반응시간을 대폭 단축시킬 수 있으므로, 긴사슬 폴리펩티드의 합성에 있어서 비교적 우수한 장점을 가지고 있어 종래에 있어서 가장 광범위하게 사용되는 펩티트 합성방법이다.
상기 “재조합 생물체 생산플랫폼”은 바이오기술로 특정 단백질을 발현하는 핵산을 이용하여 발현벡터에 구축하고, 다시 상기 재조합 발현벡터를 대장균, 효모균, 유산균 등과 같은 숙주세포로 형질전환하며, 상기 재조합 발현벡터를 상기 숙주세포 내에서 상기 핵산을 발현하도록 함으로써 상기 특정 단백질을 획득할 수 있는 것을 말한다.
상기 “유효 용량” 원하는 특정 효과를 나타내기 위하여 필요한 화합물 또는 활성성분의 양을 말하는 것으로서, 조성물에서 차지하는 중량백분율로 표시한다. 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 바와 같이, 상기 유효 용량은 특정 효과를 일으키기 위하여 투입하는 방식에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 활성성분 또는 화합물의 조성물 내에서 차지하는 양은 상기 조성물 중량의 약 1% 내지 약 100%일 수 있으며, 비교적 바람직하게는 약 30% 내지 100%이다.
상기 “약제학적 조성물”은 유효 용량을 함유한 특정 효과를 나타내는 데에 필요한 화합물 또는 활성성분 및 적어도 하나의 약제학적으로 수용할 있는 벡터를 말한다. 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 바와 같이, 약제학적 조성물의 형태는 일으키려는 특정한 효과의 투입 방식에 따라 알약, 가루약, 주사제 등으로 달라질 수 있으며, 상기 벡터는 약제학적 조성물의 형태에 따라 고상, 반고상 또는 액상일 수 있다. 예를 들어, 벡터에는 젤라틴, 유화제, 탄화수소 혼합물, 물, 글리세린, 생리식염수, 완충생리식염수, 라놀린(lanolin), 파라핀, 밀랍, 디메티콘(dimethicone), 에탄올을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 “하나” 또는“상기”는 본 발명의 명세서 및 특허청구범위에서 별도의 설명이 있는 경우를 제외하고는 하나 및 하나 이상의 수치를 포함하는 것을 말한다.
아래에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 여러 가지 효능을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 아래 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시에 불과하며, 여기에서 사용된 임의의 용어는 본 발명의 명세서 및 특허청구범위 및 의미를 제한하지 않는다. 또한 아래 실시예의 동물실험은 모두 중국의약대학 동물보호관리 및 사용위원회 윤리위원회로부터 동의를 이미 구하였다.
실시예 1
아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 제조
본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 가지고 있는 일반적인 지식에 의거하여 고상 합성법 또는 재조합 생물체 생산플랫폼 또는 식물추출법 등의 방법을 이용하여 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 제조한다.
여기에서 고상 펩티드합성기, 액상 펩티드합성기 및 마이크로파 펩티드합성기 등과 같이 현재 시판되고 있는 폴리펩티드 자동합성장치에 있어서, 선택하여 합성하려는 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 볼 수 있으며, 이는 도 2에서 도시하는 바와 같다.
재조합 생물체 생산플랫폼의 방식을 통하여, 본 발명의 폴리펩티드를 전사할 수 있는 핵산을 함유한 발현벡터를 숙주세포에 위치시키고, 상기 핵산 분자가 숙주세포에서 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 발현하도록 하며, 이는 도 3에서 도시하는 바와 같고, 여기에서 상기 숙주세포는 대장균 또는 효모균일 수 있으며, 상기 발현벡터는 pQStrep2, pQStrep4, pGEX-6p1 또는 pQTEV 등과 같이 시판되는 일반적인 벡터일 수 있다.
고과의 경우, 먼저 고과추출액을 획득한 후 다시 단백질 전기영동 정제법 또는 크로마토그래피 정제 단계 등과 같이 일반적인 기술을 이용하여 상기 고과추출액에서 본 발명의 폴리펩티드를 추출하고, 벤조산나트륨(sodium benzoate), 살리실산(salicylic acid) 등과 같은 방부제를 첨가해야 하며, -80℃에서 상기 폴리펩티드를 보관한다. 추출액을 획득하는 단계는 다음과 같다. 먼저, 용매에 고과를 해리(maceration)하여 거친 현탁액을 획득하고, 상기 용매는 인산염 완충액, 구연산염 완충액 또는 물 등일 수 있으며, 교반기 또는 연마기를 이용하여 고과를 해리할 수 있다. 이어서 12,000rpm(revolution per minute) 내지 15,000rpm으로 원심분리 회전하고, 거친 현탁액의 과립을 액상에서 제거하며, 구경(caliber)이 0.1미크론 내지 0.5미크론인 여과재로 상청액을 여과한다. 그 후 획득한 여과액을 1kDa의 여과막에 통과시켜 상기 상청액 부분을 취하고, 10kDa의 여과막을 통과시켜 상기 상청액 부분을 취하면, 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 수용성 고과추출액을 획득할 수 있다. 여기에서 상기 여과막은 본 발명이 속한 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 여과재 제품으로서 Amicon 여과막 및 Millipore 여과막 등이 있다.
실시예 2
폴리펩티드를 생체 내 여러 부위, 다원유전자 표전 반응에 사용
본 실시예에서는 아래 재료를 채택한다.
(A) 실험대상: 아래 동물실험은 모두 중국의약대학 동물보호관리 및 사용위원회의 윤리위원회로부터 동의를 구하였다. FVB 품종의 작은 쥐를 사용하여 실험을 진행하며, 상기 작은 쥐는 모두 국가실험동물센터(National Laboratory Animal Center)에서 제공하였다.
(B) 폴리펩티드: 실시예 1에서 제조한 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1의 폴리펩티드를 사용한다.
FVB 품종의 작은 쥐를 대조군과 실험군의 두 가지 군으로 나누고, 실험군의 작은 쥐에게는 2.5m㏖/㎏의 본 발명의 아미노산 서열 번호 SEQ ID No.1을 함유한 폴리펩티드 용액(20마이크로리터)을 연속 7일간 투여하고; 대조군의 작은 쥐에게는 20마이크로리터의 인산염 완충액을 투여한다. 실험을 종료하고, 각 상기 군의 작은 쥐의 공장(jejunum), 근육, 지방, 간장, 신장 등 조직을 적출한 후, 시스템생물학을 이용하여 여러 장기, 다중표적에 대한 분석을 진행한다. 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 일반적으로 사용하는 DNA 마이크로어레이(DNA microarray)를 통하여 모든 유전체에서 제어를 받는 유전자 종류를 관측할 수 있으며, 더 나아가 바이오정보 소프트웨어를 통해 영향 및 작용 경로가 어떠한지 분석할 수 있기 때문에 마이크로어레이와 유전자 발현 프로파일링을 통하여 작용기전을 연구함으로써, 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드의 영향을 받는 유전자를 관찰할 수 있다. 상세한 작동 프로세스는 아래와 같다.
(1) RAN 샘플은 RNeasy Mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 세포 total RNA의 추출을 진행한다. 이어서, Beckman DU800 분광 광도계(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 total RNA의 양을 결정하고, A260/A280 비교값이 1.8보다 큰 샘플은 Agilent 2100 바이오분석기(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 상기 total RNA의 품질을 평가한다. 샘플의 RAN integrity number가 8.0보다 큰 경우에만 아래의 마이크로어레이 실험분석에 사용할 수 있다.
(2) DNA 마이크로어레이 실험분석: DNA 마이크로어레이 실험분석은 청(Cheng) 등(2007)의 보고에서 설명된 바와 같다. 간단하게 설명하면, total RAN(5μg)을 먼저 MessageAmpTM aRNA kit(Ambion)로 이용하여, 시험관 내 전사(in vitro transcription)의 단계를 거쳐 확대한다. 확대한 RNA(amplified RNA, aRNA)는 다시 Cy5 염색제와 화학반응을 진행하고, Cy5 염색제를 aRNA에 표지하여 aRNA가 형광 표지의 표적물이 되도록 한다. 형광 표지를 완료한 후 커버글라스와 화롄(HUALIAN)회사에서 제공한 혼성화 완충용액(hybridization buffer)을 이용하여, 형광 표지한 표적물을 Whole Genome OneArrayTM과 혼성화 반응을 진행한다. 50℃에서 하룻밤 동안 혼성화 반응을 진행한 후, 3회 세정 단계를 통하여 비특이성 결합의 표적물을 웨이퍼에서 제거한다. 이어서 웨이퍼를 원심분리 방식으로 건조시키고 Axon 4000 스캐너(㏖ecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 형광 강도의 스캐닝을 진행한다. genepix 4.1 소프트웨어(㏖ecular Devices)를 사용하여 웨이퍼에서 각 스팟의 Cy5 형광 강도에 대하여 분석을 진행한다. 각 스팟의 신호는 주위 배경값을 제거하는 방식으로 상기 강도를 교정하였다. 우리는 내부 제어의 프로브(probe)를 삭제하거나 신호대잡음비(signal-to-noise ratio)가 0보다 작도록 하였다. 상기 기준점을 통하여 R패턴의 limma package로 정규화(normalization)(Smyth, 2005)를 진행하였다.
(3) 바이오정보 소프트웨어를 이용하여 작용기전 및 영향 경로를 분석: 의학주제표목(Medical Subject Headings, MeSH)(http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html), BiblioSphere Pathway Edition 등 소프트웨어와 같은 바이오정보 소프트웨어를 이용하여 발현에 차이가 있는 유전자 작용기전, 영향 경로 및 질환과의 연관성을 분석한다.
각 경로에서 획득한 분석 결과는 표 1에서 도시하는 바와 같으며, 표 1의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 확실히 개체의 여러 부위, 다중 유전자 표적에서 반응을 일으킬 수 있고, 신경통로 및 질환에 영향을 미칠 수 있다.
[표 1]
여러 부위에서 영향을 미치는 경로 또는 질환의 유전자 분석 결과
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
실시예 3
폴리펩티드를 염증 또는 염증반응을 동반한 질환 치료에 사용
본 실시예에 있어서, 각각 동물 생체 내의 냉발광 영상 측정, 동물 생체 외의 냉발광 영상 측정, 면역조직 염색 분석을 진행하여 효과를 확인하고, 여기에서 아래와 같은 재료를 채택한다.
(A) 실험대상: 세포핵 인자 -κB(NF-κB) 제어를 받는 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase, luc) 유전자 변이 쥐와 야생형 작은 쥐 F1을 교배하여, FVB 유전 특성을 가진 NF-κB/luc 이형접합체 유전자 변이 작은 쥐를 생산하여 실험을 진행한다.
(B) 폴리펩티드: 실시예에서 획득한 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 사용한다.
(1) 동물 생체 내의 냉발광 영상 측정
6 내지 8주령의 암컷 유전자 변이 총 15마리를 무작위로 3군으로 나누고, 여기에서 제1군은 비교군(blank group), 제2군은 대조군, 제3군은 실험군이다. 복강내주사 방식으로 제2군 및 제3군의 각 상기 작은 쥐에게 4㎎/㎏의 지질다당류 염증반응 유발물질(lipopolysaccharide, LPS) 용액(100마이크로리터)을 투여하고, 제1군의 각 상기 작은 쥐에게 100마이크로리터의 인산염 완충액을 투여한다. 5분 후 제3군의 각 상기 작은 쥐에게 0.5㎎/㎏의 상기 폴리펩티드 용액 20마이크로리터를 투여하고, 제1군 및 제2군의 각 상기 작은 쥐에게 20마이크로리터의 물을 투여한다. 4시간 후 각각 생체 영상을 통하여 각 상기 작은 쥐의 레닐라 루시퍼라아제 활성을 관찰한다.
상세하게 설명하면, 먼저 복강내주사를 통하여 상기 각 군의 각 상기 작은 쥐에게 150㎎/㎏의 루시페린(luciferin)을 투여한다. 5분 후 이소플루란(isoflurane)으로 각 상기 군의 작은 쥐를 마취시키고, 각 상기 군 작은 쥐의 복부가 위를 향하도록 IVIS 영상시스템 200시리즈(IVIS Imaging System_ 200 SeriesXenogen, Hopkinton, MA)의 촬영공간 내에 위치시키고, 카메라를 가장 높은 민감도에서 1분간 촬영한다. 생체 영상 소프트웨어(Living Images software, Xenogen, Hopkinton, MA)를 이용하여 조직에서 방출하는 광자 수의 양을 측정하고, 유전자 변이 작은 쥐에서 방출하는 광자 수의 양을 측정한 결과는 도 4에서 도시하는 바와 같으며, 여기에서 신호강도는 조직에서 측정한 총 광자 수로 계산하고, 신호강도의 결과는 초당 광자 수(photons/sec)로 나타낸다. 또한 각 상기 군의 작은 쥐의 냉발광값을 비교 및 분석한 결과는 도 B에서 도시하는 바와 같다.
종래의 문헌자료에서 알 수 있듯이 NF-κB/luc 이형접합체 유전자 변이 작은 쥐는 지질다당류를 거쳐 유도된 후 확실히 상기 내부 세포핵인자 κB를 활성화시킬 수 있고, 세포핵인자 κB 전사인자와 세포핵인자 κB 신호전달경로 활성화는 면역반응을 조절하는 데에 있어서 중요한 역할을 하며, 세포핵인자 κB가 활성화될 경우 염증반응 관련 인자의 유전자 발현을 자극할 수 있다. 도 4의 A 및 B 결과에서 알 수 있듯이, 제1군의 평균 냉발광값은 2.92×107photons/sec이고, 제2군의 발광 신호강도는 제1군보다 강하고, 상기 평균 냉발광값은 31.97×107photons/sec이며, 제2군에 비하여 제3군의 발광 강도는 뚜렷하게 떨어지고, 상기 평균 냉발광값은 19.82×107photons/sec이다. 따라서 상기 생체 영향의 결과에서 알 수 있듯이, 지질다당류는 확실히 유전자 변이 쥐에 염증반응을 유발할 수 있으며, 상기 복부가 현저한 냉발광 활성을 가지도록 할 수 있고, 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 처리를 거친 후, 유전자 변이 쥐 복부의 냉발광 활성을 저하시킬 수 있다. 지질다당류는 유전자 변이 작은 쥐의 냉발광값을 10.95배 상승시킬 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드는 냉발광값을 약 38% 억제비율까지 도달시킬 수 있다.
상기 내용에 의거하여, 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드는 세포핵인자 κB의 활성을 저하시킴으로써, 생체 내에서 외부 자극으로 인한 급성 전신 염증반응을 효과적으로 억제할 수 있는 효능을 나타낼 수 있다.
(2) 동물 생체 외의 냉발광 영상 측정
실시예 1의 각 상기 군 작은 쥐에게 먼저 복강내주사 방식으로 150㎎/㎏의 루시페린을 투여하며, 5분 후 각 상기 군 작은 쥐를 희생시키고 뇌, 심장, 폐, 간, 비장, 위, 신장, 난소 및 장을 포함한 상기 조직을 신속하게 적출한다. 생체 영상의 설정은 실시예 2와 동일하게 하고, 각 상기 군 작은 쥐에서 적출한 장기를 각각 IVIS 영상시스템 200시리즈의 촬영공간에 위치시킨 후 사진을 촬영하며, 생체 영상 소프트웨어를 이용하여 조직이 방출하는 광자 수의 양을 측정한 결과는 도 5에서 도시하는 바와 같고, 여기에서 신호강도는 조직에서 측정한 총 광자 수로 계산하며, 신호강도의 결과는 초당 광자 수(photons/sec)로 나타낸다. 도 5의 결과에서 알 수 있듯이 각 상기 군 작은 쥐의 각 장기 내의 냉발광도는 각기 다르게 나타나며, 여기에서 난소를 제외하고, 대조군 작은 쥐의 기타 각 상기 장기에서 측정한 냉발광도는 비교군 작은 쥐에서 획득한 것보다 현저하게 증가하였다. 대조군 작은 쥐에 비하여, 실험군 작은 쥐는 폐, 간, 신장, 장 등의 장기에서 측정한 냉발광도가 현저하게 하락하였다.
폴리펩티드가 염증반응을 저하시키는 주요 표적 장기를 더욱 잘 이해하기 위하여, 각 상기 군의 각 장기의 냉발광값은 배율(Fold change)로 나타나고, 이는 표 2 및 표 3에서 도시하는 바와 같고, 여기에서 표 2의 배수 변화=제2군 평균 냉발광값÷제1군 평균 냉발광값이고, 표 3의 배수 변화=제3군 평균 냉발광값÷제2군 평균 냉발광값이다.
[표 2]
각 군 작은 쥐의 장기 광영상 배율의 결과
Figure pat00006
[표 3]
각 군 작은 쥐의 장기 광영상 배율의 결과
Figure pat00007
상기 결과에서 알 수 있듯이, 지질다당류는 유전자 변이 쥐 내의 장기에 확실히 염증반응을 일으킬 수 있기 때문에, 상기가 뚜렷한 냉발광 활성을 나타내도록 한다. 그러나 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 투여를 통하여 폐, 간, 신장, 장 등과 같은 장기의 냉발광 활성을 떨어뜨릴 수 있는데, 이것은 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드가 확실히 지질다당류가 유발하는 세포핵인자 κB의 활성을 저하시킬 수 있으므로 장기의 염증반응을 억제하는 효능이 있다는 것을 나타낸다.
(3) 면역조직염색 분석
본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 알고 있는 기술에 의거하여, 각 상기 군 작은 쥐에서 적출한 장기에 대하여 파라핀 포매 처리를 진행하고, 파라핀 포매 처리를 한 장기를 5-μm의 슬라이스로 절단하며, 자일렌으로 탈랍하고, 다시 알코올로 탈수한 후, 3%의 과산화수소용액을 15분간 작용시키며, 내인성 과산화효소의 활성을 제거한 후, 실온에서 1%의 우형철 단백질로 1시간 작용시키고, 비특이성 연결 사슬을 차단한 후, 50배 희석한 p56, TNK-α 또는 IL-1β의 작은 쥐 단일클론항체에 대하여 4℃에서 16 내지 18시간 작용시키고, 이튿날에 바이오틴화(biotinylated)된 이차 항체(Zyme㎗aboratories, South San Francisco, CA)를 실온 하에서 20분간 방치한다. 마지막으로, 각 상기 절편을 아비딘-비오틴 복합체(avidin-biotin complex) 시약에 위치시키고, 조작방법(Histostain®-Plus Kit, Zymed Laboratories, South SanFrancisco, CA)의 단계에 의거하여 비페닐-3,3',4,4-테트라민(Biphenyl-3,3',4,4'-tetraamine)으로 염색을 진행한 결과는 도 6에서 도시하는 바와 같다.
도 6의 결과에서 알 수 있듯이, 비교군 작은 쥐의 조직 슬라이스에 비하여, 지질다당류의 유도를 거친 대조군은 상기 조직 슬라이스 내에 거의 갈색을 띠는 TNF-α 및 IL-1β와 반응하는 세포를 가지고 있고, 갈색 영역이 뚜렷하게 증가했다. 그러나 실험군 작은 쥐의 조직 슬라이스에서는 TNF-α 및 IL-1β와 반응하는 갈색 구역이 대조군 작은 쥐의 조직 슬라이스보다 현저히 적었다. 종래 문헌자료에서는 이미 TNF-α 및 IL-1β가 급성 염증기 및 염증반응 유발을 촉진하는 염증 호르몬이라는 것이 밝혀졌기 때문에 상기 결과는 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드가 염증세포 호르몬의 생성 촉진을 억제함으로써, 지질다당류가 유도하는 염증현상을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4
폴리펩티드를 간지방 침착 질환을 억제하는 데에 사용
본 실시예에서는 아래 재료를 채택한다.
(A) 실험대상: FVB 품종의 작은 쥐를 사용하여 실험을 진행하며, 상기 작은 쥐는 모두 국가실험동물센터에서 제공하였다.
(B) 폴리펩티드: 실시예 1에서 제조한 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1의 폴리펩티드를 사용한다.
FVB 품종의 작은 쥐 30마리를 무작위로 3군으로 나누고, 여기에서 제1군은 비교군이고, 제2군은 고지방 사료를 먹인 대조군이며, 제3군은 고지방 사료를 먹인 실험군이고, 매주 복강내주사 방식으로 각 상기 작은 쥐에게 10m㏖/㎏의 본 발명의 아미노산 서열 번호 SEQ ID No.1을 함유한 폴리펩티드 용액(100마이크로리터)을 연속 4주간 투여하고; 제1군 및 제2군 중 각 상기 작은 쥐에게는 100마이크로리터의 인산염 완충액을 투여한다.
실험이 종료한 후, 각 상기 군 작은 쥐의 간 조직을 적출한 후 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 알고 있는 방법에 의거하여, 각 상기 군 작은 쥐의 간조직을 각각 H&E 염색 및 ORO(Oil Red O)로 염색하여 상기 내부 지방 축적의 형태를 관찰한 결과는 각각 도 7의 A 및 B에서 도시하는 바와 같다. 또한 상기 실시예 3에 있어서 상기 면역조직염색 단계와 같이, 각각 4-하이드록시노네날(4-hydroxynonenal, HNE) 항체 및 말론알데히드(malonaldehyde, MDA) 항체로 각 상기 군 작은 쥐의 간조직에 대하여 면역조직염색을 진행하고, 각 군 작은 쥐 간조직의 과산화지방질 산물을 검측하는 데에 이용하며, 상기 결과는 도 8의 A 및 B에서 도시하는 바와 같다.
도 7의 결과에서 알 수 있듯이, 제1군의 작은 쥐에 비하여 제2군 작은 쥐의 간조직에서 지방액포가 뚜렷하게 발생했고, 대량의 지방 축적이 있었다. 제3군 작은 쥐의 간조직은 제2군 작은 쥐에 비해 지방 축적이 비교적 적었다.
도 8의 결과에서 알 수 있듯이, 제2군 작은 쥐의 간조직에서는 제1군 작은 쥐보다 4-하이드록시노네날 및 말론디알데히드와 같은 과산화지방질 산물이 비교적 많았고, 제2군 작은 쥐에 비해 제3군 작은 쥐의 간조직에서는 과산화지방질 산물이 현저하게 감소했다.
종래의 기술문헌에서 알 수 있듯이, 세포 내에 과산화지방질 산물이 과도하게 많은 경우 세포병변, 섬유화 등 세포 손상이 발생할 수 있고, 4-하이드록시노네날 및 말론디알데히드는 과산화지방질 산물이며, 세포 산화 손상의 검측 표적이다. 따라서 상기 결과에서 알 수 있듯이 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 투여함으로써 간조직 내 지방 축적을 효과적으로 개선할 수 있고, 간조직 세포 내 과산화지방질의 함량을 감소시킬 수 있다 .다시 설명하면, 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드는 간지방 또는 간손상으로 인한 질환을 치료하는 데에 사용될 수 있다.
실시예 5
폴리펩티드를 간지방 축적을 억제하는 데에 사용
본 실시예에서는 아래 재료를 채택한다.
(A) 실험대상: 유전자 손상으로 인하여 복구 지방이 대량 축적된 작은 쥐를 실험에 이용하고, 상기 작은 쥐는 모두 국가실험동물센터에서 제공하였다.
(B) 폴리펩티드: 실시예 1에서 제조한 것으로서 표 1에서 도시하는 아미노산 서열 번호를 가진 폴리펩티드를 사용한다.
작은 쥐를 대조군과 2군의 실험군으로 나누고, 매주 복강내주사 방식으로 실험군의 작은 쥐에게 각각 2.5m㏖/㎏의 본 발명의 아미노산 서열 번호 SEQ ID No.1을 함유한 폴리펩티드 용액(100마이크로리터)을 2차례 연속 4주간 투여하고; 대조군에는 각 작은 쥐에게 100마이크로리터의 인산염 완충액을 투여한다.
진행 기간 동안 정기적으로 각 상기 군 작은 쥐의 체중, 사료섭취량을 측정하고, 실험이 종료한 후, 각 상기 군 작은 쥐의 외관을 관찰하고, 각 군 작은 쥐의 지방조직을 적출한 후 중량을 측정하며, 슬라이스 염색을 이용하여 지방세포의 수량과 크기를 판단하고, 그 결과는 도 9 내지 도 12에서 도시하는 바와 같다. 각 상기 군 작은 쥐의 체지방 비율을 더욱 상세하게 계산하기 위한 계산공식은 (지방중량÷체중)X100%이며, 그 결과는 표 4에서 도시하는 바와 같다.
[표 4]
각 군 작은 쥐의 체중, 사료섭취량, 지방중량 및 체지방
Figure pat00008
표 4 및 도 9 내지 도 11의 결과에서 알 수 있듯이, 비록 대조군 작은 쥐와 실험군 작은 쥐가 실험 전후 중량 및 실험과정 중의 섭식량에서 모두 뚜렷한 차이가 없었으나, 실험군 작은 쥐의 지방중량 및 체지방은 대조군 작은 쥐보다 현저하게 감소하였다. 여기에서 알 수 있듯이, 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드가 지방의 생성 및 합성에 확실히 영향을 미칠 수 있기 때문에, 대사증후군을 치료 또는 예방하는 효능을 나타낼 수 있다.
실시예 6
폴리펩티드를 근위축을 예방하는 데에 사용
본 실시예에서는 아래 재료를 채택한다.
(A) 실험대상: 유전자 손상으로 인하여 복구 지방이 대량 축적된 작은 쥐를 실험에 이용하고, 상기 작은 쥐는 모두 국가실험동물센터에서 제공하였다.
(B) 폴리펩티드: 실시예 1에서 제조한 것으로서 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 사용한다.
실시예 5의 각 상기 작은 쥐의 근육조직을 적출한 후, 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 통상적으로 알고 있는 방법에 의거하여, 각 상기 군 작은 쥐 근육조직에 대하여 H&E 염색을 진행하여 상기 근육세포의 수량과 크기를 관찰하며, 그 결과는 도 12에서 도시하는 바와 같다.
도 12의 결과에서 알 수 있듯이, 대조군 작은 쥐는 뚜렷하게 근위축 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 폴리펩티드를 투여한 실험군 작은 쥐의 근위축이 뚜렷하게 개선되었다. 여기에서 알 수 있듯이 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드는 확실히 근육의 생성 및 합성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 근위축 관련 질환을 예방 또는 치료하는 효능을 나타낼 수 있다.
실시예 7
폴리펩티드를 당뇨증 및 당뇨합병증 발생을 저하시키는 데에 사용
본 실시예에서는 아래 재료를 채택한다.
(A) 실험대상: NOD mice(Non-obese diabetic mice)의 작은 쥐를 사용하여 실험을 진행하고, 상기 작은 쥐는 모두 국가실험동물센터에서 제공하였다.
(B) 폴리펩티드: 실시예 1에서 제조한 것으로서 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 사용한다.
23마리의 작은 쥐를 4군으로 나누고, 아래 조건에 따라 20주간 사육한다. 제1군은 대조군으로 총 6마리이며, 매일 각 상기 작은 쥐에게 20마이크로리터의 인산염 완충액을 투여하고; 제2군은 총 6마리이며, 매일 경구투여 방식으로 각 상기 작은 쥐에게 0.01μ㏖/㎏의 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 용액(20마이크로리터)을 1회 투여하고; 제3군은 총 6마리이며 매일 경구투여 방식으로 각 작은 쥐에게 0.1μ㏖/㎏의 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 용액(20마이크로리터)을 1회 투여하고; 제4군은 총 5마리이며 매일 경구투여방식으로 각 작은 쥐에게 1μ㏖/㎏의 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드 용액(20마이크로리터)을 1회 투여한다.
진행 기간 동안 정기적으로 각 상기 군 작은 쥐의 생존율, 당뇨병 유발율 및 안구병변을 측정하고, 그 결과는 표 5에서 도시하는 바와 같다. 실험이 종료한 후 각 상기 군 작은 쥐의 혈액 샘플을 취하여 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 통상적으로 알고 있는 방법에 의거하여, 각 상기 군 작은 쥐 혈액에 대해 혈청 생화학 검사를 진행하였으며, 그 결과는 표 6에서 도시하는 바와 같다.
[표 5]
각 군 작은 쥐의 생존률, 당뇨병 유발율 및 안구병변
Figure pat00009
표 5의 결과에서 알 수 있듯이, 제1군 작은 쥐의 생존율은 4/5(66.67%)이고, 제2군, 제3군, 제4군 작은 쥐의 생존률은 각각 6/6(100%), 6/6(100%), 5/5(100%)이다. 제1군 작은 쥐의 당뇨병 발병률은 2/6(33.33%)이고, 제2군, 제3군, 제4군 작은 쥐의 당뇨병 발병률은 각각 0/6(0%), 0/6(0%), 1/5(20%)이다. 또한, 당뇨합병증인 안구병변은 제1군 작은 쥐의 발병률은 3/6(50%)이고, 제2군, 제3군, 제4군 작은 쥐의 당뇨병 발병률은 각각 0/6(0%), 1/6(16.66%), 1/5(20%)이다. 상기 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 폴리펩티드를 투여하면 개체의 생존율을 효과적으로 향상시킬 수 있고, 당뇨병 및/또는 합병증의 발생을 저하시킬 수 있는데, 예를 들어 안구병변 또는 시장병변 등과 같은 질환이 있다.
[표 6]
각 상기 군 작은 쥐의 혈청 생화학 검사
Figure pat00010
표 6의 결과에서 알 수 있듯이, 제1군 작은 쥐의 혈중 요소질소(BUN)는 40.50±4.54㎎/㎗이고, 제2군, 제3군, 제4군 작은 쥐의 혈중 요소질소는 각각 37.38±2.77, 38.50±4.69, 35.88±6.33㎎/㎗이다. 제 1군 작은 쥐의 혈청크레아티닌(Creatinine)은 0.70±0.05㎎/㎗이고, 제2군, 제3군, 제4군 작은 쥐의 혈청크레아티닌은 각각 0.64±0.12, 0.69±0.06, 0.69±0.06이다. 상기 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 폴리펩티드는 혈중 요소질소와 혈청크레아티닌의 함량을 뚜렷하게 감소시키고, 투여 용량을 증가시킬수록 감소 효과가 더욱 뚜렷한 것으로 나타났다.
표 5 및 표 6의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드를 투여함으로써 개체의 생존율, 당뇨병 발병율, 당뇨합병증 및 신장 손상 등을 확실히 개선할 수 있기 있다. 따라서 본 발명의 아미노산 서열 번호가 SEQ ID No.1인 폴리펩티드는 당뇨병 또는/및 당뇨합병증을 치료 또는 예방하는 효능을 가지고 있다.
각 상기 실시예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 것으로서, 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 본 발명의 기본 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명에 대하여 진행한 임의의 수정 또는 변경은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.

Claims (11)

  1. 폴리펩티드 번호가 SEQ ID No.1 아미노산 서열이거나 하나 또는 여러 아미노산의 치환, 결실, 보강으로 파생된 상동성 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드(polypeptide)를 함유한 생체 여러 부위, 다원유전자, 다중표적을 제어하는 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 아미노산은 번호가 SEQ ID No.1인 서열인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 번호가 SEQ ID No.1인 서열과 유사도가 90%보다 높은 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 다원유전자 조절제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 다원유전자는 적어도 하나의 특정 전사인자(transcription factor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 전사인자는 PCG-1α(PPAR-γ Coactivator 1-α), 세포핵 인자 κB, Sirt1 유전자로 조성된 군에서 선택된 약제학적 조성물.
  7. 근위축증 치료에 사용되는 제 1항의 상기 약제학적 조성물의 용도.
  8. 염증 또는 염증반응을 동반한 질환 치료에 사용되는 제 1항의 상기 약제학적 조성물의 용도.
  9. 대사증후군 관련 질환 치료에 사용되는 제 1항의 상기 약제학적 조성물의 용도.
  10. 비만증 치료에 사용되는 제 1항의 상기 약제학적 조성물의 용도.
  11. 제 1항에 있어서,
    당뇨합병증의 발생을 저하시키는 데에 사용되는 제 1항의 상기 약제학적 조성물의 용도.
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