CN110960538A - 松果菊苷在治疗糖尿病心肌病中的功能和应用 - Google Patents
松果菊苷在治疗糖尿病心肌病中的功能和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了松果菊苷在治疗糖尿病心肌病中的功能和应用,属于中药的功能与应用领域。本发明发现松果菊苷能够显著降低糖尿病心肌病小鼠的体重、空腹血糖以及心脏湿重,能够改善糖尿病心肌病小鼠的病变情况,其具有制备预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病的药物的应用。
Description
技术领域
本发明属于中药的功能与应用领域,具体涉及一种松果菊苷在治疗糖尿病心肌病中的功能和应用,具体是在制备预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是世界上最常见的代谢紊乱综合症之一。2015年,全球糖尿病患者人数上升至4.15亿,约占成年人口的8.3%。据估计从2012年到2015年,糖尿病及其并发症每年导致约150-500万人死亡。心肌功能障碍即糖尿病心肌病是造成糖尿病相关发病率和死亡率一半以上的主要并发症之一,寻找有效的糖尿病心肌病治疗药物是一个亟待解决的问题。
糖尿病性心肌病(DCM)早期心脏反应的关键之一是心肌细胞凋亡。多项研究发现,在STZ诱发的糖尿病大鼠中,检测到caspase3、DNA碎片和TUNEL阳性细胞的活动比正常组织增加,同时伴有舒张压和收缩功能的改变。P53是一种肿瘤抑制基因,对防止细胞增生和保持DNA受损基因组的完整性有重要作用,能调控大量的细胞活动,其中P53基因对细胞凋亡的调控是研究得较多的。通过Bax/Bcl-2、死亡信号受体蛋白Fas/Apol、IGF-BP3等蛋白,或直接刺激线粒体释放高毒性氧自由基P53可完成对细胞凋亡的调控作用。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号系统的重要分支,是主要分布与胞浆的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它在糖尿病心肌病发病中起重要作用,在心肌凋亡重扮演重要角色。研究证实,高糖培养24h的H9c2心肌细胞,p-P38MAPK表达增加,凋亡细胞增加,活性氧增加,以及线粒体膜电位下降。高糖、AGEs、氧化应激等因素可通过P38MAPK通路引起细胞凋亡,机制可能与P53、Bax、Bcl-2、氧化应激等有关。随着对DCM病理机制和病理过程研究的不断深入认识,传统的治疗糖尿病药物和改善心功能药物不能从根本上改善糖尿病心肌病临床症状和治疗糖尿病心肌病,因此迫切需要寻找新的有效治疗药物。深入开展糖尿病心肌病发病机理及中药的作用机理的研究,将作为中药新药研究开发机糖尿病心肌病的临床治疗提供重要的科学依据。
松果菊苷(ECH)是一种从管花肉苁蓉茎中分离出来的天然化合物,其主要化学成分是苯乙醇苷。通过体内外研究其已被证明具有抗氧化、抗疲劳、抗炎、提高记忆力与神经保护、抗肿瘤、保护肝脏及免疫调节等作用。
小鼠和基因工程小鼠资源是目前疾病机制研究、基因功能研究、药物创制等领域最重要的动物模型之一,也是这些领域创新研究的必须条件。利用基因工程小鼠针对糖尿病心肌病病理过程中的各个分子环节进行研究,对阐明糖尿病心肌病发生发展过程中的分子机制,寻找糖尿病心肌病治疗的有效药物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于确定松果菊苷对于糖尿病心肌病的保护作用及其作用机制,提供一个用于预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病的中药的新用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
本发明以遗传背景为C57BLKS/J的雄性db/db小鼠和db/m小鼠为实验对象,均给予普通饲料喂养,结果表明与db/m小鼠对比,db/db小鼠表现出明显的肥胖,其体重、空腹血糖水平明显高于db/m小鼠,并且心脏湿重明显低于对照组db/m小鼠。从小鼠心脏HE染色切片观察到db/db组小鼠心肌细胞可见明显的肥大、坏死,心肌细胞排列结构紊乱,可见少许胞外基质沉积;以及Tunel染色说明db/db组小鼠心肌细胞凋亡率显著增加,这表明db/db小鼠出现了糖尿病心肌病的表现。而通过灌胃给予ECH干预后发现ECH能显著降低db/db小鼠体重、空腹血糖水平以及增加心脏湿重,同时db/db小鼠心肌组织病理改变明显改善。这表明db/db小鼠产生糖尿病心肌病的改变,ECH对糖尿病心肌病具有缓解、治疗作用。
针对ECH的上述功能,提供ECH在制备预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。
针对ECH的上述功能,提供ECH对糖尿病心肌病保护作用的作用机制,即ECH能够抑制P53/P38MAPK通路的激活,影响心肌细胞凋亡进程,并通过调节细胞凋亡通路关键蛋白的表达来保护心脏功能。
一种预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病的药物,包含ECH。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明发现ECH的新功能,即ECH能改善糖尿病心肌病的作用。
(2)ECH在改善糖尿病心肌病中的作用,制备用于治疗糖尿病心肌病药物方面应用。
(3)ECH对糖尿病心肌病保护作用机制的研究,用于了解中药对糖尿病心肌病的作用机制。
附图说明
图1是db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠病理结果图和Tunel染色荧光图,结果表明ECH明显改善db/db小鼠心脏的病理改变,db/db+ECH组小鼠心肌细胞凋亡率显著降低。
图2为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠心脏组织Tunel染色细胞活性统计柱状图,结果表明ECH显著降低db/db小鼠心肌细胞凋亡。
图3为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠心脏组织内P53、P38MAPK、casepase-3和casepase-8蛋白表达水平结果统计柱状图,结果表明较db/m组,db/db组小鼠心肌细胞P53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表达水平明显升高(p<0.01);与db/db组相比,db/db+ECH组蛋白表达水平显著降低(p<0.01)。
图4为db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠心脏组织内P53、P38MAPK、Caspase-3、Bcl-2/Bax mRNA表达水平结果统计柱状图,结果表明较db/m组,db/db组小鼠心肌细胞P53、p38MAPK、caspase-3 mRNA水平明显升高,Bcl-2/Bax水平降低(p<0.01);经松果菊苷干预后,db/db+ECH组相关mRNA水平较db/db组显著改善(p<0.01)。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实验用动物及饲养:
实验动物种属、性别、周龄及来源:遗传背景为C57BLKS/J的db/m小鼠与db/db小鼠,雄性,6周龄,体重db/m为20-25g,db/db为40-48g。db/m与db/db小鼠购自南京大学-南京生物医药研究院(质量合格证号:db/db:32002100000734,db/m:32002100000735)。
动物饲养及环境条件:所有的实验小鼠饲养在武汉大学人民医院动物饲养中心SPF级动物房(许可证号:SYXK(鄂)2009-0027),普通饲料喂养。每12小时交替照明,温度24±2℃,湿度40%-70%,小鼠自由饮水进食。
实验所用药物:松果菊苷(ECH)购买于上海融禾医药科技发展有限公司,货号(150623)。
实验分组:同窝出生6周龄小鼠经检疫及适应饲养1周,随机编号将db/db小鼠分为糖尿病组和ECH治疗组(即药物干预组),其中糖尿病组(db/db组,n=10),ECH治疗组(db/db+ECH组,n=11)。选取9只db/m小鼠作为正常对照组(db/m组,n=9)。其中db/db组和db/m组每日按照0.05mL/10g标准进行生理盐水灌胃2周,同时db/db+ECH组小鼠每日按松果菊苷(松果菊苷溶于生理盐水配制成松果菊苷溶液)300mg/kg的剂量灌胃2周。每周监测三组小鼠体重,观察小鼠摄食、饮水及活动情况。
实施例1小鼠体重、心脏湿重及血糖水平,血清ALT、AST、TG水平测定
(1)小鼠空腹体重,心脏湿重,眶静脉窦采血。
1)体重检测
①禁食:晚上10:00将待实验小鼠禁食(不禁水),第二天上午8:00开始实验操作。
②称重:在小鼠年龄的8周、10周、12周、14周、16周、18周称重,将一铁饭盒放在动态电子天平上,抓起小鼠,放入称量饭盒中,称量体重记录数据。小鼠18周时的体重结果见表1。结果显示:db/db组小鼠体重较正常db/m组小鼠明显升高(**P<0.01),而经ECH干预处理10周后,db/db+ECH组小鼠体重较db/db组小鼠显著降低(#P<0.05)。
2)心脏湿重检测
①禁食:晚上10:00将待实验小鼠禁食(不禁水),第二天上午8:00开始实验操作。
②称重:在小鼠18周时,使用断头法处死小鼠,心脏灌流后,分离心脏组织,称取心脏湿重,记录数据。结果(表1)示:db/db组小鼠心脏湿重较正常db/m组小鼠明显降低(**P<0.01),而经ECH干预处理10周后,db/db+ECH组小鼠心脏湿重较db/db组小鼠显著升高(##P<0.05)。
3)腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠后眶静脉采血,分离血清。
①麻醉:将戊巴比妥粉末用生理盐水配制成3%浓度,按0.1mL/10g的剂量腹腔注射麻醉小鼠。
②常规抓取小鼠,置于采血台上,左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定,并轻轻压迫颈部两侧,阻碍静脉回流,使眼球充分外突,提示眼眶后静脉丛充血。
③右手持采血管,将尖端与小鼠面部成45°的夹角,沿内眦插入内眼入滑眼球后方,向眼底方向刺入,当感到有阻力时即旋转轻采血管以切开静丛,血液即流入采血管。
④缓慢调整采血管的角度使之水平或稍向下倾斜,辅助者将0.5mL EP管置于采血管末端的下方收集血液,并在0.5mL EP管上标上耳标号。采血结束后,拔出采血管,放松左手,使用无菌纱布块轻轻压迫眼眶帮助止血。
⑤分离血清:收集血液的EP管于室温下静置1-2h使血液自然凝固。4℃、4000rpm离心30min,充分分离血清。用微量移液器分别吸取血清置无菌EP管中,对EP管进行标记,随后保存于-80℃冰箱。
(2)空腹血糖水平检测
将所有待实验的小鼠从晚上10:00到第二天上午8:00间禁食(不禁水),即禁食10小时后开始实验操作,分别在小鼠年龄的8周、10周、12周、14周、16周、18周检测血糖。
①血糖仪准备:检查血糖仪(美国强生公司,ONETOUCH)电池,按右侧开关,将试纸正确放入左侧插槽,屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字,随后显示滴血图案,提示血糖仪进入待测状态。
②固定小鼠:右手抓鼠尾,左手持一块毛巾,将毛巾对折,用拇指和食指捏住毛巾对折处,将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾,拇指和食指在将鼠尾根部固定。
③剪尾:眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾,待血滴自行流出。
④血糖检测:将血糖仪试纸边缘轻触血滴,血液浸入试纸,血糖仪倒计时5秒显示读数,结果见表1。结果显示:db/db组小鼠血糖较正常db/m组小鼠明显升高(**P<0.01),而经ECH干预处理10周后,db/db+ECH组小鼠血糖较db/db组小鼠显著降低(#P<0.05)。
(3)小鼠血清ALT、AST、TG水平测定
①从-80℃冰箱中取出血清样本,迅速置于冰上,在室温下待样品融化;
②在室温下3000转/分钟离心1分钟,让EP管壁的血清聚集至管底。
③按照操作流程,打开全自动生化分析仪(Johnson&Johnson),清洗加样器。
④按照全自动生化分析仪样品盘的标记顺序,逐一放入待测的EP管。
⑤准确安装试剂检测盘,开始使用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、TG水平。结果见表2。
表1 db/m、db/db和db/db+ECH组小鼠18周时的体重、心脏湿重和血糖结果
表1结果表明,ECH在干预10周后,显著降低db/db小鼠体重和血糖水平(与db/m组相比,**P<0.01;与db/db组相比,#P<0.05,##P<0.01)。
表2 db/m、db/db、db/db+ECH组小鼠18周时的血清ALT、AST、TG水平
表2结果表明,与db/m组小鼠相比较,db/db组小鼠ALT、AST及TG水平明显升高;与db/db组比较,db/db+ECH组小鼠上述指标能得到显著缓解(与db/m组相比,*P<0.01;与db/db组相比,#P<0.01,*#P<0.01)。
实施例2小鼠心肌组织显微结构的检测
1、心脏组织取材
小鼠干预至18周时,称重,用3%戊巴比妥钠以0.1mL/10g的剂量麻醉小鼠,用枕头固定于取材板,用纱布湿润小鼠胸腹部皮肤,用眼科剪剪开胸腔与腹腔,暴露心脏,剪开右心耳,把注射器的针头刺进左心室,用50mL注射器缓慢推注10-15mL PBS缓冲液,待右心耳流出液清亮,灌流结束后,清除胸腔脏器,仅保留心脏,放入有4%多聚甲醛的15mL离心管中,标记于-80℃冰箱保存。
2、心脏组织处理及病理染色相关实验
(1)心脏脱水,透明,浸蜡
切取4%多聚甲醛中固定好的部分心脏组织于标记的包埋框内,在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序,①脱水:75%酒精(45分钟)→75%酒精(45分钟)→85%酒精(45分钟)→85%酒精(45分钟)→95%酒精(45分钟)→95%酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无水酒精(1小时);②透明:二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时);③浸腊(65℃):石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后,将包含组织的包埋框装进机器篮筐内,启动上述程序。上述程序完成后,取出组织包埋框送病理室包埋组织,同时清洗机器备用。
(2)心脏组织切片,切片厚度5μm。
(3)心脏组织苏木精-伊红(HE)染色
将心脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30分钟)→二甲苯中(5分钟×3次)→100%酒精(1分钟)→90%酒精(1分钟)→70%酒精(1分钟)→蒸馏水洗→苏木素(5分钟)→自来水洗去切片上的浮色→1%盐酸酒精(1至3秒)→自来水洗数下→Scott促蓝液(碳酸氢钠0.35g,硫酸镁2g,蒸馏水100mL)(1分钟)→自来水洗数下→伊红(1分钟)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70%酒精一下→90%酒精一下→100%酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分钟×3次)→在二甲苯未干时封片,拍照。结果见图1。HE染色结果提示:与正常db/m组小鼠相比,db/db组小鼠心肌细胞可见明显的肥大、坏死,心肌细胞排列结构紊乱,可见少许胞外基质沉积,证明db/db小鼠已出现明显的心肌病理改变,糖尿病心肌病造模成功;而db/db+ECH组小鼠心肌细胞未见明显的肥大、坏死,心肌细胞排列结构尚可,上述病理改变较db/db组有明显改善,证实经ECH干预后,糖尿病心肌病小鼠心肌纤维化、坏死显著减少。
(4)心脏组织Tunel染色
1)石蜡切片脱蜡至水:二甲苯中(5分钟×3次)→100%酒精(1分钟)→90%酒精(1分钟)→70%酒精(1分钟)→蒸馏水洗。
2)切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走),在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织,37℃孵育15min。将切片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
3)切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育10min,将切片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
4)按切片数量和组织大小取tunel试剂盒(Roche公司生产,编号11684817910)内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1:9混合,加到圈内覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃水浴锅孵育60min,湿盒内加少量水保持湿度。
5)PBS漂洗切片3次,每次5min,滴加适量DAPI染液到切片上,室温避光孵育5min。
6)PBS漂洗切片3次,每次5min,后取出切片,将有细胞的一面封到滴加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上,荧光显微镜下观察并拍照。结果见图1。Tunel染色结果提示:db/db组小鼠心肌细胞凋亡率较db/m组显著增加,证明db/db小鼠心肌细胞已出现明显的大量凋亡、坏死;而db/db+ECH组小鼠心肌细胞凋亡程度明显降低,说明ECH能够改善db/db小鼠心肌细胞凋亡情况。
7)将Tunel染色在荧光显微镜下拍照结果处理,并进行凋亡程度计数统计(取10×20倍视野),结果见表3和图2。
表3 Tunel染色法计数各组心肌细胞凋亡率
图2、表3结果显示,db/m组心肌细胞的总凋亡率为1.86±0.49%,db/db组小鼠心肌细胞凋亡率显著增加,为31.66±2.89%;而与db/db组相比,db/db+ECH组小鼠凋亡率显著降低,为8.35±1.13,证明ECH对小鼠心肌细胞凋亡凋亡具有明显的改善作用(与db/m组比较,*P<0.01;与db/dn组比较,#P<0.01)。
实施例3心脏脏组织内P53、P38MAPK、casepase-3和casepase-8蛋白表达水平的测定
Western blot法检测心脏组织内P53、P38MAPK、casepase-3和casepase-8蛋白的表达。
主要步骤为:
1)取各组小鼠心脏组织50mg,用组织剪剪成细小碎片,加蛋白裂解液混匀。
2)加入适当量终浓度为1mmol/L的PMSF抑制组织蛋白降解,冰浴裂解20min。
3)1200r/min离心10min,吸取上清液,用BCA法测定蛋白浓度。
4)将蛋白样品及SDS-PAGE上样缓冲液(2×)按1:1配平后,沸水浴变性10min。
5)取50μg蛋白样品进行SD-PAGE电泳,湿转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶摇床封闭1h,分别加入一抗稀释液(1:800),4℃摇床过夜。
6)洗膜后,分别加入兔抗兔二抗稀释液(1:5000),室温孵育1h,洗膜后进行扫膜显色,并分析各组条带蛋白灰度值。P53、P38MAPK、casepase-3和casepase-8蛋白表达水平统计结果见图3。
从图3中可以看出,db/db小鼠心脏组织中P53、P38MAPK、caspase-3、casepase-8蛋白表达水平较db/m组明显升高;db/db+ECH组P53、P38MAPK、caspase-3、casepase-8蛋白表达水平较db/db组显著降低。说明在糖尿病小鼠中P53/P38MAPK通路的激活,促进p38mapk磷酸化从而激活下游相关凋亡蛋白caspase家族,上调caspase-3和caspase-8表达水平,启动细胞凋亡级联反应,通过松果菊苷予以干预后,上述凋亡蛋白表达水平显著降低。
实施例4心脏组织内P53、P38MAPK、caspase-3、Bcl-2/Bax mRNA表达水平的测定
RT-PCR法检测心脏组织内P53、P38MAPK、caspase-3、Bcl-2/Bax mRNA表达水平。
主要步骤为:
1)取各组小鼠心脏组织100mg,用Trizol法提取总RNA;
2)用基因扩增仪逆转录成cDNA后,每个样本加入3个复孔。
3)扩增条件:①预变性95℃30s;②PCR反应95℃5s、60℃40s,总共40个循环;③溶解95℃15s、60℃60s、95℃15s。
4)选取管家基因GAPDH作为内参照,使用ABI7500软件2ˉΔΔct法处理数据,引物序列如下:
结果显示,在db/db+ECH组小鼠心脏组织中P53、P38MAPK、caspase-3水平较db/db组显著升高,Bcl-2/Bax mRNA水平显著降低(图4),说明在糖尿病小鼠中P53/P38MAPK通路的激活,促进p38mapk磷酸化从而激活下游相关凋亡蛋白caspase家族,上调caspase-3和caspase-8表达水平,启动细胞凋亡级联反应,抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,上调促凋亡基因Bax的表达,最终导致心肌细胞凋亡;而经ECH灌胃处理后,db/db小鼠能够明显抑制P53/P38MAPK通路的激活,影响db/db小鼠的心肌细胞凋亡进程,并通过调节细胞凋亡通路关键蛋白的表达来保护心脏功能,这一点与HE染色及Tunel染色观察到的心脏组织形态学改变一致(图1),揭示了松果菊苷在基因水平对于糖尿病心肌病的保护作用机制。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学人民医院(湖北省人民医院)
<120> 松果菊苷在治疗糖尿病心肌病中的功能和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 21
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Claims (2)
1.松果菊苷在制备预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。
2.一种预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病的药物,其特征在于:包含松果菊苷。
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