CN111821347A - 一种延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用，所述延丹胶囊可治疗由心肌缺血所引起的疾病包括心律失常、心肌梗死、冠心病，所述应用包括对延丹胶囊抗心肌缺血药效的验证方法，包括如下步骤：首先：对延丹胶囊对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的作用及机制进行验证：本发明延丹胶囊主治气滞血瘀所致胸痹，可活血化瘀，理气宽胸，丹参作为活血化瘀的主药，对缺血性心脏病的预防和治疗具有显著的疗效。

Description

一种延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用。

背景技术

近年来，心肌缺血性疾病严重威胁着人类的健康，如心律失常、心肌梗死、冠心病等。其发生率和死亡率呈逐年上升趋势，严重影响着人们的生命健康安全。心肌缺血临床症状多表现为心慌、胸闷或胸痛，常用药物有抗血小板药、β受体阻断剂和钙离子拮抗剂等。由于，长期服用西药容易产生副作用，因此，研究并开发可用于治疗心肌缺血的中药逐渐成为趋势。

根据临床表现和病因病机，心肌缺血在中医理论体系中归属于“胸痹”“心痛”等范畴。本发明涉及的中药组合物原药材组成为：丹参、延胡索(醋制)、五灵脂、瓜蒌、乳香(醋制)、白芍、枳壳。主治气滞血瘀所致胸痹，可活血化瘀，理气宽胸。丹参作为活血化瘀的主药，对缺血性心脏病的预防和治疗具有显著的疗效，且具有多靶点、生物活性成分丰富的治疗优势。其主要成分丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹参酮IIA等是防治心血管疾病的重要活性成分。延胡索中的生物总碱、延胡索乙素等成分都具有抗心律失常和心肌缺血防护作用。

目前对于心肌缺血的治疗方法多为西药、介入手术等，可起到抗血小板聚集、稳定动脉粥样斑块、改善心脏供血等作用，但存在抗血小板药物耐药性、毒副作用、心肌组织灌注不良、支架内再狭窄等问题。中药制剂在治疗心血管疾病方面疗效确切，毒副作用低，具有良好的发展前景。

发明内容

本发明目的就是为提供一种延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用

所述延丹胶囊可治疗由心肌缺血所引起的疾病包括心律失常、心肌梗死、冠心病。

所述应用包括对延丹胶囊抗心肌缺血药效的验证方法，包括如下步骤：

首先：对延丹胶囊对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的作用及机制进行验证：

1.材料准备；

1.1药物和试剂：延丹胶囊；通心络胶囊；盐酸异丙肾上腺素；生理盐水注射液；水合氯醛；甲醛；MDA、T-SOD、AST检测试剂盒；HIF-1α检测试剂盒；IL-1β(批号E20191001A)、TNF-α检测试剂盒；Nrf2抗体；HO-1抗体；p53抗体；Bcl-2抗体；Bax抗体；GAPDH抗体；

1.2动物：SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重200±20g，大鼠在标准实验条件下，温度25±2℃，相对湿度60±5％适应性饲养1周后，进行随机分组，同时给予正常昼夜节律，提供自由饮水和进食；

1.3仪器：BL-420N生物信号采集与分析系统；分析天平；全波长酶标仪；KD-BM生物组织包埋机；Leica RM2235切片机；正置生物显微镜BX53；EPS600电泳仪；Western blot转膜仪；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统；

2方法：

2.1造模及给药：将60只SD大鼠，雌雄各半，随机分成空白组，模型组，通心络胶囊组，剂量为200.57mg/kg，延丹胶囊低、中、高剂量组，剂量为154、308、616mg/kg，其中，延丹胶囊中剂量为临床用量，人与大鼠等效剂量换算比例为1:6，SD大鼠连续灌胃给药8d，给药容积为1ml/100g，空白组和模型组给予等量的生理盐水，第6-8天，灌胃给药30min后，除空白组外，其余组大鼠腹腔注射ISO 40mg/kg，连续注射3d，空白组注射等量的生理盐水，用于构建急性心肌缺血模型；

2.2心肌缺血大鼠心电图监测：第6天灌胃给药30mim后，10％水合氯醛麻醉各组大鼠，等大鼠进入麻醉状态后，腹腔注射ISO，40mg/kg，并对大鼠立即进行肢体Ⅱ导联心电图检查，记录ST段的变化；

2.3血清因子检测：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开腹腔，腹主动脉采血至无菌试管内，静置30min，3000r/min离心15min，分离血清后测定其中MDA、T-SOD、AST、HIF-1α、TNF-α和IL-1β水平，按照各试剂盒说明书中的方法进行操作，利用全波长酶标仪检测；

2.4心肌组织病理学检查：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开胸腔，取下心脏，选取左心室组织，置于装有10％甲醛溶液的离心管中固定48h，采用HE染色法观察心肌组织的病理变化；

2.5 Western Blotting：称取200mg心肌组织，加入液氮后在研钵中充分研磨，加入裂解液充分混匀，冰上裂解30min，4℃，12 000r/min离心30min，取上清；BCA试剂盒进行蛋白定量，调整蛋白浓度；蛋白变性后，上样、电泳、转膜；加入一抗4℃下孵育过夜，TBST清洗后加入二抗，室温孵育2h，TBST清洗，加入ECL发光液进行曝光，扫描图像后利用Image J软件分析实验结果，目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值的比值为目的蛋白的相对含量；

2.6免疫组化：每组中取3只大鼠心脏用10％福尔马林进行固定,经脱水、石蜡包埋,常规切片4μm，再依次进行脱蜡，水化，抗原修复，一抗孵育，二抗孵育，苏木精核染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干，显微镜下对左心室心肌细胞进行观察并拍照，利用Image J软件对图片进行阳性细胞率统计；

2.7统计学分析：除心电图实验结果采用t检验外，其余数据均采用单因素方差分析，用x±SEM表示，统计软件为GraphPad Prism 5.01，P<0.05被认为有统计学差异；

3结果分析：通过观察心肌缺血大鼠心电图ST段的变化、心肌组织病理变化，以及MDA、AST及炎症因子等指标水平的变化，可以发现延丹胶囊能否有效的降低急性心肌缺血大鼠ST段异常抬高，减轻心肌组织的病理损伤程度，显著降低大鼠血清中MDA、AST、HIF-1α和TNF-α水平，显著升高T-SOD水平，据此判断延丹胶囊对异丙肾上腺素致SD大鼠急性心肌缺血损伤是否具有良好的保护作用。

本发明的优点是：

根据临床表现和病因病机，心肌缺血在中医理论体系中归属于“胸痹”“心痛”等范畴。本发明涉及的中药组合物原药材组成为：丹参、延胡索(醋制)、五灵脂、瓜蒌、乳香(醋制)、白芍、枳壳。主治气滞血瘀所致胸痹，可活血化瘀，理气宽胸，丹参作为活血化瘀的主药，对缺血性心脏病的预防和治疗具有显著的疗效，且具有多靶点、生物活性成分丰富的治疗优势，其主要成分丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹参酮IIA等是防治心血管疾病的重要活性成分，延胡索中的生物总碱、延胡索乙素等成分都具有抗心律失常和心肌缺血防护作用；现有技术对于心肌缺血的治疗方法多为西药、介入手术等，可起到抗血小板聚集、稳定动脉粥样斑块、改善心脏供血等作用，但存在抗血小板药物耐药性、毒副作用、心肌组织灌注不良、支架内再狭窄等问题。中药制剂在治疗心血管疾病方面疗效确切，毒副作用低，具有良好的发展前景。

附图说明

图1为本发明试验中延丹胶囊对各试验对照组心肌缺血大鼠心脏HE染色结果(HE，×40)图；

图2为本发明试验中延丹胶囊对各试验对照组心肌缺血大鼠血清中MDA、T-SOD和AST水平的影响对照图；

图3为本发明试验中延丹胶囊对各试验对照组心肌缺血大鼠血清中HIF-1α水平的影响对照图；

图4为本发明试验中延丹胶囊对各试验对照组心肌缺血大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平的影响对照图：

图5为发明试验中延丹胶囊对各试验对照组心肌缺血大鼠心脏组织中Nrf2/HO-1/p53信号通路相关蛋白的影响对照图：

图6为发明试验中延丹胶囊各试验对照组心肌缺血大鼠心脏组织中Bcl-2/Bax蛋白表达水平的影响对照图；

图7为发明试验中延丹胶囊对心肌缺血大鼠心脏组织中Nrf2和p53蛋白水平的影响(×40)对照图；

具体实施方式

如图1所示，延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用

所述延丹胶囊可治疗由心肌缺血所引起的疾病包括心律失常、心肌梗死、冠心病。

所述应用包括对延丹胶囊抗心肌缺血药效的验证方法，包括如下步骤：

首先：对延丹胶囊对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的作用及机制进行验证：

1.材料准备；

1.1药物和试剂：延丹胶囊；通心络胶囊；盐酸异丙肾上腺素；生理盐水注射液；水合氯醛；甲醛；MDA、T-SOD、AST检测试剂盒；HIF-1α检测试剂盒；IL-1β(批号E20191001A)、TNF-α检测试剂盒；Nrf2抗体；HO-1抗体；p53抗体；Bcl-2抗体；Bax抗体；GAPDH抗体；

1.2动物：SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重200±20g，大鼠在标准实验条件下，温度25±2℃，相对湿度60±5％适应性饲养1周后，进行随机分组，同时给予正常昼夜节律，提供自由饮水和进食；

1.3仪器：BL-420N生物信号采集与分析系统；分析天平；全波长酶标仪；KD-BM生物组织包埋机；Leica RM2235切片机；正置生物显微镜BX53；EPS600电泳仪；Western blot转膜仪；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统；

2方法：

2.1造模及给药：将60只SD大鼠，雌雄各半，随机分成空白组，模型组，通心络胶囊组，剂量为200.57mg/kg，延丹胶囊低、中、高剂量组，剂量为154、308、616mg/kg，其中，延丹胶囊中剂量为临床用量，人与大鼠等效剂量换算比例为1:6，SD大鼠连续灌胃给药8d，给药容积为1ml/100g，空白组和模型组给予等量的生理盐水，第6-8天，灌胃给药30min后，除空白组外，其余组大鼠腹腔注射ISO 40mg/kg，连续注射3d，空白组注射等量的生理盐水，用于构建急性心肌缺血模型；

2.2心肌缺血大鼠心电图监测：第6天灌胃给药30mim后，10％水合氯醛麻醉各组大鼠，等大鼠进入麻醉状态后，腹腔注射ISO，40mg/kg，并对大鼠立即进行肢体Ⅱ导联心电图检查，记录ST段的变化；

2.3血清因子检测：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开腹腔，腹主动脉采血至无菌试管内，静置30min，3000r/min离心15min，分离血清后测定其中MDA、T-SOD、AST、HIF-1α、TNF-α和IL-1β水平，按照各试剂盒说明书中的方法进行操作，利用全波长酶标仪检测；

2.4心肌组织病理学检查：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开胸腔，取下心脏，选取左心室组织，置于装有10％甲醛溶液的离心管中固定48h，采用HE染色法观察心肌组织的病理变化；

2.5Western Blotting：称取200mg心肌组织，加入液氮后在研钵中充分研磨，加入裂解液充分混匀，冰上裂解30min，4℃，12 000r/min离心30min，取上清；BCA试剂盒进行蛋白定量，调整蛋白浓度；蛋白变性后，上样、电泳、转膜；加入一抗4℃下孵育过夜，TBST清洗后加入二抗，室温孵育2h，TBST清洗，加入ECL发光液进行曝光，扫描图像后利用Image J软件分析实验结果，目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值的比值为目的蛋白的相对含量；

2.6免疫组化：每组中取3只大鼠心脏用10％福尔马林进行固定,经脱水、石蜡包埋,常规切片4μm，再依次进行脱蜡，水化，抗原修复，一抗孵育，二抗孵育，苏木精核染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干，显微镜下对左心室心肌细胞进行观察并拍照，利用Image J软件对图片进行阳性细胞率统计；

2.7统计学分析：除心电图实验结果采用t检验外，其余数据均采用单因素方差分析，用x±SEM表示，统计软件为GraphPad Prism 5.01，P<0.05被认为有统计学差异；

3结果：心肌缺血损伤大鼠心电图：腹腔注射ISO(40mg/kg)后，空白组大鼠心电图ST段无显著性变化。与空白组比较，模型组大鼠ST段值显著性升高(P<0.01)；与模型组比较，延丹胶囊低、中、高剂量组心电图ST段都显著性降低(P<0.05，P<0.01)；

见表1。

表1延丹胶囊对心肌缺血大鼠心电图ST段的影响

注：采用t检验，与空白对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

3.2心肌组织病理学空白组心肌细胞排列整齐有序，横纹清晰，无纤维结构改变，无大量炎性细胞浸润；大鼠给予异丙肾上腺素(Isoprenaline，ISO)后，模型组横纹断裂，心肌细胞排列紊乱，出现肌丝溶解，大量炎性细胞浸润等病理变化；而延丹胶囊中、高剂量组能明显改善心肌组织的病理病变；

3.2心肌组织病理学：空白组心肌细胞排列整齐有序，横纹清晰，无纤维结构改变，无大量炎性细胞浸润；大鼠给予异丙肾上腺素(Isoprenaline，ISO)后，模型组横纹断裂，心肌细胞排列紊乱，出现肌丝溶解，大量炎性细胞浸润等病理变化；而延丹胶囊中、高剂量组能明显改善心肌组织的病理病变。

3.3大鼠血清中MDA、T-SOD和AST水平：与空白组比较，模型组大鼠血清中MDA、AST水平明显升高(P<0.01)，T-SOD水平明显降低(P<0.01)。而给予不同剂量延丹胶囊进行预保护后，大鼠血清中MDA、AST水平明显降低(P<0.01)，T-SOD水平明显升高(P<0.05，P<0.01)。

3.4大鼠血清中HIF-1α水平与空白组比较，模型组大鼠血清中HIF-1α水平明显升高(P<0.01)。而给予不同剂量延丹胶囊进行预保护后，大鼠血清中HIF-1α水平明显降低(P<0.01)。

3.5大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平与空白组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.01)。而给予不同剂量延丹胶囊进行预保护后，大鼠血清中TNF-α水平明显降低(P<0.01)；IL-1β水平虽也有降低趋势，但无统计学意义。

3.6延丹胶囊对Nrf2/HO-1/p53信号通路相关蛋白的影响与空白组比较，模型组Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显下降(P<0.01)，而p53蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。给予延丹胶囊后，Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05，P<0.01)，同时，p53蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。

3.7延丹胶囊对Bcl-2/Bax蛋白水平的影响与空白组比较，模型组Bcl-2/Bax水平明显下降(P<0.01)。给予延丹胶囊后，Bcl-2/Bax水平显著性升高(P<0.01)。

3.8心脏组织Nrf2和p53蛋白表达情况免疫组化结果显示，与空白组比较，模型组心脏组织中Nrf2蛋白表达的阳性细胞率明显下降(P<0.01)。给予延丹胶囊后，该蛋白表达率明显上升(P<0.05)。p53呈现明显的相反趋势，与空白组比较，模型组心脏组织中p53蛋白表达的阳性细胞率明显上升(P<0.01)。给予延丹胶囊后，p53蛋白表达的阳性细胞率明显下降(P<0.01)。

4.结论：

通过观察心肌缺血大鼠心电图ST段的变化、心肌组织病理变化，以及MDA、AST及炎症因子等指标水平的变化，可以发现延丹胶囊能有效的降低急性心肌缺血大鼠ST段异常抬高，减轻心肌组织的病理损伤程度，显著降低大鼠血清中MDA、AST、HIF-1α和TNF-α水平，显著升高T-SOD水平。因此，延丹胶囊对异丙肾上腺素(Isoprenaline，ISO)致SD大鼠急性心肌缺血损伤具有良好的保护作用，其作用与改善细胞氧化应激及炎症水平相关。

从Western blotting和IHC实验结果可以看出，延丹胶囊能够明显降低p53和Bax蛋白的表达，而显著提高Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白的表达。即延丹胶囊可以通过改善氧化应激水平，发挥抗凋亡作用，从而对ISO致大鼠急性心肌缺血损伤具有改善作用。

综上所述，延丹胶囊对ISO致大鼠急性心肌缺血损伤具有良好的保护作用，其作用机制可能与抗氧化，抗炎，改善细胞凋亡等因素相关。

Claims (3)

1.延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述延丹胶囊可治疗由心肌缺血所引起的疾病包括心律失常、心肌梗死、冠心病。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述应用包括对延丹胶囊抗心肌缺血药效的验证方法，包括如下步骤：

首先：对延丹胶囊对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的作用及机制进行验证：

1.材料准备；

1.1药物和试剂：延丹胶囊；通心络胶囊；盐酸异丙肾上腺素；生理盐水注射液；水合氯醛；甲醛；MDA、T-SOD、AST检测试剂盒；HIF-1α检测试剂盒；IL-1β(批号E20191001A)、TNF-α检测试剂盒；Nrf2抗体；HO-1抗体；p53抗体；Bcl-2抗体；Bax抗体；GAPDH抗体；

1.2动物：SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重200±20g，大鼠在标准实验条件下，温度25±2℃，相对湿度60±5％适应性饲养1周后，进行随机分组，同时给予正常昼夜节律，提供自由饮水和进食；

1.3仪器：BL-420N生物信号采集与分析系统；分析天平；全波长酶标仪；KD-BM生物组织包埋机；Leica RM2235切片机；正置生物显微镜BX53；EPS600电泳仪；Western blot转膜仪；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统；

2方法：

2.1造模及给药：将60只SD大鼠，雌雄各半，随机分成空白组，模型组，通心络胶囊组，剂量为200.57mg/kg，延丹胶囊低、中、高剂量组，剂量为154、308、616mg/kg，其中，延丹胶囊中剂量为临床用量，人与大鼠等效剂量换算比例为1:6，SD大鼠连续灌胃给药8d，给药容积为1ml/100g，空白组和模型组给予等量的生理盐水，第6-8天，灌胃给药30min后，除空白组外，其余组大鼠腹腔注射ISO 40mg/kg，连续注射3d，空白组注射等量的生理盐水，用于构建急性心肌缺血模型；

2.2心肌缺血大鼠心电图监测：第6天灌胃给药30mim后，10％水合氯醛麻醉各组大鼠，等大鼠进入麻醉状态后，腹腔注射ISO，40mg/kg，并对大鼠立即进行肢体Ⅱ导联心电图检查，记录ST段的变化；

2.3血清因子检测：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开腹腔，腹主动脉采血至无菌试管内，静置30min，3000r/min离心15min，分离血清后测定其中MDA、T-SOD、AST、HIF-1α、TNF-α和IL-1β水平，按照各试剂盒说明书中的方法进行操作，利用全波长酶标仪检测；

2.4心肌组织病理学检查：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开胸腔，取下心脏，选取左心室组织，置于装有10％甲醛溶液的离心管中固定48h，采用HE染色法观察心肌组织的病理变化；

2.5Western Blotting：称取200mg心肌组织，加入液氮后在研钵中充分研磨，加入裂解液充分混匀，冰上裂解30min，4℃，12 000r/min离心30min，取上清；BCA试剂盒进行蛋白定量，调整蛋白浓度；蛋白变性后，上样、电泳、转膜；加入一抗4℃下孵育过夜，TBST清洗后加入二抗，室温孵育2h，TBST清洗，加入ECL发光液进行曝光，扫描图像后利用Image J软件分析实验结果，目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值的比值为目的蛋白的相对含量；

2.6免疫组化：每组中取3只大鼠心脏用10％福尔马林进行固定,经脱水、石蜡包埋,常规切片4μm，再依次进行脱蜡，水化，抗原修复，一抗孵育，二抗孵育，苏木精核染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干，显微镜下对左心室心肌细胞进行观察并拍照，利用Image J软件对图片进行阳性细胞率统计；

2.7统计学分析：除心电图实验结果采用t检验外，其余数据均采用单因素方差分析，用x±SEM表示，统计软件为GraphPad Prism 5.01，P<0.05被认为有统计学差异；

3结果分析：通过观察心肌缺血大鼠心电图ST段的变化、心肌组织病理变化，以及MDA、AST及炎症因子等指标水平的变化，可以发现延丹胶囊能否有效的降低急性心肌缺血大鼠ST段异常抬高，减轻心肌组织的病理损伤程度，显著降低大鼠血清中MDA、AST、HIF-1α和TNF-α水平，显著升高T-SOD水平，据此判断延丹胶囊对异丙肾上腺素致SD大鼠急性心肌缺血损伤是否具有良好的保护作用。

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