CN105363020A

CN105363020A - 多胜肽用于制造活体多效应的医药组合物的用途

Info

Publication number: CN105363020A
Application number: CN201410487653.7A
Authority: CN
Inventors: 侯庭镛; 项千芸
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2014-08-25
Filing date: 2014-09-22
Publication date: 2016-03-02
Also published as: KR20200116073A; ES2745294T3; MY190709A; EP2990050A1; KR20160024718A; TW201607955A; KR20200116074A; JP2016044172A; KR20180039589A; JP6116539B2; TWI580690B; KR20210153015A; US20160051620A1; US20180369318A1; EP2990050B1

Abstract

本发明揭露氨基酸序列编码为SEQ？ID？No.1的多胜肽或其同源性氨基酸序列的用途。由于本发明所揭氨基酸序列编码为SEQ？ID？No.1的多胜肽或其同源性氨基酸序列具有调控多基因转录或多靶点表现的能力，因此，该多胜肽或其同源性氨基酸序列具有下列功效：其一、应用于个体多部份，作用于多基因靶点；其二、治疗发炎或含有发炎反应的病症；其三、抑制肝脏脂肪沉积的病症；其四、抑制脂肪堆积的功效；其五、预防肌肉萎缩的功效；其六、降低糖尿病并发症。

Description

多胜肽用于制造活体多效应的医药组合物的用途

技术领域

本发明涉及一种以多胜肽用于制造调控多部位、多基因、多靶点的医药组合物的用途，其中，该多胜肽具有编码为SEQIDNo.1的序列或其进行一个或多个氨基酸的取代、删除、添加所衍生的同源性氨基酸序列。

背景技术

随着生物医学技术进步，许多研究已经揭露不同基因、不同生长因子、不同讯息传递路径、不同靶点对于疾病发生及进程的影响，而研究人员通过了解靶点与疾病间的关系，开发出能直接作用于作为特定靶点的标靶药物，目前标靶药物最常应用于癌症疾病的治疗，即使该标靶药物直接作用于诱发癌症的致癌基因上，达到治疗癌症的功效。举例来说，针对上皮因子受体突变的肺癌病人可投予艾瑞莎(Iressa)或得舒缓(Tarceva)等标靶药物，用以进行较有效率的治疗，并且减少传统药物对于个体的副作用。

此外，培美曲塞由礼来公司研制成功的新一代抗代谢类抗癌药，为一种多靶点的抗癌药物，发挥作用的靶点均为叶酸代谢途径中的几个关键酶，而由于该途径能够显著影响癌细胞的DNA合成和癌症的生长，因此，经研究证实培美曲塞对癌症的抑制作用不仅十分显著，并且对多种癌症可能均有治疗效果。目前培美曲塞已被美国食品与药品管理局(FDA)陆续批准用于治疗恶性胸膜间皮瘤以及晚期非小细胞肺癌。更进一步来说，一项大规模的国际多中心Ⅲ期临床研究结果发现，对于不能以手术切除的恶性胸膜间皮瘤，在顺铂化疗的基础上联合使用培美曲塞能够进一步提高疗效、延长病人的生存时间。再者，由另一项大规模Ⅲ期临床研究得知对于晚期非小细胞肺癌的病人，在一线化疗失败后以培美曲塞进行治疗，其疗效并不低于目前常用的多西紫杉醇，而且某些副作用甚至要低于后者。此外，培美曲塞还在多种恶性肿瘤的治疗中表现出一定的疗效，例如胃癌、乳腺癌、胰腺癌等，即便在肺癌和间皮瘤中，其适用的病人范围也在扩大。

另研究发现，CDA-2人尿制剂具有多基因调控的能力。详言之，CDA-2人尿制剂能够解决癌细胞甲基移转酶异常状态，使癌细胞不会持续地进行分裂，并且诱导癌细胞进行终末分化或凋亡，而达到治疗癌症的目的。而由细胞试验可知，CDA-2人尿制剂能诱导血癌细胞HL-60及NB4以及肝癌细胞Hep3B走向凋亡的作用，同时能降低凋亡蛋白酶3(Caspase3)的活性。另由动物实验的结果观察缩小的肿瘤转殖肿瘤可知，CDA-2人尿制剂具有下调与细胞增生相关基因的能力，包括TGF-2、PCNA、c-myc、c-jin、c-fos、N-ras等。CDA-2人尿制剂能通过上调抑制细胞周期的基因，如P16，P21及P27，以及下调细胞周期激素cyclinD1，因而使癌细胞停留在细胞生长期的第一间期(G1phase，G1arrest)。

再者，CDA-2人尿制剂能够抑制血管增生因子的表现，如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)，以及抑制抗药因子的表现，如Her-2/neu蛋白，因而能抑制血管增生及改变抗药性。CDA-2人尿制剂能通过调降与移转相关的蛋白质而抑制转移，如基质金属蛋白酶9(MMP-9)、整合素β1(Integrinβ1)。此外，CDA-2人尿制剂能活化过氧化体增殖剂活化受体γ(Peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ，PPARγ)，使癌细胞回到正常细胞的状态而抑制癌症。

据此，基于CDA-2人尿制剂能针对不同靶点进行作用，因此，相较于传统药物来说，CDA-2人尿制剂的适应症范围更广，并且能够具有抑制癌细胞生长、移转，以及降低副作用的能力，而能达到有效治疗癌症、延长患者寿命、改善患者生活品质的功效。由此可知，当医药组合物能够作用不同靶点时，或其作用的靶点能影响或调控不同疾病的进程时，能通过投予该医药组合物至特定靶点而达到治疗不同疾病的功效。

除将标靶药物用于治疗癌症外，目前标靶药物的适应症尚包含非癌症的疾病，换言之，标靶药物的作用靶点不再限于与癌症疾病相关的对象。具体来说，中国台湾专利第I360576号“使用白藜芦醇治疗由肿瘤干细胞引起的非典型畸胎/类横纹肌细胞瘤的医药组合物”，通过抑制Sirt1基因表现而减弱类干细胞基因或是药物抗性基因的表现，有助于提升肿瘤感细胞的放射性治疗的效果。Sirt1蛋白质能在成熟脂肪细胞中触发脂肪分解，减少脂肪含量，并且在骨胳肌代谢作用的研究中证实，如白藜芦醇等Sirt1活化剂能通过活化Sirt1基因，使PCG-1α蛋白质去乙酰化而被活化，达到活化线粒体生物合成基因及调控参与能量代谢基因的功效。

Sirt1基因位于人类染色体第10对染色体上，散布于细胞核及细胞质中，而转录成为分子量约为81.7kDa的Sirt1蛋白质。Sirt1蛋白质属于第三类NDA+脱乙酰酶家族，能通过调控蛋白质的机制，进而刺激细胞修复、抵抗发炎反应、保护神经元、抗凋亡，达到改善健康及延长寿命的功效。

而根据先前研究可知，Sirt1蛋白质通过直接与解偶联蛋白2(uncouplingprotein-2，UCP2)的基因启动子结合，抑制解偶联蛋白2的表现，达到调控胰岛素分泌及糖脂代谢的功效。在培养肝细胞的研究中证实Sirt1蛋白质能与细胞核内FOXO1作用，使FOXO1去乙酰化，达到促进肝脏中的糖异生而能提供细胞存活的能量。此外，过氧化体增生因子活化受体γ配体1α(PPAR-γCoactivator1-α，下称PCG-1α)为过氧化体增生因子活化受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ，PPAR-γ)的共生活化物，也为Sirt1蛋白质的作用物之一。在正常生理状况下，Sirt1蛋白质会与PCG-1α相互作用，增加PCG-1α的活性，进而提升肝脏糖质新生基因的表现及骨胳肌脂肪酸氧化的作用。基此，目前许多标靶药物将Sirt1基因作为靶点。

另，如中国台湾专利第I406668号“一种用于抑制幽门螺旋菌生长及抑制幽门螺旋菌诱导胃上皮细胞发炎反应的医药组合物”，其是通过抑制幽门螺旋菌诱导细胞核因子κB活化机制而达到抑制抑制幽门螺旋菌诱导胃上皮细胞发炎反应的功效。细胞核因子κB(nuclearfactor-KappaB，NF-κB)为一种核转录因子，由两个亚单位所组成的二聚体蛋白质，其中，亚单位包含有p50、p65、p52、RelB、c-Rel等蛋白质。依据近期研究可知，细胞核因子κB与发炎反应、细胞凋亡、细胞坏死以及癌症生成具有密切关系。在细胞质中，细胞核因子κB与抑制其的负调控蛋白(以下简称IκB)结合，当细胞受到外来刺激时，负调控蛋白经磷酸化被降解而失去活性，此时，细胞核因子κB进入细胞核，与被调控基因的启动子结合而活化该基因的表现。举例来说，基因被剔除IKK(IκBkinase)的大鼠，在脊髓创伤后，由于IKK无法抑制IκB，因此能阻断NF-κB被释放进入细胞核的路径，减少创伤后的发炎反应。反之，当外来物质或细胞受刺激后所释放的物质抑制IκB时，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，细胞核因子κB则会被活化而进入细胞核表现，导致如发炎因子的产生。

综上所述，多种基因、生长因子、讯息传递路径等皆可作为标靶药物的靶点，例如：Sirt1蛋白质或细胞核因子κB，但是，上述专利前案中所揭技术特征仅能对于单一疾病具有治疗效果，无法同时用于多种适应症，增加药物开发的成本。为能避免先前技术的缺失，本发明的发明人通过可作用于多部位、多基因、多靶点的多胜肽而达到调控生理机能的特性，例如Sirt1蛋白质能通过将细胞核因子κB的亚单位(p65、p52)去乙酰化，避免细胞核因子κB与细胞核内发炎反应相关基因结合，减少如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β等发炎因子表现，抑制发炎反应，而致力于开发出一种医药组合物，能用于改善或治疗相关疾病，不仅能够达到同时具有多种功效的目的，更能提升公共利益，并且节省开发成本。

发明内容

本发明的主要目的在于揭露氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性氨基酸序列用于制造医药组合物的用途。

为能达成上述目的，本发明的实施例揭露一种以多胜肽用于制造调控多部位、多基因、多靶点的医药组合物的用途，其中，该多胜肽具有编码为SEQIDNo.1的序列或其进行一个或多个氨基酸的取代、删除、添加所衍生的同源性氨基酸序列。

较佳地，该多胜肽的氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的序列。

较佳地，该多胜肽的氨基酸序列与编码为SEQIDNo.1的序列具有高于90％的相似度。

较佳地，所述多胜肽为多基因调节剂。

较佳地，所述多基因包含至少一特定转录因子。

较佳地，所述转录因子选自由过氧化体增生因子活化受体、细胞核因子κB及Sirt1基因所组成的群。

较佳地，该医药组合物在制备预防肌肉萎缩症的药物中的应用。

较佳地，该医药组合物在制备治疗发炎或含有发炎反应的病症的药物中的应用。

较佳地，所述医药组合物在制备治疗代谢症候群相关病症的药物中的应用。

较佳地，所述医药组合物在制备治疗肥胖症的药物中的应用。

较佳地，该医药组合物用于抑制肝脏脂肪沉积的病症。

较佳地，该医药组合物用于抑制脂肪堆积的功效。

较佳地，该医药组合物在制备具降低糖尿病并发症的药物中的应用。

本发明的有益效果为：由于本发明所揭多胜肽具有调控多基因转录或多靶点表现的能力，因此，通过投予本发明所揭医药组合物至一个体中，该医药组合物能作用于至少一特定靶点，以达到在个体中发挥多效应的功效。

附图说明

图1为以蛋白质电泳证实葫芦科植物萃取液中所含可调整血糖的多胜肽属同源性蛋白质的结果。

图2为以自动合成多胜肽装置合成本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽的结果。

图3为将以重组生物产制平台生产本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽的结果。

图4A为以活体影像观察各组小鼠的荧光素酶活性的结果。

图4B为各组小鼠荧光值的统计分析结果。

图5为以荧光影像测定并分析各组小鼠的各脏器所发出的光子数。

图6为各组小鼠的脏器进行免疫染色分析的结果。

图7A为各组小鼠的肝脏组织进行H&E染色的结果。

图7B为各组小鼠的肝脏组织进行油红O染色的结果。

图8A为各组小鼠的肝脏组织以4-羟基壬烯酸抗体进行免疫组织染色的结果。

图8B为各组小鼠的肝脏组织以丙二醛抗体进行免疫组织染色的结果。

图9为实验组小鼠及对照组小鼠的外观。

图10为实验组小鼠及对照组小鼠的脂肪组织。

图11为实验组小鼠及对照组小鼠的脂肪组织进行染色的结果。

图12为实验组小鼠及对照组小鼠的肌肉组织进行H&E染色的结果。

具体实施方式

除非另有定义，在本发明的说明书及权利要求书中所使用的技术及科学名词的意义，其与本发明所属技术领域且具通常知识者的一般理解相同。若有矛盾的情形，以本发明内容为准。

本发明揭露氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性氨基酸序列的用途。由于本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性氨基酸序列具有调控多基因转录或多靶点表现的能力，因此，该多胜肽或其同源性氨基酸序列具有下列功效：其一、应用于个体多部份，作用于多基因靶点；其二、治疗发炎或含有发炎反应的病症；其三、抑制肝脏脂肪沉积的病症；其四、抑制脂肪堆积的功效；其五、预防肌肉萎缩的功效；其六、降低糖尿病并发症。

据此，通过投予有效量的氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性氨基酸序列至一生物体，能达到改善或治疗与上述多基因转录或多靶点蛋白质表现相关疾病的功效，包含有与脂肪代谢相关疾病、肌肉合成相关疾病、发炎因子相关疾病等，举例来说，发炎反应、肌肉萎缩症、肥胖症、代谢症候群、脂肪肝等。

本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性氨基酸序列能以植物萃取法、人工合成方式、重组生物体产制平台或上述任两种以上方法的组合所获得。

所谓“同源性氨基酸序列”一词指一多胜肽的氨基酸序列中，进行单一或多个氨基酸的取代、删除、添加而所衍生出的氨基酸序列。

所谓“植物萃取法”一词指通过物质在不同溶剂中的溶解度不同，而将该物质自特定植物中分离出，其中，分离纯化的技术为本发明所属技术领域且具通常知识者一般周知的技术，举例来说，利用蛋白质电泳分离法分离出特定大小的多胜肽、液相层析法、利用不同大小的滤膜进行分离。依据先前研究可知，可自葫芦科植物萃取液中得到可调整血糖的多种多胜肽，包含有本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性多胜肽，而葫芦科植物包含有，但不限于，苦瓜、山苦瓜、南瓜、西瓜、胡瓜、葫芦、天花粉，并且，以蛋白质电泳证实，葫芦科植物的萃取液中所含可调整血糖的多胜肽属同源性蛋白质，如图1所示。此外，本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性多胜肽也能由非葫芦科的植物中萃取而得，例如：百日菊(Zinniaelegans)、苜蓿(Medicagotruncatula)、葡萄柚、葡萄、迷迭香(Sambucusnigra)、稻、阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)或上述至少任两种的组合等。由此可知，本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽或其同源性多胜肽的来源并不局限于葫芦科植物。

所谓“人工合成方式”一词为以本发明所属技术领域且具通常知识者的周知技术，通过人工方式将氨基酸依序连接而成为一多胜肽，其中，人工合成方式包含化学合成法以及胜肽合成仪。而人工合成法通常具有以下优点：可方便地在合成过程中改变多胜肽的一级结构、加入特殊的氨基酸、以及对多胜肽的末端进行修饰等。一般来说，化学合成法可分为固相胜肽合成法及液相胜肽合成法，其中，液相合成法必须在完成每一个氨基酸的连接后，进行萃取操作。但是，由于萃取所得的多胜肽中间物通常为混合物，因此，尚须进行层析纯化步骤，因此，以液相合成法进行多胜肽的合成，必须涉及繁琐的萃取及层析纯化步骤，才能得到高纯度的产物。固相合成法在溶剂中，在固体聚合物颗粒(或聚合支撑物)上进行胜肽的键结反应。在此方法中，先将所需多胜肽的N端氨基酸共价键结至聚合物颗粒上，其后再通过专一性键结的方式将后续氨基酸依序连接上，最后合成该多胜肽。由于该聚合物颗粒并不溶于溶剂中，故仅需在反应终了通过清洗及过滤操作，即可将该聚合物颗粒(以及连接在该聚合物颗粒上的所需的多胜肽)与反应试剂及副产物分开。因此，固相胜肽合成法因为不需要纯化中间产物，不仅具有较佳产率，且可大幅缩短反应时间，在长链多胜肽的合成上也较具优势，为目前较为广为人所使用的胜肽合成方法。

所谓“重组生物体产制平台”一词指通过生物技术将用以表现特定蛋白质的核酸构筑于一表现载体上，再将该重组表现载体转形至一宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌等，使该重组表现载体能在该宿主细胞内表现该核酸，而获得该特定蛋白质。

所谓“有效量”一词指要产生所求特定效果所需化合物或活性成份的量，以其在组合物中所占重量百分比表示。如同本发明所属技术领域中具有通常知识者所了解的，该有效量会因为要引起特定效果的投予方式而有所不同。一般来说，活性成分或化合物在组合物中的量可占该组合物重量的约1％至约100％，较佳者为约30％至约100％。

所谓“医药组合物”一词包含一有效量的要产生特定效果的所需化合物或活性成份，以及至少一药学上能接受的载体。如同本发明所属技术领域中具有通常知识者所了解，医药组合物的形态随着要引起特定效果的投予方式有所不同，如锭剂、粉剂、针剂等，并且，该载体也随着医药组合物的形态而为固态、半固态或液态。举例来说，载体包含，但不限于，明胶、乳化剂、烃类混合物、水、甘油、生理食盐水、缓冲生理盐水、羊毛脂、石蜡、蜂蜡、二甲基硅油、乙醇。

所谓“一”或“该”一词，在本发明说明书及权利要求书中，除非另有说明，应指包含一及一以上的数值。

以下，为能更进一步说明本发明的多功效，将分别举实施例作详细说明，但是，这些实施例为用以解说的例示，其中所使用的任何词汇并不限制本发明说明书及权利要求书的范围及意义。另须先以叙明，下列实施例中的动物试验皆已获得中国医药大学动物保管及使用委员会中的伦理委员会的同意。

实施例一：制备氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽

依据该发明所属技术领域且具通常知识者的一般知识，以固相合成法、或以重组生物体产制平台、或及植物萃取等方法制备氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽，其中：

以目前市面上的可自动合成多胜肽的装置，例如：固相胜肽合成仪、液相胜肽合成仪、及微波胜肽合成仪等，皆可视需要选用以合成本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽，如图2所示。

通过重组生物体产制平台的方式，将含有能转录本发明所揭多胜肽的核酸的表现载体置于一宿主细胞中，使该核酸分子在宿主细胞中表现氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽，如图3所示，其中，该宿主细胞可为大肠杆菌或酵母菌，且该表现载体可选自市面上常见的载体，例如：pQStrep2、pQStrep4、pGEX-6p1、或pQTEV等。

另以苦瓜为例，先以取得苦瓜萃取液，再以如蛋白质电泳纯化法或层析纯化步骤等已知技术自该苦瓜萃取液中纯化取得本发明所揭多胜肽，另视需要添加防腐剂，如苯甲酸钠或水杨酸等，并且将其置于-80℃下保存该多胜肽。而获得萃取液的步骤如下：首先，在溶剂中将苦瓜离解(maceration)以得到一粗悬浮液，该溶剂可为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或水等，且可利用搅拌器或研磨器以离解苦瓜。接着，以12,000转数/分钟(revolutionperminute，rpm)至15,000转数/分钟的离心转速，将粗悬浮液中的颗粒自液相中移除，并以孔径为0.1微米至0.5微米的滤材来过滤上清液。然后，将所得的滤液依序通过1千道尔顿(kDa)的滤膜，并取其上清液部分，以及10千道尔顿的滤膜，并取其滤液部分，即可获得含有本发明所揭多胜肽的水溶性苦瓜萃取液，其中，该滤膜可选自已知滤材产品，例如：Amicon滤膜及Millipore滤膜等。

实施例二：多胜肽用于活体多部位、多基因靶点反应

在本实施例中采用如下材料：

(A)实验对象：使用先以叙明，下列动物试验皆已获得中国医药大学动物保管及使用委员会中的伦理委员会的同意。使用FVB品系的小鼠以进行实验，此等小鼠均由国家实验动物中心(NationalLaboratoryAnimalCenter)所提供。

(B)多胜肽：使用实施例一中所制得氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽。

将FVB品系小鼠均分为对照组和实验组两组，给予实验组的小鼠每只含有2.5毫摩尔/公斤体重(mmol/kg)的本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽溶液(20微升)，连续七天；而对照组，则给予每只小鼠20微升的磷酸盐缓冲液。试验结束后，将各该组小鼠的空肠、肌肉、脂肪、肝脏、肾脏等组织取出后，利用系统生物学进行多器官、多靶点分析。由于本发明所属技术领域且具通常知识者周知通过DNA微阵列可观测到全基因体上受调控的基因种类，也可进一步利用生物资讯软件分析影响及作用的路径为何，因此，将进一步以微阵列与基因表现图谱来进行机制的探究，以观察受本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽影响的基因。兹详细说明操作流程如下：

(一)RNA样品以RNeasyMinikit(Qiagen,Valencia,CA,USA)进行细胞totalRNA的萃取。接着，利用BeckmanDU800分光光度计(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA)进行totalRNA的定量，A260/A280比值大于1.8的样品，进一步利用Agilent2100bioanalyzer(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)评估其totalRNA的品质。只有当样品的RNAintegritynumber高于8.0时，才会用于下述的微阵列实验分析。

(二)DNA微阵列实验分析。DNA微阵列实验分析方法如Cheng等(2007)报告中所述。简言之，将totalRNA(5μg)先利用MessageAmp^TMaRNAkit(Ambion)，经由试管内转录(invitrotranscription)的步骤加以放大。放大的RNA(amplifiedRNA，简称aRNA)再和Cy5染剂进行化学反应，并将Cy5染剂标定到aRNA上，使得aRNA成为带有荧光标定的标的物。荧光标定完成后，利用盖玻片和华联公司所提供的杂交缓冲剂(hybridizationbuffer)，将荧光标定的标的物与WholeGenomeOneArrayTM进行杂交。在50℃经过一夜的杂交之后，通过三个清洗步骤将非专一性结合的标的物从晶片上清除。接着将晶片以离心的方式使其干燥，并利用Axon4000扫描器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，USA)进行荧光强度的扫描。我们使用genepix4.1软件(MolecularDevices)对晶片上每一点的Cy5荧光强度进行分析。每一点的讯号经由扣除周围背景值的方式校正其强度。我们删除作为内在控制的探针(probe)或是信噪比(signal-to-noiseratio)小于零的点。通过这些门槛的点通过R程式的limmapackage进行归一化(normalization)(Smyth,2005)。

(三)利用生物资讯软件分析作用机制及影响路径。利用生物资讯软件，例如：医学主题词表(MedicalSubjectHeadings，MeSH)(http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html)、BiblioSpherePathwayEdition软件等分析表现有差异的基因的作用机制、影响的路径及与疾病的关联度。

各路径所得的分析结果如下表一所示，由表一的结果可知，本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽确实能在个体的不同部位、不同基因靶点进行反应，并且影响讯息传递路径及疾病。

表一：在不同部位影响各路径或疾病的基因的分析结果

实施例三：多胜肽用于治疗发炎或含有发炎反应的病症

在本实施例中，分别就动物活体内的荧光影像测定、动物活体外的荧光影像测定、免疫组织染色分析进行确效，其中，采用如下材料：

(A)实验对象：将受细胞核因子-κB(NF-κB)调控的荧光素酶(Luciferase，luc)基因转殖鼠与野生型小鼠F1进行交配，产生具有FVB遗传特性的NF-κB/luc异型合子基因转殖小鼠以进行实验。

(一)动物活体内的荧光影像测定

将6～8周龄的雌性基因转殖鼠，共15只，随机均分为三组，其中，第一组为空白组；第二组为对照组；第三组为实验组。以腹腔注射的方式，给予第二组及第三组的各该小鼠含有4毫克/公斤体重的脂多糖体发炎反应诱发物质(lipopolysaccharide；LPS)溶液(100微升)，而给予第一组中的各该小鼠100微升的磷酸盐缓冲液。5分钟后，给予第三组中的各该小鼠含有0.5毫克/公斤体重的该多胜肽溶液，20微升，而给予第一组及第二组中的各该每只小鼠20微升的水。四小时后，分别以活体影像观察各该组小鼠的荧光素酶活性。

详言之，先以腹腔注射的方式，给予各该组中的各该小鼠含有150毫克/公斤体重的荧光素(luciferin)。5分钟后，分别以异氟烷将各该组小鼠麻醉，并且各该组小鼠腹部朝上置于IVIS影像系统200系列(IVISImagingSystem_200SeriesXenogen，Hopkinton，MA)的照相舱内，将照相机设定为最高敏感度进行成像1分钟。以生活影像软件(LivingImagessoftware，Xenogen，Hopkinton，MA)将组织发出的光子数予以定量，将基因转殖小鼠发出的光子数予以定量，结果如图4A所示，其中，讯号强度的计算为组织所测到的总光子数，讯号强度的结果以每秒光子数(photons/sec)呈现。并且比较分析各该组小鼠的荧光值，结果如图4B所示。

由先前文献中可知，NF-κB/luc异型合子基因转殖小鼠经由脂多糖体诱导后确实能够活化其内细胞核因子κB，并且，细胞核因子κB转录因子与活化细胞核因子κB讯号传递路径在调节免疫反应中扮演重要角色，当细胞核因子κB被活化时，会刺激发炎反应相关因子的基因表现。由图4A及图4B的结果可看出，第一组的平均荧光值为2.92×10⁷photons/sec；第二组的发光讯号强度较第一组来得强，其平均荧光值为31.97×10⁷photons/sec；而相较于第二组，第三组的发光强度明显降低，其平均荧光值为19.82×10⁷photons/sec。因此，由上述活体影响的结果可知，脂多糖体确实能诱导基因转殖鼠具有发炎反应，使其腹部具有明显的荧光活性，而经过本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽处理后，能使基因转殖鼠腹部的荧光活性下降。脂多糖体可使基因转殖小鼠的荧光值上升10.95倍，而本发明所揭的多胜肽可使荧光值达到约38％的抑制比率。

据此，本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽能通过降低细胞核因子κB的活性，而能有效地达到抑制生物体内由外来刺激所引起的急性全身性发炎反应的功效。

(二)动物活体外的荧光影像测定

将实施例三(一)中的各该组小鼠，先以腹腔注射的方式给予每只含有150毫克/公斤体重的荧光素(luciferin)，5分钟后，将各该组小鼠牺牲，并且快速取出其组织，包含有脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、胃、肾、卵巢及肠。活体影像的设定如同实施例三(一)中所述，将自各该组小鼠取出的器官分别置于IVIS影像系统200系列(IVISImagingSystem_200Series，Xenogen，Hopkinton，MA)的照相舱内进行成像，并且利用生活影像软件(LivingImagessoftware，Xenogen，Hopkinton，MA)将组织发出的光子数予以定量，结果如图5所示，其中，讯号强度的计算为组织所测到的总光子数，讯号强度的结果以每秒光子数(photons/sec)呈现。根据图5的结果可知，各该组小鼠的各脏器内的荧光强度有不同呈现，其中，除卵巢外，对照组小鼠在其余各该脏器所测得的荧光强度明显较空白组小鼠来得增加。而相较于对照组小鼠，实验组小鼠在肺脏、肝脏、肾脏、肠等脏器中所测得知荧光强度明显下降。

为更进一步了解多胜肽降低发炎反应的主要标的器官，将各该组各器官的荧光值以倍率(Foldchange)呈现，如下表二及表三所示，其中，表二的倍数变化＝第二组平均荧光值÷第一组平均荧光值；表三的倍数变化＝第三组平均荧光值÷第二组平均荧光值。

表二：各该组小鼠的脏器光影像倍率的结果

表三：各该组小鼠的脏器光影像倍率的结果

由上述结果可知，脂多糖确实能诱导基因转殖鼠内的脏器发生发炎现象，而使其有明显的荧光活性，但是，通过投予本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽能够使如肺脏、肝脏、肾脏、肠等脏器的荧光活性下降，显示本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽确实能降低由脂多糖所诱导的细胞核因子κB的活性，达到抑制脏器发炎的功效。

(三)免疫组织染色分析

依据本发明所属技术领域且具通常知识者的周知技术，将自各组小鼠所取出的器官进行石蜡包埋，将石蜡包埋的器官切为5-μm的切片，以二甲苯脱蜡，再以梯度酒精进行脱水后，并以3％的过氧化氢溶液作用15分钟，用以消除内源性过氧化物酶的活性，然后，在室温下以1％牛血清白蛋白作用1小时，用以阻断非专一性的连结，而后以稀释50倍的针对p56、TNF-α或IL-1β的小鼠单株抗体在4℃下作用16-18小时，隔天，以已加上生物素(biotinylated)的二级抗体(ZymedLaboratories，SouthSanFrancisco，CA)置于室温下作用20分钟。最后，各该切片置于卵白素-生物素复合物(avidin-biotincomplex)试剂中，依据操作手册(-PlusKit,ZymedLaboratories,SouthSanFrancisco,CA)的步骤以3,3’-二氨基联苯胺进行染色，结果如图6所示。

由图6的结果可知，相较于空白组小鼠的组织切片，经脂多糖体诱导的对照组，其组织切片内具有许多呈棕色的与TNF-α及IL-1β反应的细胞，并且棕色区域明显增加。然而在实验组小鼠的组织切片中，与TNF-α及IL-1β反应的棕色区域明显较对照组小鼠的组织切片少。先前文献中已经揭露TNF-α及IL-1β为急性发炎期及导致发炎反应的促发炎激素，因此，由上述结果显示本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽通过抑制促发炎细胞激素的产生，达到有效抑制由脂多糖体诱导的发炎现象。

实施例四：多胜肽用于抑制肝脏脂肪沉积的病症

在本实施例中采用如下材料：

(A)实验对象：使用FVB品系的小鼠以进行实验，此等小鼠均由国家实验动物中心(NationalLaboratoryAnimalCenter)所提供。

取三十只FVB品系的小鼠，随机均分为三组，其中，第一组为空白组；第二组为对照组，喂食高脂饲料；第三组为实验组，喂食高脂饲料；并且，每周以腹腔注射的方式投予各该小鼠含有10毫摩尔/公斤体重(mmol/kg)的本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽溶液(100微升)两次，连续四周，而第一组及第二组中的各该小鼠则被给予100微升的磷酸盐缓冲液。

试验结束后，将各该组小鼠的肝脏组织取出后，依据本发明所属技术领域且具通常知识者的一般知识，将各该组小鼠肝脏组织分别以H&E染色及油红O(oilredO)染色观察其内脂肪堆积的情形，结果分别如图7A及图7B所示。并且，如上述实施例三中所述免疫组织染色的流程，分别以4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal，HNE)抗体及丙二醛(malonaldehyde，MDA)抗体对各该组小鼠肝脏组织进行免疫组织染色，用以侦测各该组小鼠肝脏细胞中脂质过氧化产物，结果如图8A及图8B所示。

由图7A及图7B的结果可知，相较于第一组的小鼠，第二组的小鼠的肝脏组织中有明显脂肪空泡产生，并且有大量脂肪堆积。而第三组的小鼠的肝脏组织较第二组的小鼠来说，具有较少脂肪堆积的情形。

由图8A及图8B的结果可知，第二组小鼠的肝脏组织中较第一组小鼠有较多如4-羟基壬烯酸及丙二醛的脂质过氧化产物，而相较于第二组小鼠，第三组小鼠的肝脏组织中脂质过氧化产物则明显减少。

由先前文献中可知，当细胞内脂肪过氧化产物过多时，会导致细胞病变、纤维化等细胞损伤的情形产生，而4-羟基壬烯酸及丙二醛皆为脂质过氧化产物，并且为细胞氧化损伤的检测指标。是以，由上述结果可知通过投予本发明所揭所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽能有效改善肝脏组织内脂肪堆积的情形，并且能够降低肝脏细胞内脂质过氧化产物的含量，换言之，本发明所揭所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽能用以治疗或改善脂肪肝或肝脏损伤所引起的病症。

实施例五：多胜肽用于抑制脂肪堆积的功效

(A)在本实施例中采用如下材料：实验对象：使用基因缺损而导致腹部脂肪大量堆积的小鼠以进行实验，此等小鼠均由国家实验动物中心(NationalLaboratoryAnimalCenter)所提供。

(B)多胜肽：使用实施例一中所制得而具表1所示氨基酸序列的多胜肽。

将小鼠均分为对照组和实验组两组，每周以腹腔注射的方式，给予实验组的小鼠每只含有2.5纳摩尔/公斤体重(2.5nmol/kg)的本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽溶液(100微升)两次，连续四周；而空白组中，则给予每只小鼠100微升的磷酸盐缓冲液。

进行期间，定期测量各该组小鼠的体重、饲料摄取量，在实验结束后，观察各组小鼠的外观，并且取出各组小鼠的脂肪组织予以秤重，利用切片染色判断脂肪细胞的数目与大小，如图9至图11所示。更进一步计算出各该组小鼠的体脂肪比例，计算公式为：(脂肪重÷体重)×100％，结果如下表四所示。

表四：各组小鼠的体重、饲料摄取量、脂肪重及体脂肪

	对照组	实验组
			实验开始前体重(公克)	71.99±6.36	71.96±6.46
实验结束时体重(公克)	71.95±6.25	72.54±7.24
			平均饲料摄取量(公克/天/只)	0.78±0.22	0.88±0.17
脂肪重(公克)	2.53±0.19	1.90±0.41
			体脂肪(％)	3.68±0.16	2.74±0.21

由表四及图9至图11的结果可知，虽然对照组小鼠与实验组小鼠在实验前后体重及实验过程中的摄食量皆无明显差异，但是，实验组小鼠的脂肪重及体脂肪明显较对照组小鼠下降。由此可知，通过本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽确实能影响脂肪的生合成，进而达到预防或治疗代谢症候群的功效。

实施例六：多胜肽用于预防肌肉萎缩的功效

在本实施例中采用如下材料：

(A)实验对象：使用基因缺损而导致腹部脂肪大量堆积的小鼠以进行实验，此等小鼠均由国家实验动物中心(NationalLaboratoryAnimalCenter)所提供。

(B)多胜肽：使用由实施例一所制得氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽。

将实施例五中的各该组小鼠的肌肉组织取出后，依据本发明所属技术领域且具通常知识者的一般知识，将各该组小鼠肌肉组织以H&E染色观察其肌肉细胞的数目与大小，结果如图12所示。

由图12的结果可知对照组小鼠具有明显肌肉萎缩的病征，而投予本发明所揭多胜肽的实验组小鼠肌肉萎缩的情形明显被改善。由此可知，通过本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽确实能影响肌肉的生合成，达到预防或治疗肌肉萎缩症相关病征的功效。

实施例七：多胜肽用于具降低糖尿病发生及并发症功效

在本实施例中采用如下材料：

(A)实验对象：使用非肥胖性糖尿病小鼠(Non-obesediabeticmice，NODmice)的小鼠以进行实验，此等小鼠均由国家实验动物中心(NationalLaboratoryAnimalCenter)所提供。

取23只小鼠，分为4组，分别以下列条件饲养20周：第一组为对照组，共六只，每日给予各该小鼠20微升的磷酸盐缓冲液；第二组，共六只，每天以口服方式给予各该小鼠含有0.01微摩尔/公斤体重(0.01μmol/kg)的本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽溶液(20微升)一次；第三组，共六只，每天以口服方式给予每只小鼠含有0.1微摩尔/公斤体重(0.1μmol/kg)的本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽溶液(20微升)一次；第四组，共五只，每天以口服方式给予每只小鼠含有1微摩尔/公斤体重(1μmol/kg)的本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽溶液(20微升)一次。

进行期间，定期测量各该组小鼠的存活率、糖尿病诱发率及眼睛病变，结果如表五所示。试验结束后，取各该组小鼠的血液样品，依据本发明所属技术领域且具通常知识者的一般知识，将各该组小鼠血液进行血清生化检查，结果如表六所示。

表五：各组小鼠的存活率、糖尿病诱发率及眼睛病变

由表五的结果可知，第一组小鼠的存活率为4/6(66.67％)，第二组、第三组、第四组小鼠的存活率则分别为6/6(100％)、6/6(100％)、5/5(100％)。而第一组小鼠的糖尿病诱发率为2/6(33.33％)，第二组、第三组、第四组小鼠的糖尿病诱发率分别为0/6(0％)、0/6(0％)、1/5(20％)。此外，糖尿病并发症眼睛病变，第一组小鼠的发生率为3/6(50％)，第二组、第三组、第四组小鼠的发生率分别为0/6(0％)、1/6(16.66％)、1/5(20％)。由此结果显示，通过投予本发明所揭多胜肽能有效提高个体存活率，并且，降低糖尿病及/或其并发症的发生，例如眼睛病变或肾病变等病征。

表六：各该组小鼠的血清生化检查

由表六的结果可知，第一组小鼠的血中尿素氮(BUN)为40.50±4.54mg/dL，第二组、第三组、第四组小鼠的血中尿素氮值分别为37.38±2.77mg/dL、38.50±4.69mg/dL、35.88±6.33mg/dL。第一组小鼠的血清肌酸酐(Creatinine)为0.70±0.05mg/dL，第二组、第三组、第四组小鼠的血清肌酸酐值分别为0.64±0.12mg/dL、0.69±0.06mg/dL、0.69±0.06mg/dL。由此结果显示，通过投予本发明所揭多胜肽能明显降低血中血清肌酸酐值及尿素氮的含量，并且，随着投予剂量增加，其下降越增明显。

由表五及表六的结果可知，通过投予本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽确实能提高个体的存活率、降低糖尿病诱发率、糖尿病并发症以及肾损伤等，因此，本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽能作为治疗或预防糖尿病或/及其并发症的医药组合物。

以上仅是通过各该实施例详细说明本发明，熟知该技术领域者在不脱离本发明精神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本案权利要求所涵盖。

Claims

1.一种以多胜肽用于制造调控多部位、多基因、多靶点的医药组合物的用途，其特征在于，该多胜肽具有编码为SEQIDNo.1的序列或其进行一个或多个氨基酸的取代、删除、添加所衍生的同源性氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多胜肽的氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的序列。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多胜肽的氨基酸序列与编码为SEQIDNo.1的序列具有高于90％的相似度。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多胜肽为多基因调节剂。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述多基因包含至少一特定转录因子。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述转录因子选自由过氧化体增生因子活化受体、细胞核因子κB及Sirt1基因所组成的群。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药组合物在制备治疗肌肉萎缩症的药物中的应用。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药组合物在制备治疗发炎或含有发炎反应的病症的药物中的应用。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药组合物在制备治疗代谢症候群相关病症的药物中的应用。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药组合物在制备治疗肥胖症的药物中的应用。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药组合物在制备具降低糖尿病并发症的药物中的应用。