CN111202776B - 刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用，属于疾病治疗技术领域，所述刺梨醇提取物能够延缓6‑OHDA对帕金森动物中脑黑质多巴胺神经元的损失；从而达到保护多巴胺能神经元的作用，改善6‑OHDA损伤导致的运动功能缺陷和提高超氧化物歧化酶的含量，进而能够治疗和预防帕金森病。

Description

刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用
技术领域
本发明属于疾病治疗技术领域，尤其涉及刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
背景技术
刺梨(Rosaroxburghii Tratt)为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实，广泛分布于温暖带及亚热带地区，刺梨具有很高营养价值，富含维生素C、多酚、多糖、微量元素等物质，其中含维生素C的含量居水果之首。研究发现，刺梨的药理作用有降低重金属负荷、解毒、镇静等多方面的生物活性，但是现有技术并未有关于刺梨提取物具有治疗帕金森病的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用，所述刺梨醇提取物能够治疗和预防帕金森病。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
优选的，所述刺梨醇提取物的制备方法包括：将刺梨与乙醇溶液混合后进行提取，得到提取液，将所述提取液抽滤、烘干，得到刺梨提取物。
优选的，所述刺梨与乙醇溶液的体积比为0.5～1.5:8～12。
优选的，所述乙醇的体积百分含量为70～80％。
优选的，所述提取的次数为2次，所述提取的温度为75～85℃。
优选的，所述干燥的温度为90～110℃，所述干燥的时间在27h以上。
本发明还提供了刺梨醇提取物在制备保护多巴胺神经元的药物中的应用。
优选的，所述保护包括减轻6-OHDA对多巴胺神经元的损伤。
本发明还提供了刺梨醇提取物在制备改善帕金森动物模型运动功能缺陷的药物中的应用。
本发明还提供了刺梨醇提取物在制备提高帕金森动物模型血清中超氧化物歧化酶含量的药物中的应用。
本发明提供了刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用，所述刺梨醇提取物能够保护6-OHDA对多巴胺神经元的损伤，改善6-OHDA造成的运动功能缺陷和提高帕金森动物血清中超氧化物歧化酶的含量，进而能够治疗帕金森病。
附图说明
图1为6-OHDA造模14天后，旷场实验对6个组大鼠运动轨迹的检测结果；
图2为6-OHDA造模14天后，旷场实验对6个组大鼠运动距离检测的统计结果；
图3为6-OHDA造模14天后，转棒实验对6个组大鼠在棒时间检测的统计结果；
图4为蛋白免疫印记Westernblotting检测大鼠中脑黑质多巴胺能神经元蛋白表达的统计结果；
图5为6-OHDA造模后免疫荧光对6个组大鼠中脑黑质多巴胺能神经元染色的结果；
图6为免疫荧光对大鼠中脑黑质多巴胺能神经元计数的统计结果；
图7为ELASA检测6个组大鼠血清中超氧化物歧化酶SOD的统计结果。
具体实施方式
本发明提供了刺梨醇提取物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
在本发明中，所述刺梨醇提取物的制备方法优选包括：将刺梨与乙醇溶液混合后进行提取，得到提取液，将所述提取液抽滤、烘干，得到刺梨提取物。在本发明中，所述刺梨与乙醇溶液的体积比优选为0.5～1.5:8～12，更优选为1:10。在本发明中，所述乙醇溶液的体积百分含量优选为70～80％，更优选为75％。在本发明中，所述提取的次数优选为2次，所述提取的温度优选为75～85℃，更优选为80℃，每次提取的时间优选为1.5～2.5h，更优选为 2h。在本发明中，所述干燥的温度优选为90～110℃，更优选为100℃；所述干燥的时间优选在27h以上。在本发明中，所述刺梨的产地优选为贵州。
本发明对将刺梨醇提取物制成的药物的剂型没有特殊限定，采用刺梨醇提取物在医学上可接收的剂型即可，本发明对药物中刺梨醇提取物的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。
本发明还提供了刺梨醇提取物在制备保护6-OHDA对多巴胺神经元损伤的药物中的应用。在本发明中，所述保护优选包括减轻多巴胺神经元的损伤。本发明对将刺梨醇提取物制成的药物的剂型没有特殊限定，采用刺梨醇提取物在医学上可接收的剂型即可，本发明对药物中刺梨醇提取物的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。
本发明还提供了刺梨醇提取物在制备改善帕金森动物模型运动功能缺陷的药物中的应用。本发明对将刺梨醇提取物制成的药物的剂型没有特殊限定，采用刺梨醇提取物在医学上可接收的剂型即可，本发明对药物中刺梨醇提取物的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。
本发明还提供了刺梨醇提取物在制备提高帕金森动物模型血清中超氧化物歧化酶含量的药物中的应用。本发明对将刺梨醇提取物制成的药物的剂型没有特殊限定，采用刺梨醇提取物在医学上可接收的剂型即可，本发明对药物中刺梨醇提取物的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、实验过程
1.实验材料和仪器
1.1实验动物
SD雄性大鼠，体重200～250g，购自于第三军医大学大坪医院动物实验中心(许可证：SCXK(渝)2012-0005)，动物饲养于遵义医学院基础药理教育部重点实验室SPF动物房，各组实验动物自由进食、饮水。
1.2主要仪器设备
疲劳转棒仪ZH-300(安徽正华生物仪器设备有限公司)，大鼠脑立体定位仪(美国Narishige公司)，OLYMPUS光学显微镜(日本OLYMPUS 公司)，BSS－110电子分析天平(北京赛多利斯电子天平有限公司)，Milli QA纯水处理器(Millipore公司)等。
1.3主要实验试剂
刺梨提取物(以下简称RRT)；6-羟基多巴胺(6-OHDA)，纯度≥98％(Sigma公司)；酪氨酸羟化酶(TH)兔抗多克隆抗体(英国Abcam 公司)；荧光二抗(英国abcam公司)；TritonX-100(上海生工生物工程公司)；山羊血清原液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
刺梨提取物的制备：
将刺梨与体积百分含量为75％乙醇溶液的体积比为1:10混合后进行提取，提取温度为80℃，提取2次，每次提取时间为2h，合并两次的提取液，得到总提取液，将总提取液抽滤、在100℃下烘干27h以上，得到刺梨提取物。刺梨的产地为贵州。
2.实验方法
2.1实验分组
72只SD大鼠，雄性，体重200～250g，随机分为6组，每组12只，分别设为空白对照组RRT(200mg/kg)单独给药组、6-OHDA组、 6-OHDA+RRT(50mg/kg)组、6-OHDA+RRT(100mg/kg)组和 6-OHDA+RRT(200mg/kg)组。
2.2制备动物模型
除空白组和RRT(200mg/kg)单独给药组外，用7％水合氯醛 (0.5ml/100g)腹腔注射麻醉SD大鼠，然后在无菌条件下，以前囟为坐标原点，前囟后5.2mm，中线旁2.2mm，硬膜下8.0mm，匀速注入4μL 的2μg/μL的6-OHDA溶液。
2.3给药
造模后1天，取0.2g、0.4g和1.6g刺梨提取物分别溶于三个含有40ml 超纯水的避光蓝口瓶中制成灌胃混悬液，每天灌胃1次，连续给药14天。同时对空白组和6-OHDA组分别灌胃给予相同体积的超纯水。
2.4行为学检测
2.4.1转棒实验
大鼠在给药第14天进行转棒实验，设置初始转速为10r/min，然后每隔60s速度增加5r/min，以此直到大鼠从转棒轴上掉下来或300s后，系统会自动感应并记录整个实验过程，比较各组大鼠的行为活动能力。
2.4.2旷场实验
大鼠在给药第14天进行旷场实验，将每只大鼠都置于单独的开阔区域，5min内记录其行为参数。在下一次开始前，用75％酒精溶液清洗装置，以消除老鼠之前的气味。计算机记录大鼠在中央和外周的运动距离。实验结束后，计算大鼠运动总距离。
2.5取材和标本制备
在第14天转棒实验进行完毕后，大鼠用7％水合氯醛麻醉后，每组5只取血，打开其腹腔，夹闭腹主动脉，剪开胸腔，充分暴露心脏，将透灌针经心尖插至主动脉，止血钳固定并剪开右心耳，灌注0.1M PBS至大脑内的血液冲洗干净，取7只分脑，样本放-80度保存。其余再注入预冷至4℃的4％多聚甲醛，待头颈部位僵硬后直接断头取脑，放在4℃的4％多聚甲醛溶液中恒温固定48小时，再放入30％蔗糖溶液中脱水12小时，然后进行冰冻切片，切片时取中脑位置连续切片，厚度为35μm，将切片置于4℃保存。
2.6蛋白定量
2.6.1提取：取大鼠中脑黑质每只约50mg于冰上加入(高效细胞组织裂解液和凝酸酶抑制剂100：1)，研磨至组织块状至细小碎片，在冰上放置30min，于4度高速离心机中离心15min，取上清液于新的1.5mlEP管中。
2.6.2定量：每个样本蛋白取2μm稀释50倍于250μmEP管中，配制标准曲线，加入96孔板中，一个复孔，加入BCA溶液，37度烘箱里孵育30min， 562nm测光密度，根据定量曲线拟合计算出蛋白浓度。根据蛋白浓度，计算出上样体系中蛋白原液的浓度、PBS和上层缓冲液的比例，配体系，变性。
2.7蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测中脑黑质多巴胺能神经元标记物TH蛋白的表达。
1)夹板、加电泳液。
2)加样：样本10μl/30mg、marker2μl。
3)电泳：80伏特30-40分钟，加压：120伏特跑约40分钟停止。
4)转膜：剪尺寸适中的PVDF膜，提前泡甲醇5-10分钟；滤纸泡上电转液；三明治：滤纸→PVDF膜→凝胶→滤纸(滤纸光滑面朝内)。
5)电转：25V,1A，30分钟。
6)TBST洗膜10分钟х3次。
7)5％脱脂牛奶孵育2小时。TBS洗10分钟х3次。
8)切条带，一抗4度过夜。
9)TBS洗10分钟х3次，二抗孵育30分钟。
10)TBS洗10分钟х3次，曝光，结果保存。
2.8.免疫荧光实验
从4℃冰箱取出备好的脑片，每隔6片取一片，每组各取6片，用免疫组化法观察多巴胺能神经元损伤情况。操作步骤如下：
1)4℃取出恢复至室温。
2)用预先配置好的0.3％TritonX-100室温处理15min，然后PBS洗涤 5min并重复洗涤3次；
3)3％H2O2室温处理15min，然后PBS洗涤5min并重复洗涤3次；
4)100％山羊血清37℃封闭30min；
5)按1:300的比例配制TH抗体，4℃过夜；
6)恢复室温30min，PBS洗涤5min，3次；
7)加入荧光二抗(全程避光)，37℃反应30min，然后PBS洗涤5min 并重复洗涤3次；
8)37度烘箱烘干，甘油封片。
10)荧光显微镜下(4×)观看并拍照、计数。
2.9数据的统计分析
实验数据用SPSS21.0统计软件统计，所有数据以(Mean±SEM)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)比较均数的组别差异，方差齐性检验使用 LSD法，采用Dunnett’s T3比较均数的组别差异，P<0.05有统计学意义。
2.10.采用ELISA试剂盒测定大鼠血清超氧歧化酶SOD的结果。
实验结果显示：图1是旷场实验检测大鼠运动轨迹结果，图2是旷场实验检测大鼠运动距离的统计结果，如图1和图2；与空白对照组相比，6-OHDA 造模组大鼠运动轨迹和运动距离明显减少，说明6-OHDA能抑制大鼠的运动能力；和6-OHDA造模组相比，RRT(100mg/kg)和RRT(200mg/kg)给药组明显增加了6-OHDA损伤大鼠的运动轨迹和运动距离。图3为转棒实验检测大鼠运动平衡及运动能力的统计结果，由图3可以看出；与空白对照组相比，6-OHDA造模组大鼠在棒时间明显减少，说明6-OHDA能抑制大鼠的在棒时间；和6-OHDA造模组相比，RRT(100mg/kg)和RRT(200mg/kg) 给药组明显延长了6-OHDA损伤大鼠的在棒时间，由图1、图2和图3结果可以说明RRT可以改善6-OHDA损伤的大鼠的运动能力。图4是蛋白质免疫印迹(WB)检测大鼠中脑黑质多巴胺能神经元蛋白表达的统计结果，如图4所示；与空白对照组相比，6-OHDA造模组大鼠中脑黑质多巴胺能神经元蛋白明显减少，和6-OHDA造模组相比，RRT(100mg/kg)和 RRT(200mg/kg)给药组则延缓了6-OHDA损伤大鼠的多巴胺能神经元蛋白的缺失，说明RRT对6-OHDA损伤的多巴胺能神经元有保护作用。图5是免疫荧光检测大鼠中脑黑质多巴胺能神经元标记物TH的结果，图6为TH 免疫荧光计数统计结果，由图5和图6所示，6-OHDA组与空白组比较，给予6-OHDA后大鼠中脑黑质内多巴胺能神经元的树突明显缺失，多巴胺能神经元数量明显减少，显示出6-OHDA对大鼠中脑黑质内多巴胺能神经元的损伤明显；与6-OHDA多巴胺造模组相比，RRT(100mg/kg)和RRT(200mg/kg) 给药组明显减轻了6-OHDA对多巴胺能神经元的损伤。图7为ELASA试剂盒对大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)的统计结果，如图7所示；与空白对照组相比，6-OHDA造模组大鼠SOD的量明显减少，说明6-OHDA对SOD 有抑制作用，而RRT(100mg/kg)和RRT(200mg/kg)给药组则延缓了SOD 的减少。
本发明从整体实验角度，通过旷场实验、转棒实验和免疫荧光染色得出刺梨提取物(RRT)能够保护多巴胺能神经元，改善运动功能缺陷。通过 ELISA验证RRT可以提高6-OHDA损伤的大鼠血清中的超氧化物歧化酶 SOD的量，从而表明RRT对帕金森病具有治疗或者预防作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.刺梨醇提取物作为唯一活性成分在制备治疗帕金森病的药物或在制备改善帕金森动物模型运动功能缺陷的药物中的应用；
所述刺梨醇提取物的制备方法包括：将刺梨与乙醇溶液混合后进行提取，得到提取液，将所述提取液抽滤、烘干，得到刺梨提取物；
所述乙醇的体积百分含量为70～80％。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述刺梨与乙醇溶液的体积比为0.5～1.5:8～12。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取的次数为2次，所述提取的温度为75～85℃。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述烘干的温度为90～110℃，所述烘干的时间在27h以上。
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