CN112915097A - 松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病药物中的应用，属于药物制备用途领域。松果菊苷减轻糖尿病小鼠炎症，并通过调控MMP‑2、MMP‑9、TIMP‑1的表达和抑制TGF‑β1/Smads通路降低胶原沉积和细胞外基质蓄积，减轻心肌纤维化，从而达到干预糖尿病心肌病的效果。松果菊苷针对糖尿病心肌病的发病机制发挥保护作用，为糖尿病心肌病的干预提供新策略。

Description

松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病药物中的应用
技术领域
本发明属于药物制备用途领域，具体涉及松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病，是胰岛素分泌和(或)作用缺陷所导致，其发病率呈现逐渐增加的趋势。据国际糖尿病联盟统计，2017年年龄在18～99岁的人群中，全球有4.51亿糖尿病患者。到2045年，这一数字预计将增加到6.93亿，此外，估计有5.87亿人患有糖耐量受损[1]。
糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病导致的一种特异性心脏病，独立于冠状动脉疾病、高血压及瓣膜病，其特征是心脏肥大、心肌细胞丢失、间质纤维化。DC M的早期征象是舒张功能障碍，随着糖尿病病程的进展，进展为收缩功能障碍，最后导致临床心脏衰竭。心肌纤维化、炎症反应、心肌代谢紊乱、微血管功能障碍和自主神经病变等参与DCM病理的发生和发展[2]。有研究报道[3]慢性炎症反应直接或间接导致心肌纤维化、凋亡和坏死等心脏组织损伤，最终引起左心室舒张功能甚至收缩功能障碍。促纤维化炎症细胞因子如白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumour necrosisfactor-α，TNF-α)可以调节心肌纤维化。心肌纤维化在DCM病理改变中发挥重要作用，主要出现在DCM的晚期。糖尿病性心肌纤维化可出现细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蓄积、胶原蛋白异常沉积和上皮-间质转化等。
转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种致纤维化的关键调节因子，通过激活其下游Smads蛋白家族参与心脏、肾脏和肝脏等多种器官和组织的纤维化。高糖环境激活TGF-β1，与细胞膜表面的TGF-βI/II型受体结合，进而磷酸化TGF-βI型受体下游蛋白Smad2/3并释放到胞浆，p-Smad2/3与Smad4结合后进入胞核，诱导成纤维细胞变成肌成纤维细胞、ECM蓄积和胶原沉积，引起心肌纤维化[4,5]。基质金属蛋白酶(matrixme talloproteinases,MMPs)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor ofmatrix metallo proteinases，TIMPs)是调控ECM形成和降解的两种关键酶，两者之间的失衡在纤维化中起重要作用。多种细胞因子和生长因子(如TGF-β、IL-1β和TNF-α)参与MMPs活性的调控。低剂量TGF-β1的刺激可增加MMP-2和MMP-9的表达，减少TIMP-1的表达[6]。Wu等[7]发现IL-1β通过激活核因子κB从而增加MMPs的表达，当MMP-9过量或不适当表达时，会随机和非选择性破坏ECM。TIMP-1可以负反馈调节MMP-9的表达，下调ECM蓄积。I型胶原(collagen I)和III型胶原(collagen III)是ECM的主要成分，当心肌胶原比例失衡时，心室壁僵硬度下降，心室舒张改变，最终导致心衰，构成了心肌纤维化的主要病理基础[8]。Liu等[9]证实TGF-β1刺激可显著增加collagen I和collagen III的表达。有研究报道通过调控MMP-2/9和TIMP-1的表达和抑制TGF-β1/Smad2、3/p-p38信号通路，可降低collagen I和collagen III的表达，从而发挥抗心肌纤维化作用[8]。目前尚无治疗DCM的有效药物。DCM发病早期容易被漏诊和误诊，一旦出现心肌纤维化，对心脏的损伤不可逆转。因此，早期有效的干预对延缓DCM的发生发展具有重要意义。
松果菊苷(echinacoside，ECH)是从中药肉苁蓉中提取的苯乙醇苷类化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、神经保护和保护肝脏等生物活性[10]。
db/db小鼠是Leptin受体(db)基因突变引起Leptin受体活性降低所致的一种自发性肥胖性2型糖尿病小鼠，具有明显肥胖、高血糖等特性[11,12]。因此，db/db小鼠常常用作研究糖尿病心肌病的动物模型。
参考文献：
[1]Cho NH,Shaw JE,Karuranga S,et al.IDF Diabetes Atlas:Globalestimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045[J].Diabetes Research and Clinical Practice,2018,138:271-281.
[2]Alonso N,Moliner P,Mauricio D.Pathogenesis,Clinical Features andTreatment of Diabetic Cardiomyopathy[J].Adv Exp Med Biol,2018,1067:197-217.
[3]Wen HL,Liang ZS,Zhang R,et al.Anti-inflammatory effects oftriptolide improve left ventricular function in a rat model of diabeticcardiomyopathy[J].Cardiovasc Diabetol,2013,12(1):50.
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[5]Yue YY,Meng K,Pu YJ,et al.Transforming growth factor beta(TGF-β)mediates cardiac fibrosis and induces diabetic cardiomyopathy[J].Diabetesresearch and clinical practice,2017,133:124-130.[6]Zeng AP,Zeng SQ,Cheng Y,etal.Modulation of matrix metalloproteinase and TIMP-1expression by TGF-beta1in cultured human RPE cells[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2006,26(3):363-365.
[7]Wu LY,Luo ZJ,Zheng JX,et al.IL-33Can Promote the Process ofPulmonary Fibrosis by Inducing the Imbalance Between MMP-9and TIMP-1[J].Inflammation,2018,41(3):878-885.
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[12]Lutz TA,Woods SC.Overview of animal models of obesity[J].Currentprotocols in pharmacology,2012,Chapter 5:t5-t61.
发明内容
本发明的目的在于探讨松果菊苷改善糖尿病心肌病的作用及机制，为糖尿病心肌病的早期干预或后期治疗提供新靶点和新药物，提供松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
本发明以db/db小鼠和db/m小鼠为实验研究对象，普通饲料喂养。结果显示与db/m小鼠相比，db/db小鼠出现明显的肥胖，其体重、心脏湿重、血糖、血压显著升高，并且心体比显著降低。ELISA结果表明db/db小鼠出现炎症反应和胰岛功能紊乱。心脏超声提示左心室肥大、心功能减退。HE染色可见心肌细胞肿胀变形，结构模糊，细胞核消失。Masson染色清楚观察到亮绿色纤维排列紊乱、显著增多，存在明显纤维化。Western blot检测结果提示TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、MMP-2和MMP-9蛋白水平增加，TIMP-1蛋白水平降低。RT-PCR检测结果提示TGF-β1、collagen I和collagen III mRNA水平增高。这表明db/db小鼠出现了糖尿病心肌纤维化的变化，而通过ECH灌胃干预后发现ECH能明显降低db/db小鼠体重、心脏湿重、血糖、血压并增加心体比，同时改善db/db小鼠炎症反应、胰岛功能紊乱、心脏超声表现、心肌组织病理变化和纤维化相关指标。上述结果均表明db/db小鼠出现明显DCM表现。ECH具有改善糖尿病心肌纤维化从而达到干预糖尿病心肌病的作用。
基于上述内容，本发明提供ECH在制备改善糖尿病心肌纤维化的药物中的应用。本发明还提供ECH在制备防治糖尿病心肌病的药物中的应用，所述的药物通过减轻炎症和降低胶原沉积以及细胞外基质蓄积，减轻糖尿病心肌纤维化从而发挥干预糖尿病心肌病的作用；所述的药物是通过调控MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达和抑制TGF-β1/Smads通路来达到干预糖尿病心肌病的效果。
进一步地，本发明还提供ECH在制备降血压的药物中的应用。
进一步地，本发明还提供ECH在制备抑制MMP-2、MMP-9表达的药物中的应用，ECH在制备促进TIMP-1表达的药物中的应用，ECH在制备抑制TGF-β1/Smads通路的药物中的应用。
本发明的有益效果：ECH能够减轻炎症，并通过调控MMP-2、9/TIMP-1的表达和抑制TGF-β1/Smads通路，减轻胶原沉积和细胞外基质蓄积，减轻心肌纤维化发挥心脏保护作用。以上实验结果证实ECH具有改善糖尿病心肌病的作用。
附图说明
图1为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠体重、血糖、心脏湿重和心体比的结果，表明ECH干预后显著降低db/db小鼠体重、血糖、心脏湿重并增加心体比。
图2为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠IL-1β、TNF-α、INS、HOMA-IR和ISI的结果，表明ECH干预后显著改善db/db小鼠炎症因子水平和胰岛功能。
图3为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠血压的结果，表明ECH干预后显著改善db/db小鼠血压。
图4为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠心脏超声结果，表明ECH可改善db/db小鼠左心室肥大和心功能。
图5为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠病理结果图，表明ECH明显改善db/db小鼠心脏的病理变化。
图6为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠心脏组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达水平结果统计柱状图，结果表明相比db/m组小鼠，db/db组小鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、MMP-2和MMP-9蛋白水平增加，TIMP-1蛋白水平降低(**P＜0.01)；经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠相关蛋白水平较db/db组小鼠显著改善(##P＜0.01)。
图7为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠心脏组织中TGF-β1、collagen I和collagenIII mRNA表达水平结果统计柱状图，结果表明相比db/m组小鼠，db/db组小鼠心肌组织中TGF-β1、collagen I和collagen III mRNA表达水平明显升高(*P＜0.05)；经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠相关mRNA水平较db/db组小鼠显著改善(#P＜0.05)。注：与db/m组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与db/db组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实验动物为遗传背景为C57BLKS/J的db/m小鼠与db/db小鼠，雄性，9～10周龄，体重db/m为24～29g，db/db为51～55g。购于常州卡文斯实验动物有限公司(质量合格证编号：N0.201927041)。在武汉大学人民医院动物饲养中心SPF级动物房饲养(许可证号：SYXK(鄂)2009-0027)，饲喂普通饲料。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％～70％，小鼠自由进食和饮水。
实验药物：松果菊苷(ECH)购于上海融禾医药科技发展有限公司，货号(190906)。
实验分组：经检疫及适应性喂养2周，db/db小鼠分为糖尿病组(db/db组，n＝9)和ECH治疗组(即药物干预组，db/db+ECH组，n＝11)。db/m小鼠作为正常对照组(db/m组，n＝10)。db/db+ECH组给予松果菊苷300mg/kg/d(松果菊苷溶于生理盐水配制成松果菊苷溶液)灌胃，db/db组和db/m组生理盐水0.05mL/10g/d灌胃14周。观察小鼠摄食、饮水和活动情况，每两周检测各组小鼠体重和血糖水平，第26周行心脏超声检测后麻醉处死。
实施例1小鼠体重测定
将小鼠放入电子天平的饭盒中，称量体重并记录数据。结果如图1所示：db/db组小鼠体重较db/m组明显升高(**P＜0.01)，经ECH干预14周后，db/db+ECH组小鼠体重较db/db组小鼠明显降低(##P＜0.01)。
实施例2小鼠血糖测定
小鼠头颈部用左手拇指、食指和中指固定，尾根部用无名指和小指固定。眼科剪在距小鼠尾端0.1～0.2cm处快速剪断鼠尾，用血糖仪试纸(美国强生公司，ONETOUCH)边缘轻触鼠尾的血滴，血糖仪读数并记录数据。结果如图1所示：相比db/m组小鼠，db/db组小鼠血糖明显升高(**P＜0.01)，经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠血糖较db/db组小鼠降低(#P＜0.05)。
实施例3小鼠心脏湿重测定
麻醉小鼠后，打开胸腔，暴露心脏并进行灌流。分离心脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干，进行心脏湿重称重，记录数据，计算心脏湿重与体重之比(心体比)。结果如图1所示：db/db组小鼠心脏湿重较db/m组明显增加，心体比下降(**P＜0.01)，经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠心脏湿重较db/db组小鼠降低，心体比增加(#P＜0.05)。
实施例4小鼠IL-1β、TNF-α和空腹胰岛素ELISA测定
麻醉小鼠后，用左手拇指和食指轻轻按压小鼠颈部两侧，右手持毛细血管，将毛细血管刺入小鼠内眦采血。室温静置1h，3000r/min离心15min，取上清液，按试剂盒[小鼠胰岛素(INS)、小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、小鼠白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒，Meimian，货号：MM-0579M2、MM-0132M2、MM-0040M2]说明书测定IL-1β、TNF-α和INS。将样本的OD值代入标准曲线，计算相应的浓度。根据INS的值计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(ISI)。HOMA-IR＝空腹血糖*INS/22.5，ISI＝1/(空腹血糖*INS)，由于HOMA-IR和ISI值为非正态分布，因此在统计处理时取其自然对数。结果如图2所示：相比db/m组小鼠，db/db组小鼠IL-1β、TNF-α、INS、HOMA-IR明显增高，ISI降低(**P＜0.01)，经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠IL-1β、TNF-α、INS、HOMA-IR较db/db组小鼠显著降低，ISI升高(#P＜0.05)。
实施例5小鼠血压测定
使用CODA无创血压系统测量平静和清醒小鼠尾动脉收缩压和舒张压。将小鼠放进束缚器，把小鼠尾巴露出来。将固定后的小鼠和束缚器一起放在加热板V型槽上进行加热。将动物OCUFR传感器套在小鼠尾巴根部，VPR传感器套在尾巴上离OCUFF距离1厘米左右。当鼠尾温度达到32℃后，进行测量。结果如图3所示：相比db/m组小鼠，db/db组小鼠收缩压和舒张压升高(**P＜0.01)，经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠收缩压和舒张压较db/db组小鼠降低(##P＜0.01)。
实施例6小鼠心脏超声测定
异氟烷麻醉小鼠后，使用脱毛膏暴露小鼠胸部，并固定于泡沫平板上，用VINNO6VET型超声心动仪探测心功能指标，并记录数据。结果如图4所示：相比db/m组小鼠，db/db组小鼠左心室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)和左心室收缩末期内径(left ventricular internal diameter at end-systolic，LVIDs)升高，左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)降低(*P＜0.05)，经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠LVIDd和LVIDs较db/db组小鼠降低，LVEF升高(#P＜0.05)。
实施例7心肌组织HE染色
取部分心肌组织置于4％多聚甲醛中固定，酒精脱水，石蜡包埋切片，脱蜡后行HE染色。①依次将切片放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ各20min、无水乙醇Ⅰ和Ⅱ各5min、75％酒精5min，自来水洗。②苏木素染色：切片入苏木素染液染5min，水洗、分化、水洗、返蓝、流水冲洗。③伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。④脱水封片：切片依次放入无水乙醇I、II和Ⅲ各5min、二甲苯Ⅰ和Ⅱ各5min，中性树胶封片。光学显微镜下观察、拍照。结果(图5)显示：db/m组小鼠心肌细胞排列整齐，结构清晰，细胞胞浆均匀红染；db/db组小鼠心肌细胞肿胀变形，结构模糊，细胞核消失；与db/db组相比，db/db+ECH组心肌细胞肥大肿胀减轻，形态大致正常。
实施例8心肌组织Masson染色
取部分心肌组织置于4％多聚甲醛中固定，经洗涤、梯度乙醇脱水、透明，石蜡包埋切片，脱蜡后行Masson染色。①依次将切片放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ各20min、无水乙醇Ⅰ和Ⅱ各5min、75％酒精5min，自来水洗。②切片浸入Masson A液中浸泡过夜，自来水洗。③切片入Masson B液及Masson C液等比混合的染液1min，自来水洗，1％盐酸酒精分化，自来水洗。④切片入Masson D液浸染6min，自来水漂洗。⑤Masson E液浸染1min。⑥稍沥干直接入MassonF液染30s。⑦切片用1％冰醋酸漂洗分化，无水乙醇脱水。⑧透明封片：切片放入无水乙醇5min，二甲苯5min透明，中性树胶封片。显微镜下采集图像。结果(图5)显示：db/m小鼠心肌间质和周围血管只存在少量胶原纤维。相反，在db/db小鼠中清楚观察到亮绿色纤维排列紊乱、显著增多，存在明显纤维化。ECH治疗后减少了心肌间质和血管周围的胶原纤维，显著减轻了纤维化。
实施例9Western blot法检测心脏组织内TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白的表达
取30mg心肌组织，用组织剪刀剪成小块，并加入RIPA裂解液、PMSF和磷酸化蛋白抑制剂，置于液氮研磨仪中研磨90s。冰上裂解30min后，4℃、12000r/min离心15min，BCA法测定上清液浓度。蛋白样品与蛋白上样缓冲液(5×)4:l配平后，沸水浴变性10min。取30μg蛋白样品点样进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜上。5％BSA室温封闭lh。4℃摇床孵育一抗(MMP-2 1:1000、MMP-9 1:1000、TIMP-1 1:1000、TGF-β1 1:1000、p-Smad2 1:1000、p-Smad31:1000和GAPDH 1:2000)过夜。TBST洗膜5min×6次，置于山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗中(1:3000)，室温孵育1h。TBST洗膜5min×6次，使用Bio-Rad化学发光法获得条带，分析各条带的灰度值。结果(图6)显示：相比db/m组小鼠，db/db组小鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高，TIMP-1蛋白水平降低(**P＜0.01)；经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠相关蛋白水平较db/db组小鼠显著改善(##P＜0.01)。
实施例10RT-PCR法检测心脏组织内TGF-β1、collagen I和collagen III mRNA表达水平
按照Trizol试剂盒的说明提取总RNA。在检测纯度和浓度后，按照逆转录试剂盒的说明进行逆转录。95℃预变性30s，扩增40个周期：PCR反应95℃15s，60℃30s；溶解65℃→95℃，每5s增加0.3℃。使用2-△△ct法处理数据，引物序列详见表1。结果(图7)显示：相比db/m组小鼠，db/db组小鼠心肌组织中TGF-β1、collagen I和collagen III mRNA表达水平明显升高(*P＜0.05)；经ECH干预后，db/db+ECH组小鼠相关mRNA水平较db/db组小鼠显著改善(#P＜0.05)。
表1 RT-PCR引物序列
Figure BDA0002996989380000071
Figure BDA0002996989380000081
上述实施例只是本发明的较好实施例，但不用于限制本发明。在本发明的精神和原理范围内进行的任何其他修改、替换、改进、组合和简化都包括在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcgtcccg tagacaaaat g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaggtcaat gaaggggtcg t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgaaccaa ggagacggaa ta 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctgatccc gttgatttcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagaagcacg tctggtttgg ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtccatgta ggctacgctg tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtggcaatgt aaagaagtct ctgaag 26
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtgcgata tctatgatgg gtag 24

Claims (7)

1.松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病的药物中的应用，其特征在于，所述的药物通过减轻炎症和降低胶原沉积以及细胞外基质蓄积，减轻糖尿病心肌纤维化从而发挥干预糖尿病心肌病的作用。
2.松果菊苷在制备防治糖尿病心肌病的药物中的应用，其特征在于，所述的药物是通过调控MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达和抑制TGF-β1/Smads通路来达到干预糖尿病心肌病的效果。
3.松果菊苷在制备改善糖尿病心肌纤维化的药物中的应用。
4.松果菊苷在制备降血压的药物中的应用。
5.松果菊苷在制备抑制MMP-2、MMP-9表达的药物中的应用。
6.松果菊苷在制备促进TIMP-1表达的药物中的应用。
7.松果菊苷在制备抑制TGF-β1/Smads通路的药物中的应用。
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Title
XIANG ZHANG ET AL.: "Beneficial Effects of Echinacoside on Diabetic Cardiomyopathy in Diabetic Db/Db Mice", 《DRUG DESIGN, DEVELOPMENT AND THERAPY》 *

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