CN114869952A - 地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,生殖系统损伤包括性激素水平下降,精子与卵泡计数异常,和产仔、受孕异常。使用地骨皮提取物制备的药物能够发挥其对雌性和雄性生殖系统损伤的修复作用,不仅可以显著提高激素内分泌水平和基础代谢功能,还可以提高精子活力和卵泡发育能力,改善睾丸和卵巢形态结构,从而有效修复生殖系统损伤,改善产仔和受孕功能。
Description
技术领域
本发明涉及植物化学技术领域,具体涉及地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用。
背景技术
化疗、放疗、毒物和疾病以及其他持久或非持久性生物累积性化学品、农药、药品和护理产品成分,有机金属化学品和植物雌激素等多个干扰因素通过神经和内分泌的调控下进行的一系列复杂的损伤和影响,使男性或女性生殖系统的功能遭到干扰,引起基础代谢水平及激素内分泌水平的紊乱,降低睾丸和卵巢功能,甚至影响其生长发育和形态结构,这些均可导致女性不孕或男性不育方面的问题。
地骨皮(Cortex Lycii Radicis)为茄科落叶灌木枸杞(Lycium Chinense Mil·l)或宁夏枸杞(Lycium Barbarum L·)的干燥根皮。春初或秋后釆挖根部,洗净,剥去根皮,晒干。国内外在植物分类生药鉴定、化学成分、药理作用等方面对中药地骨皮已作了一定的工作。地骨皮性味甘寒,归肺、肝、肾经,主要功效为凉血除蒸、清肺降火,用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、肺热咳嗽、咯血、衄血、内热消渴,因此临床上被应用于治疗各种疾病。现代药理研究表明其具有多种生物学活性,有降血糖、降血压、降血脂、抑菌、解热镇痛和治疗皮肤病的作用,目前地骨皮解热镇痛抗菌的作用被广泛应用,因其含有褪黑素,可通过改变生物节律来有效促进生理性睡眠冲动,改善睡眠质量的作用。
专利CN102579795B公开了一种抗衰老中药组合物在制备改善男性生育功能药物中的用途,该中药复方包括生地黄12~18份,红参3.5~8.5份,茯苓1~4份,麦冬0.6~2份,天冬0.5~2.5份,地骨皮0.8~1.8份,对于气阴两虚的患者,采用益气养阴疗法,有利于补肾培元。但对于地骨皮在该中药复方中具体的作用和相关机理并没有明确记载,也没有记载地骨皮在提高激素水平和内分泌功能方面的应用。因此,目前对于使用地骨皮提取物制备治疗与生殖系统有关的疾病的药物还没有相关的研究。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题,本发明提供了地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,可用于制备治疗生殖系统损伤的药物。
地骨皮中含有生物碱类、酰胺类、蒽醌类、苯丙素类、有机酸类、肽类、萜类和黄酮类等多种成分,已知的具体成分有甜菜碱、地骨皮乙素、地骨皮甲素、东莨菪内酯等。其中酚类成分为地骨皮中主要成分,包括地骨皮甲素和地骨皮乙素等。地骨皮甲素和地骨皮乙素属于精胺类生物碱,实验表明,地骨皮甲素和乙素可以阻断细胞的炎症活化,避免免疫反应紊乱等,另外,还可以拮抗细菌内毒素,同时,地骨皮甲素和地骨皮乙素还是降压的主要成分。本申请将地骨皮中的多酚类提取物用于制备治疗与生殖系统有关的疾病的药物,更好地应用于治疗生殖系统损伤。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其中,生殖系统损伤包括性激素水平下降,精子与卵泡计数异常,和产仔、受孕异常。
进一步地,所述地骨皮提取物的制备方法为:以地骨皮为原料,经过水提取和醇提取,得到地骨皮提取物。
进一步地,所述水提取的步骤包括:
(1)称取地骨皮粉末,加入纯净水中混合;
(2)充分搅拌至混合均匀,煎煮2~4次,过滤并合并煎煮所得的滤液,浓缩至稠膏,-110℃冷冻真空干燥,过80目筛,得到地骨皮水提取物,置于4℃环境下保存备用。
进一步地,所述醇提取的步骤包括:
(1)称取所述地骨皮水提取物,加入乙醇水溶液,浸泡搅拌;
(2)在预先设置温度为60℃的超声波清洗器中浸提50min;
(3)将浸提得到的溶液浓缩,抽滤,加入乙酸乙酯萃取,滤液静置分层,取下层相,加入CaCl2生成沉淀,于离心机上以4000rpm的速度离心,得到地骨皮提取物。
优选地,所述地骨皮粉末和纯净水的料液质量比为1:8~10。
优选地,所述乙醇水溶液的浓度为50~70%。
进一步地,修复生殖系统损伤的产品包括修复生殖系统损伤的药物和修复生殖系统损伤的保健品。
进一步地,所述产品的剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、缓控释制剂、丸剂、酒剂或混悬剂。
本申请首次证实地骨皮提取物具有完全不同于以上所述的新功能:地骨皮提取物对生殖系统的损伤有很好的治疗作用。使用地骨皮提取物制备的药物能够发挥其对雌性和雄性生殖系统损伤的修复作用,不仅可以显著提高激素内分泌水平和基础代谢功能,还可以提高精子活力和卵泡发育能力,改善睾丸和卵巢形态结构,从而有效修复生殖系统损伤,改善产仔和受孕功能。
附图说明
下面对说明书附图所表达的内容做简要说明:
图1是雄性大鼠睾丸器官指数的检测结果统计图;
图2是雌性大鼠卵巢器官指数的检测结果统计图;
图3是雌性大鼠AMH水平检测结果统计图;
图4是雌性大鼠E2水平检测结果统计图;
图5是雌性大鼠LH水平检测结果统计图;
图6是雌性大鼠FSH水平检测结果统计图;
图7是雄性大鼠睾丸组织病理切片图;
图8是雌性大鼠卵巢组织病理切片图;
图9是雌性大鼠次级卵泡和窦状卵泡检测结果统计图;
图10是雌性大鼠卵巢中免疫组化染色分析p16和p21蛋白表达图;
图11是雄性大鼠睾丸中免疫组化染色分析p16和p21蛋白表达图;
图12是大鼠产仔率检测结果统计图;
图13是大鼠受孕率检测结果统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:地骨皮提取物的制备
本申请中的地骨皮提取物由如下制备方法制备:
S1:水提取:
(1)称取5g地骨皮粉末,以料液比=1∶8加入纯净水中混合;
(2)充分搅拌30min后,分别煎煮3次,每次煎煮1-1.5h,过滤并合并3次煎煮所得的滤液,浓缩至稠膏,-110℃冷冻真空干燥,过80目筛,得到地骨皮水提取物,置于4℃的冰箱中保存备用。
S2:醇提取:
(1)称取地骨皮水提取物粉末5g,置于锥形瓶中,加入浓度60%的乙醇水溶液100ml,浸泡搅拌2h;
(2)在预先设置温度为60℃的超声波清洗器中常规浸提50min;
(3)将浸提后的溶液浓缩至20ml,再进行抽滤,加入乙酸乙酯12ml,萃取2h,滤液静置分层,分别取上下相溶液,上层约12ml,保存备用;下层约20ml,向下层相中加入3mol/L的CaCl2溶液,静置2h,生成沉淀,于离心机上以4000rpm的速度离心10min,得到地骨皮提取物,置于4℃的冰箱内密封保存备用。
基于本地LC-MS平台代谢数据库对地骨皮提取物样本的物质成分进行质谱定性定量分析,得到地骨皮提取物中包含的物质成分如表1所示:
表1 地骨皮提取物中的具体代谢物成分(部分)及分类
实施例2:实验模型的准备
1)卵巢损伤及修复分组:
选取8周龄健康、性成熟的雌性SD大鼠60只,体重220-250g,正常饲养管理、自由进水进食,实验前适应性饲养三天。采用随机数表法将60只大鼠随机分组,具体分组及试验如下:
空白对照组:等量1%羧甲基纤维素钠灌胃28天;
卵巢损伤模型组:每天定时腹腔注射VCD(去氧乙烯基环己烯)(80mg/kg/d),诱导大鼠卵巢功能衰竭,每只大鼠根据体重调整给药量,连续用药15天,之后等量1%羧甲基纤维素钠灌胃28天;
地骨皮提取物治疗组:每天定时腹腔注射VCD(80mg/kg/d),每只大鼠根据体重调整给药量,连续用药15天,之后用1%羧甲基纤维素钠溶解的地骨皮提取物8mg/(kg·d),每日灌胃给药1次,连续灌胃28天。
2)睾丸损伤及修复分组:
选取8周龄的雄性SD大鼠60只,采用随机数表法分成3组,设置为空白对照组、损伤模型组、地骨皮提取物实验组,每组20只。为建立损伤模型,除空白对照组外,给予其余4组大鼠颈部皮下注射125mg/kg/d的D-半乳糖8周,而空白对照中的大鼠则给予皮下注射等量生理盐水8周。
在皮下注射D-半乳糖4周时,分别设置试验和分组如下:
空白对照组:给予同等量1%羧甲基纤维素钠灌胃4周,并且继续给予皮下注射D-半乳糖直至8周,诱导大鼠睾丸的亚急性衰老;
损伤模型组:给予同等量1%羧甲基纤维素钠灌胃4周,并且继续给予皮下注射D-半乳糖直至8周;
地骨皮提取物治疗组:用1%羧甲基纤维素钠溶解的地骨皮提取物8mg/(kg·d),连续灌胃给药4周,并且继续给予皮下注射D-半乳糖直至8周。
地骨皮提取物对修复生殖系统损伤的实验结果监测及数据收集:
1)器官指数变化监测
对各组大鼠造模实验前后一般情况及体质量进行记录,地骨皮提取物治疗开始后,以七天为一周期对大鼠体质量及状态进行记录并比较分析。
给药28d后记录大鼠体质量,提取睾丸组织和卵巢组织,使用分析天平分别称体质量和睾丸和卵巢湿质量。
卵巢损伤试验中为:卵巢指数=(卵巢湿重/体质量)×100%。
睾丸损伤试验中为:睾丸指数=(睾丸湿重/体质量)×100%。
大鼠的睾丸指数变化和卵巢指数变化如图1和图2所示。与空白对照组相比,损伤模型组雄性大鼠睾丸器官指数显著降低41.52%(P<0.05),与损伤模型组比较,地骨皮提取物灌胃治疗可显著性升高雄性大鼠睾丸器官指数34.69%(P<0.05),原因是地骨皮提取物缓解了睾丸的损伤作用,进而发挥了对睾丸组织结构的有益影响。
2)ELISA法检测血清性激素水平
大鼠经眼眶或者心脏采血,将收集于采血管的全血标本在室温放置2小时后,3000×r/min离心15分钟,取上清分装保存于-20℃或-80℃,避免反复冻融。取血清室温解冻,按照上海江莱实业股份有限公司ELISA试剂盒说明书,将血清样本稀释成适宜浓度,采用双抗体夹心法,将所需试剂和样品依次加入板条中,待反应完成后,立即在450nm波长处测定各孔的吸光度值(OD值),依据标准曲线,计算雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、抗缪勒管激素(AMH)及睾酮(T)的血清水平。
地骨皮提取物对雄性激素的影响检测结果如表2所示。
表2 地骨皮提取物治疗对雄性大鼠内分泌激素水平的影响比较(mean±SD,n=20)
#地骨皮提取物治疗组与损伤模型组比较P<0.05;*损伤模型组与空白对照组比较P<0.05
睾酮、促黄体素和促卵泡素与男性性功能、生育功能有着密切关系,可促进睾丸的发育,精子数量及质量,而在年龄、药物和环境干扰物等因素的影响,其分泌水平下降。地骨皮提取物治疗能显著提高生殖系统损伤模型雄性大鼠血清中睾酮、促黄体素和促卵泡素的含量(P<0.05)。
地骨皮提取物对雌性激素的影响检测结果如图3-6所示。地骨皮提取物治疗28天后,对所有各组大鼠心脏取血,检测血清中激素水平,损伤模型组FSH、LH水平高于空白对照组(P<0.05),E2水平降低(P<0.05);经过地骨皮提取物治疗后与损伤模型组相比FSH、LH不同程度降低(P<0.05),E2水平显著升高(P<0.05)。
3)苏木精-伊红(HE)染色法观察睾丸和卵巢组织形态学
按照常规方法取大鼠睾丸/卵巢标本,4%多聚甲醛固定过夜,常规方法脱水透明,石蜡包埋切片,切片厚度为5um。采用HE法对卵巢切片组织染色,普通光学显微镜下观察并拍照。
通过苏木精-伊红(HE)染色法观察随机选取的一只雄性大鼠生殖系统损伤模型睾丸组织病理切片,结果对比如图7所示,与损伤模型组比较,地骨皮提取物干预下的睾丸生精小管排列紧密,间质丰富,各级生精细胞形态、数量正常,排列规则,曲细精管的周围支持细胞数量增加,组织形态接近空白对照组。由此可知:地骨皮提取物可以不同程度的改善睾丸组织形态及结构。
通过苏木精-伊红(HE)染色法观察随机选取的一只雌性大鼠卵巢组织形态学的结果如图8所示,空白对照组大鼠卵巢皮髓质构造正常,可见较多的始基卵泡及各级发育中的卵泡和黄体,排卵前卵泡体积大,卵泡液含量多。
卵巢损伤模型组:镜下见大鼠卵巢组织内有较多数量的囊状扩张卵泡,卵泡内颗粒细胞层数显著减少甚至消失,不见卵母细胞及放射冠,黄体和发育各阶段的卵泡数量显著减少,卵泡膜细胞及间质细胞可见增生。
地皮骨提取物组:镜下见大鼠卵巢原始卵泡及初级卵泡数量增多,黄体数量增加。可证明地皮骨提取物组对卵巢的功能有修复作用。
4)卵巢卵泡计数
从每组大鼠卵巢切取35张连续的组织切片,每张切片厚度为5um,每隔4张切片取一张。经HE染色后,记录从每个卵巢获取的7张组织切片上共有的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡和成熟卵泡数,比较各组卵巢组织次级卵泡和窦状卵泡数量差异。
如图9所示,与损伤模型组相比,次级卵泡数及窦状卵泡数少于空白对照组(P<0.05),地骨皮提取物治疗组次级卵泡数及窦状卵泡数显著性升高(P<0.05)。
5)损伤因子p16表达和p21表达的检测
从雄性损伤试验中的每组中任取一只雄性大鼠的睾丸,从雌性损伤试验中的每组中任取一只雌性大鼠的睾丸进行损伤及地骨皮提取物治疗效果检测,按照常规的免疫组织化学染色定位p16和p21蛋白阳性表达位置、以及按照常规的免疫印迹法(western blot)检测大鼠睾丸和卵巢中p16和p21蛋白的表达水平,确定地骨皮提取物治疗对损伤的改善效果。
雌性大鼠卵巢中免疫组化染色分析p16和p21蛋白表达定位结果如图10所示,主要表达在卵母细胞、颗粒细胞和黄体以及卵巢间质中。空白对照组颗粒细胞层丰厚,可见清晰卵泡和黄体结构;损伤模型组较空白对照组细胞排列不均,卵泡数减少;地骨皮提取物组较模型组细胞排列整齐,颗粒细胞层较厚,可见卵泡发育。
雄性大鼠睾丸中免疫组化染色分析p16和p21蛋白表达定位结果如图11所示,空白对照p16和p21蛋白染色阳性表达主要精母细胞,而在损伤模型组中精子细胞、精母细胞和支持细胞均有阳性表达,在地骨皮提取物组支持细胞表达略有降低。
6)产仔率水平和受孕率检测
产仔率水平的分析中,(1)在卵巢损伤试验中,各组处理结束后,剩下的雌性大鼠与适龄的、确认繁殖功能正常的雄性大鼠合笼(雌:雄=2:1),并记录各组产仔数,对其产子率水平评估;(2)在睾丸损伤试验中,各组处理结束后,剩下的雄性大鼠与适龄的、确认繁殖功能正常的、动情周期正常的雌性大鼠合笼(雌:雄=3:1),并记录各组产仔数,对其产子率水平评估。
受孕率检测中,(1)在雌鼠损伤试验中以每组取半数雌鼠以雌∶雄=2∶1比例合笼交配;(2)在雄鼠损伤试验中以每组取半数雄鼠以雌∶雄=3∶1比例合笼交配。本申请的2组实验均在次日早晨肉眼观察雌鼠阴道,取阴道涂片进行检测。以肉眼发现阴栓,阴道涂片显微镜下发现精子为受孕标志,当日作为“受孕日”。持续合笼15d,如检测到阴栓及精子则停止试孕,单独放置。合笼15d结束后,解剖大鼠,裸眼观察子宫情况,统计胚胎着床情况,计算受孕率。
检测结果如图12和图13所示,可以看出,损伤模型组的雌鼠和雄鼠在子代只数和受孕率上相比空白对照组都大幅减少,经过地骨皮提取物治疗后,雌鼠和雄鼠的产仔率和受孕率均有显著的回升。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述生殖系统损伤包括性激素水平下降,精子与卵泡计数异常,和产仔、受孕异常。
3.根据权利要求1所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述地骨皮提取物的制备方法为:以地骨皮为原料,经过水提取和醇提取,得到地骨皮提取物。
4.根据权利要求3所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述水提取的步骤包括:
(1)称取地骨皮粉末,加入纯净水中混合;
(2)充分搅拌至混合均匀,煎煮2~4次,过滤并合并煎煮所得的滤液,浓缩至稠膏,-110℃冷冻真空干燥,过80目筛,得到地骨皮水提取物,置于4℃环境下保存备用。
5.根据权利要求4所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述醇提取的步骤包括:
(1)称取所述地骨皮水提取物,加入乙醇水溶液,浸泡搅拌;
(2)在预先设置温度为60℃的超声波清洗器中浸提50min;
(3)将浸提得到的溶液浓缩,抽滤,加入乙酸乙酯萃取,滤液静置分层,取下层相,加入CaCl2溶液,生成沉淀,于离心机上以4000rpm的速度离心,得到地骨皮提取物。
6.根据权利要求4所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述地骨皮粉末和纯净水的料液质量比为1:8~10。
7.根据权利要求5所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述乙醇水溶液的浓度为50~70%。
8.根据权利要求1所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述修复生殖系统损伤的产品包括修复生殖系统损伤的药物和修复生殖系统损伤的保健品。
9.根据权利要求1所述的地骨皮提取物在制备修复生殖系统损伤的产品中的应用,其特征在于,所述产品的剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、缓控释制剂、丸剂、酒剂或混悬剂。
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张婷: "地骨皮煎煮液对多囊卵巢大鼠胰岛素信号传导途径中PI3K/PKB分子表达的影响" * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN117137938A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-12-01 | 广州小蛮腰医疗器械有限公司 | 用于阴道损伤修复的药物组合物 |
CN117137938B (zh) * | 2023-09-08 | 2024-04-05 | 广州小蛮腰医疗器械有限公司 | 用于阴道损伤修复的药物组合物 |
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