CN102805778A - 一种地骨皮水提物在制备雌激素类药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及地骨皮水提物在制备雌激素类药物中的应用，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病的用药问题，其解决的技术方案是，将地骨皮每次用其10倍重量的水煎煮两次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到地骨皮浸膏状水提物，该地骨皮水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现地骨皮水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病药物中的应用，如妇女更年期综合症等中的应用，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了地骨皮药用新用途，临床意义巨大。
Description
技术领域
本发明涉及医药新用途，特别是一种地骨皮水提物在制备雌激素类药物中的应用。
背景技术
地骨皮为茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥根皮。初春或秋后采挖根部，洗净，剥取根皮，晒干。历代名家对其均有论述和研究，认为其性甘、寒，归肺、肾、肝、肾经，凉血除蒸，清肺降火。主治阴虚潮热，骨蒸盗汗，肺热咳嗽，咯血，衄血，内热消渴等。妇女进入绝经期后，体内雌激素水平下降，进而引起一系列症状，如骨质疏松症，心脑血管疾病等，其中骨质疏松症和心脑血管疾病导致的死亡率呈逐年上升趋势。现代药理及临床研究表明地骨皮能降血糖，降血脂，降压，抗病原微生物，解热和增强免疫的作用。但尚未有地骨皮关于雌激素样活性方面及在制备雌激素类药物中应用的报道。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种地骨皮水提物在制备雌激素类药物中的应用，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病（如妇女更年期综合症等）的用药问题。
本发明解决的技术方案是，将地骨皮每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到地骨皮浸膏状水提物，该地骨皮水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现地骨皮水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病药物中的应用，如妇女更年期综合症等中的应用。
本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了地骨皮药用新用途，临床意义巨大。
附图说明
图1为本发明的地骨皮水提物对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响作用图。
图2为本发明的地骨皮水提物对MCF-7细胞增殖的影响作用图。
图3为本发明的地骨皮水提物对ERE调控的报告基因载体ERα瞬时表达的诱导作用图。
图4为本发明的地骨皮水提物对ERE调控的报告基因载体ERβ瞬时表达的诱导作用图。
具体实施方式
以下结合实施例和有关试验资料对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，所述的地骨皮水提物是，将地骨皮100g用其10倍重量的水1000g（即1000mL）煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到地骨皮浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为65.77%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症。
实施例2
本发明在具体实施中，所述的地骨皮水提物是，将地骨皮200g用其10倍重量的水2000g（即2000mL）煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到地骨皮浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为65.67%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。
实施例3
本发明在具体实施中，所述的地骨皮水提物是，将地骨皮（300g）用其10倍重量的水3000g（即3000mL）煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到地骨皮浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为65.58%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症。
根据上述方法按地骨皮和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的地骨皮水提物，用于制备雌激素药物，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病（如妇女更年期综合症等）的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下：
采用动物实验、细胞增殖实验及报告基因技术对其进行了充分证明，其有关试验资料如下：
首先小鼠子宫增重实验，证明地骨皮水提物能够显著增加性未成熟雌性小鼠的子宫系数，说明其在体内具有雌激素样作用。
其次通过MCF-7细胞增殖实验（E-SCREEN），发现地骨皮水提物能够促进MCF-7细胞的增殖，说明其在体外具有雌激素样作用。
最后通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术，进一步验证地骨皮水提物是通过与雌激素受体ERα和ERβ结合而发挥雌激素样作用。
发明人已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途。其主要实施方案如下：
一、实验材料与方法
1.实验药物
茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥根皮。初春或秋后采挖根部，洗净，剥取根皮，晒干，即为地骨皮。
本发明地骨皮水提物。
2.实验动物与细胞株及质粒
昆明种小鼠，雌性，出生21d（刚断乳），体重9～12g，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞（MCF-7）由中国军事医学科学院生物工程研究所提供。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)对照质粒pβgal-Control、重组报告基因pERE-TAL-luc由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ERα（humanERα,hERα）表达载体pCXN2-hERα和重组人ERβ（humanERβ,hERβ）表达载体pCXN2-hERβ由东京大学医学系Satoshi Inoue博士惠赠。
3.主要试剂
RPMI1640培养基、小牛血清（Newborn Calf Serum，NCS）和脂质体LipofectamineTM2000Reagent购自Gibco Invitrogen公司；胎牛血清、无酚红RPMI1640培养基、17β-雌二醇（17β-estrogen，E2）、氨苄青霉素（Amp）、Tris碱和活性炭(Charcoal)均购自Sigma公司；葡聚糖T-70(Dextran-70)购自上海化学试剂公司；己烯雌酚片（合肥久联制药）；邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（O-Nitrophenyl-β-D-galactopy ranoside,ONPG）、EDTA、MTT及DMSO为Amresco公司产品；17-β雌二醇（E2）为Sigma公司产品；
稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Luciferase Assay Systerm)、闪亮裂解缓冲液(Glo lysis Buffer)购自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司；感受态大肠杆菌DH5α（E.coli CompetentCells DH5α）购自Solarbio公司；西班牙琼脂糖为Biowest生产；质粒提取试剂盒(Plasmid MiniKit Ⅰ)购自OMEGA公司；其余试剂均为国产分析纯。
4.所用主要仪器
二氧化碳培养箱（REVCO）；倒置显微镜（NIKON ECLIPSE TS100）；KDC-160HR高速低温冷冻离心机（科大创新股份有限公司）；酶标仪（BIO-RAD 680）；纯水仪(Sartorius611VF)；90-3磁力搅拌器（上海振捷实验设备有限公司）；ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；微量加样器（Nichipet EX PLUS）；AB204-N电子读数分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品）；超净工作台（江苏苏净集团）；UV-7504PC型紫外-可见分光光度计（福州健洋科技仪器有限公司）；VeritasTM微板光度计（Turner BioSystems公司）；SK6200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；HZS-H型水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；SHP-150型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。
5.实验方法
5.1 小鼠子宫增重实验
将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7d。空白对照组每日蒸馏水0.2mL·10g-1灌胃；阳性对照组每日己烯雌酚悬浊液(0.35mg·kg-1·d-1)灌胃；地骨皮按临床用药的20倍量×提取率计算，配成相应浓度的混悬液，每日按0.2mL·10g-1灌胃。最后一次给药24h后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数（子宫湿重×（体重）-1×100%）。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。
5.2 MCF-7细胞增殖实验
MCF-7细胞经无酚红含10%去激素血清的RPMI1640培养基培养2周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入无酚红含2%去激素血清的RPMI1640培养基吹打均匀，以2×103个/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μL。培养24h待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37℃、5%CO2培养72h后，每孔加入MTT溶液（5mg·mL-1）20μL，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150μLDMSO，震荡100s，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在570nm下测定各孔吸光度值（A），计算平均A值和增殖率（Proliferation Rate，RP）。实验平行重复三次。
RP=(实验组A值/空白组A值-1)×100%
5.3 ERE调控的报告基因瞬时表达检测
5.3.1 细胞接种
于转染前48h将处于对数生长期的HEK293细胞接种于24孔板，密度为16.0×104个孔，且培养液为无抗生素、含10%CDT-FBS的无酚红1640培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。
5.3.2 质粒的转染
(1)36～48h后开始转染，小心吸出原培养基，加入400μL含10%去雌激素血清、无庆大霉素和酚红的新鲜RPMI1640培养基。
(2)取3只EP管，ERα管中加500μL无酚红RPMI1640培养基、8μL pCXN2-hERα质粒、8μLpERE-TAL-luc质粒、8μL pβgal-Control质粒；ERβ管中加500μL无酚红RPMI1640培养基、8μLpCXN2-hERβ质粒、8μL pERE-TAL-Iuc质粒、8μL βgal-Control质粒；脂质体管中加入1000μL无酚红RPMI1640培养基和24μL脂质体。
(3)倒转混匀脂质体管，室温放置5min，取500μL分别加入ERα和ERβ管，室温放置20min；
(4)倒转混匀ERα和ERβ管，取80μlERα管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ERα实验孔，取80μlERβ管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ERβ实验孔。前后摇匀，放入培养箱。
(5)6h后加入对照药物和检测药物。
5.3.3 ERE调控的报告基因瞬时表达检测
加药后24h的细胞，吸去培养液，用1mLPBS洗一次，并移去PBS。按照
稳定荧光素酶检测系统试剂盒(
Assay Systerm)及闪亮裂解缓冲液(Glo lysisBuffer)改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物（荧光素），置于暗处，用VeritasTM微板光度计检测荧光强度。
5.3.4 β-gal活性检测
为了考察转染效率，对内参照β-gal活性进行了检测。
（1）54μL β-巯基乙醇加入40mL Z-buffer中，混匀，取EP管，每管加1800μL；
（2）每管加20μL裂解上清液；
（3）每管加400μL ONPG，倒转混匀；
（4）放置37℃温箱，至显黄色；
（5）加Na2CO3 1mL终止反应；
（6）测OD420值；
（7）计算标准化荧光素酶活性。
二、统计处理
实验数据以
表示，SPSS17.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）统计处理。
三、实验结果
1.地骨皮水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响
结果显示，地骨皮水提物组性未成熟雌性小鼠子宫系数与空白对照组相比均有极显著性差异(P＜0.01)，见表1，图1。说明地骨皮水提物在体内具有雌激素样作用。
表1 地骨皮水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响(
n=10)
注:与空白对照组比较，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01。
2.地骨皮水提物对MCF-7细胞的增殖的影响
结果显示，地骨皮水提物在0.0001～0.1mg·mL-1时对MCF-7细胞与空白组比均有极显著的促增殖作用(P＜0.01)，且呈剂量依赖性。在10mg·mL-1时对MCF-7细胞与空白组比均有极显著的抑制增殖作用(P＜0.01)，见表2，图2。说明地骨皮水提物在体外具有雌激素样作用。
表2 地骨皮水提物对MCF-7细胞增殖的影响(
n=6)
注:与空白对照组比较，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01。
3.ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术评价地骨皮水提物是否通过受体途径发挥的雌激素作用
阳性对照组即17β-雌二醇（E2）加入的终浓度为10-8mol·L-1，地骨皮水提物加药浓度分别为0.001mg·mL-1，0.01mg·mL-1，0.1mg·mL-1，1mg·mL-1。
结果显示，不论是由ERα或ERβ介导，E2标准化后的荧光素酶活性都显著高于空白孔（P<0.01）。由ERα介导时，地骨皮水提物1mg·mL-1组标准化后的荧光素酶活性显著高于空白孔（P<0.01），见表3，图3。由ERβ介导时，地骨皮水提物0.01mg·ml-1，0.1mg·ml-1，1mg·ml-1组标准化后的荧光素酶活性均高于空白孔，且具有剂量依赖性，见表4，图4。
表3 地骨皮水提物对ERE调控的报告基因载体ERα瞬时表达的诱导作用(n=4)
注：与空白对照组比较，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01。
表4 地骨皮水提物对ERE调控的报告基因载体ERβ瞬时表达的诱导作用(n=4)
注：与空白组比较，★表示P<0.01，☆表示P<0.05；与E2组比较，▲表示P<0.01，△表示P<0.05
综上所述，小鼠子宫增重实验结果显示，地骨皮水提物可极显著增加性未成熟雌性小鼠子宫系数。说明地骨皮水提物在体内、外均具有雌激素样活性。
MCF-7细胞增殖实验结果显示，地骨皮水提物在0.0001mg·mL-1～0.1mg·mL-1时对MCF-7具有显著的增殖作用，且具有剂量依赖性，在0.0001mg·mL-1时作用最强。
ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果显示，地骨皮水提物雌激素样作用主要是通过ERβ介导，其浓度在0.001mg·mL-1，0.01mg·mL-1，0.1mg·mL-1，1mg·mL-1均能激活ERβ介导的基因转录，且具有剂量依赖性；但对于ERα，只有在高剂量1mg·mL-1时可激活ERα介导的基因转录。
综上所述，动物及细胞实验结果显示，地骨皮水提物具有一定的雌激素样作用，其主要是通过ERβ介导而发挥雌激素样作用。
四、结论
子宫增重实验是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，在评价雌激素活性时，它考虑了物质的吸收、代谢、与血浆蛋白结合以及药代动力学等多方面因素，直接反映受试药物经体内代谢后的总体生物学效应。因此，本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体重之比（子宫系数）作为评价雌激素活性的指标。结果显示，地骨皮水提物可显著增加性未成熟雌性小鼠子宫系数，证明了地骨皮水提物在体内具有雌激素样作用。
MCF-7细胞是雌激素受体(ER)阳性的人乳腺癌细胞株，能特异地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖，是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。MCF-7细胞雌激素样增殖试验非常灵敏，可以区分雌激素激动剂和拮抗剂，因而被广泛应用于体外大量、快速筛选和评价环境雌激素和植物雌激素。在地骨皮水提物对MCF-7细胞影响的实验中，地骨皮水提物0001mg·mL-1～0.1mg·mL-1对MCF-7细胞均具有显著的促增殖作用，且具有剂量依赖性。提示地骨皮水提物体外具有一定的雌激素样作用。
上述试验反复进行多次，均取得了相同或相近的结果，提示，地骨皮水提物体内、体外均具有一定的雌激素样作用。
报告基因(reporter gene)是其表达产物非常容易检测、与内源性背景蛋白较易区别的一类基因。通过基因工程手段，将应答元件和报告基因相连，通过检测报告基因表达活性，可得知信号转导途径的活性及其对细胞内基因表达的调控和影响。报告基因技术灵敏度高、选择性强且操作简单。在地骨皮水提物对报告基因载体pERE-TAL-luc瞬时表达的诱导作用实验中，用以ERE调控报告基因的瞬时转染，将分别载有ERα、ERβ及以ERE序列作为调控元件构建的重组报告基因载体质粒瞬时共转染靶细胞（HEK 293）为药物筛选模型，加入不同受试药物后，通过观察报告基因的表达情况，从而了解地骨皮水提物雌激素样作用的强弱以及其与ERα或ERβ亲和力的大小。从实验结果中可见，地骨皮水提物可通过ERα或ERβ诱导luc荧光的表达，且地骨皮水提物激活基因转录主要是通过ERβ介导的，这与文献报道植物性雌激素对ERβ亲和力更高的普遍倾向一致。
有机体是一个复杂的体系，体内体外结果存在一定偏差。本实验应用体外细胞实验、体内整体动物实验及报告基因技术相结合共同来验证受试物的雌激素样活性，保证了结果的准确性。
通过上述实验，证明地骨皮水提物能够促进MCF-7细胞的增殖和增加性未成熟小鼠子宫的湿重，进一步的ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术提示地骨皮水提物主要是通过ERβ介导而发挥雌激素样作用。由实验结果可知，地骨皮水提物具有雌激素样作用，所以其可有效用于制备治疗由于体内雌激素分泌不足而引起的相关疾病，如妇女更年期综合症等的药物，本领域技术人员公知的是，妇女更年期综合症等其发病原因就在于体内雌激素分泌不足，促进体内雌激素分泌是治疗妇女更年期综合症等的有效途径，因此地骨皮水提物在制备雌激素药物中的应用，是中药地骨皮的新用途。
Claims (1)
1.一种地骨皮水提物在制备雌激素类药物中的应用，所述的地骨皮水提物是，将地骨皮每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2 h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到地骨皮浸膏状水提物。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 周京述: "地骨皮饮治疗妇女更年期综合症", 《四川中医》, no. 04, 15 April 1988 (1988-04-15), pages 40 * |
| 文智: "大剂地骨皮为主治疗更年期崩漏体会", 《湖南中医杂志》, vol. 12, no. 05, 30 September 1996 (1996-09-30), pages 44 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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