CN102247471B - 一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病的用药问题，其解决的技术方案是，将生地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物，该生地黄水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现生地黄水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病药物中的应用，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌性激素药物，开辟了生地黄药用新用途，临床意义巨大。

Description

一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药新用途，特别是一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，可有效用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病，如妇女更年期综合症等。

背景技术

生地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块茎。秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，将其缓缓烘焙至约八成干，即为生地黄。历代名家对其均有论述和研究，认为其性甘、寒，归心、肾、肝经，清热凉血、养阴生津。主治热病舌绛烦渴、阴虚内热、骨蒸劳热、内热消渴、吐血、衄血、血崩、月经不调、胎动不安、阴伤便秘等。现代药理及临床研究表明生地黄能促进凝血、升高外周白细胞；能强心、利尿、升高血压；能保护肝脏，降低血糖；有增强免疫功能、抗辐射损伤和肾上腺皮质激素样作用。但尚未有生地黄关于雌激素样活性方面的研究报道。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的就是提供一种生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病(如妇女更年期综合症等)的用药问题。

本发明解决的技术方案是，将生地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物，该生地黄水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现生地黄水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)药物中的应用。

本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌性激素药物，开辟了生地黄药用新用途，临床意义巨大。

附图说明

图1为本发明的生地黄水提物对ERE调控的报告基因载体ERα瞬时表达的诱导作用图。

图2为本发明的生地黄水提物对ERE调控的报告基因载体ERβ瞬时表达的诱导作用图。

具体实施方式

以下结合实施例和有关试验资料对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，所述的生地黄水提物是，将生地黄(Rehmannia glutinosaLibosch.)100g用其10倍重量的水1000g(即1000m1)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为71.90％，该水提物可制备雌激素药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。

实施例2

本发明在具体实施中，所述的生地黄水提物是，将生地黄(Rehmannia glutinosaLibosch.)200g用其10倍重量的水2000g(即2000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物143.90g，连续反复三次，平均得率为71.95％，该水提物可制备雌激素药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。

实施例3

本发明在具体实施中，所述的生地黄水提物是，将生地黄(Rehmannia glutinosaLibosch.)300g用其10倍重量的水3000g(即3000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物215.20g，连续反复三次，平均得率为71.73％，该水提物可制备雌激素药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。

根据上述方法按生地黄和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的生地黄水提物，用于制备雌激素药物，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病(如妇女更年期综合症等)的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下：

采用细胞增殖试验、动物试验及报告基因技术对其进行了充分证明，其有关试验资料如下：

首先通过MCF-7细胞增殖实验(E-SCREEN)，发现生地黄能够促进MCF-7细胞的增殖，说明其在体外具有雌激素样作用。

其次通过小鼠子宫增重实验，证明生地黄能够显著增加性未成熟雌性小鼠的子宫系数，说明其在体内具有雌激素样作用。

最后通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术，进一步验证生地黄提取物是通过与雌激素受体ERβ的结合而发挥雌激素样作用。

发明人已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途。其主要实施方案如下：

一、实验材料与方法

1.实验药物

玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块茎。秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，将其缓缓烘焙至约八成干，即为生地黄。

生地黄100g以10倍量的水煎煮2次，每次2h，水煎液减压干燥浓缩干燥得到生地黄水提物71.90g(浸膏状)。

2.实验动物与细胞株及质粒

昆明种小鼠，雌性，出生21天(刚断乳)，体重9～12g，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞(MCF-7)由中国军事医学科学院生物工程研究所提供。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)对照质粒pβgal-Control、重组报告基因pERE-TAL-luc由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ERα(humanERα，hERα)表达载体pCXN2-hERα和重组人ERβ(humanERβ，hERβ)表达载体pCXN2-hERβ由东京大学医学系Satoshi Inoue博士惠赠。

3.主要试剂

RPMI1640培养基、小牛血清(Newborn Calf Serum，NCS)和脂质体Lipofectamine^TM2000Reagent购自Gibco Invitrogen公司；胎牛血清、无酚红RPMI1640培养基、17β-雌二醇(17β-estrogen，E2)、氨苄青霉素(Amp)、Tris碱和活性炭(Charcoal)均购自Sigma公司；葡聚糖T-70(Dextran-70)购自上海化学试剂公司；己烯雌酚片(合肥久联制药)；邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(O-Nitrophenyl-β-D-galactopy ranoside，ONPG)、EDTA、MTT及DMSO为Amresco公司产品；17-β雌二醇(E₂)为Sigma公司产品；Steady-稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Steady-Luciferase Assay Systerm)、闪亮裂解缓冲液(Glo lysis Buffer)购自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司；感受态大肠杆菌DH5α(E.coli Competent CellsDH5α)购自Solarbio公司；西班牙琼脂糖为Biowest生产；质粒提取试剂盒(Plasmid Mini Kit I)购自OMEGA公司；其余试剂均为国产分析纯。

4.所用主要仪器

普通手术器械；二氧化碳培养箱(REVCO)；倒置显微镜(NIKON ECLIPSE TS100)；KDC-160HR高速低温冷冻离心机(科大创新股份有限公司)；酶标仪(BIO-RAD 680)；纯水仪(Sartorius 611VF)；90-3磁力搅拌器(上海振捷实验设备有限公司)；ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；微量加样器(Nichipet EX PLUS)；AB204-N电子读数分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品)；10cm培养皿、96孔培养板、冻存管均为Corning公司生产；超净工作台(江苏苏净集团)；UV-7504PC型紫外-可见分光光度计(福州健洋科技仪器有限公司)；Veritas^TM微板光度计(Turner BioSystems公司)；SK6200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；电泳仪，电泳槽(北京市六一仪器厂)；HZS-H型水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；SHP-150型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

5.实验方法

5.1MCF-7细胞增殖实验

MCF-7细胞经无酚红含10％去激素血清的RPMI1640培养基培养2周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0.25％胰蛋白酶消化后，加入无酚红含2％去激素血清的RPMI1640培养基吹打均匀，以2×10³个/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μl。培养24h待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37℃、5％CO₂培养72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150μlDMSO，震荡5～10min，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值(A)，计算平均A值和增殖率(Proliferation Rate，RP)。实验平行重复三次。

Rp＝(实验组A值/空白组A值)^-1×100％

5.2小鼠子宫增重实验

将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7天。空白对照组每日蒸馏水0.2ml·10g^-1灌胃；阳性对照组每日己烯雌酚悬浊液(0.35mg·kg^-1·d^-1)灌胃；生地黄按临床用药的20倍量×提取率计算，配成相应浓度的混悬液，每日按0.2ml/10g灌胃灌胃。最后一次给药24h后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数(子宫湿重×(体重)^-1×100％)。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。

5.3ERE调控的报告基因瞬时表达检测

5.3.1质粒DNA的制备

5.3.1.1质粒DNA的转化

(1)把感受态细胞置于冰水中融化；

(2)取4个无菌1.5mlEP管，各加入50μl感受态大肠杆菌DH5α；

(3)分别加入pCXN2-hERα、pCXN2-hERβ、pβgal-Control、pERE-TAL-luc各3μl(10ng/μl)，轻弹混匀；

(4)冰浴30min；

(5)42℃放置60s；

(6)冰浴3min；

(7)加入37℃预温好的LB液体培养基950μl，使其终体积为1ml；

(8)37℃水浴振荡培养1h(150～170次/min)；

(9)分别取适量涂布于含Amp LB固体培养基平皿中；

(10)37℃生化培养箱培养过夜。(培养时间为10-14h，不可超过14h)

5.3.1.2转化质粒DNA的扩增

(1)取5ml无Amp的LB液体培养基，加入无菌试管中；

(2)加入5μlAmp储存液(50mg/ml)使之终浓度为50μg/ml；

(3)挑取3-5个转化的单菌落，加入试管中；

(4)37℃，150r/min振摇过夜(10-12h)。

5.3.1.3质粒DNA的提取

(1)平衡柱子：取一只新的制备柱装在收集管中，吸取200μl的Buffer GPS至柱子中。室温放置5min后，12000g/min离心2min，弃去收集管中滤液，将制备柱重新装在收集管中待用。(平衡过的柱子需在当天使用)

(2)按照试剂盒要求提前配好solution I/Rnase A的混合液，4℃保存；加规定体积的无水乙醇到DNA wash Buffer中，室温保存。

(3)将上述菌液室温下8000转/分，离心5min，弃上清，收集菌体；

(2)每只EP管加入250μl solution I/Rnase A，涡旋混匀至菌体完全悬浮；

(3)加入250μl solution II，轻轻颠倒旋转混匀4-6次，不要剧烈混匀，将溶菌液置于室温下孵育2-3min；

(4)加入350μl solutionIII，轻摇混匀数次，直到絮状白色沉淀产生；

(5)室温14000g/min离心10min，得上清液；

(6)小心吸取上清至2ml平衡好的制备柱中，12000g/min离心2min；

(7)弃滤液，加入500μl Buffer HB，12000g/min离心2min；

(8)弃滤液，加入750μl DNAwash Buffer，12000g/min离心2min；

(9)重复(8)的操作；

(10)制备柱16000g/min离心3min，除去乙醇，空气中晾干。

(11)分别加入50μlElution Buffer洗脱制备柱，室温放置2min，16000g/min离心3min，滤液-20℃存放。

5.3.1.4提取质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

(1)0.5×TBE加入0.5％的琼脂糖，微波加热使琼脂糖完全溶解；

(2)溶液冷却至约60℃时，将液体倒入膜具，插入梳子；

(3)室温放置30min后，等完全凝固，小心取出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入0.5×TBE倒入电泳槽，液面高出胶面2mm；

(4)上样缓冲液1μl与1μl质粒DNA混合后上样，进行电泳。

5.3.2细胞接种

于转染前48h将处于对数生长期的HEK293细胞接种于24孔板，密度为16.0×10⁴个/0.5ml/孔，且培养液为无抗生素、含10％CDT-FBS的无酚红1640培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。

5.3.3转染质粒的稀释

pβgal-Control质粒用TE稀释为0.1μg/μl；

pCXN2-hERα或pCXN2-hERβ质粒用TE稀释为40ng/μl；

pERE-TAL-luc质粒用TE稀释为0.2μg/μl.

5.3.4质粒的转染

(1)转染前24h，将HEK293细胞用含10％无E₂的FBS、无庆大霉素和酚红的RPMI1640培养基于接种于24孔板，细胞密度16×10⁴个/0.5ml/孔。

(2)36-48h后开始转染，小心吸出原培养基，加入400μl含10％去雌激素血清、无庆大霉素和酚红的新鲜RPMI1640培养基。

(3)取3只EP管，ERα管中加500μl无酚红RPMI1640培养基、8μlpCXN2-hERα质粒、8μlpERE-TAL-luc质粒、8μlpβgal-Control质粒；ERβ管中加500μl无酚红RPMI1640培养基、8μlpCXN2-hERβ质粒、8μlpERE-TAL-Iuc质粒、8μl βgal-Control质粒；脂质体管中加入1000μl无酚红RPMI1640培养基和24μl脂质体。

(4)倒转混匀脂质体管，室温放置5min，取500μl分别加入ERα和ERβ管，室温放置20min；

(5)倒转混匀ERα和ERβ管，取80μlERα管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ERα实验孔，取80μlERβ管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ERβ实验孔。前后摇匀，放入培养箱。

(6)6h后加入对照药物和检测药物。

5.3.5ERE调控的报告基因瞬时表达检测

加药后24h的细胞，吸去培养液，用1mlPBS洗一次，并移去PBS。按照Steady-

稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Steady-

Luciferase Assay Systerm)及闪亮裂解缓冲液(Glo lysisBuffer)改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物(荧光素)，置于暗处，用VeritasTM微板光度计检测荧光强度。

5.3.6β-gal活性检测

为了考察转染效率，对内参照β-gal活性进行了检测。

(1)54μlβ-巯基乙醇加入40ml Z-buffer中，混匀，取EP管，每管加1800μl；

(2)每管加20μl裂解上清液；

(3)每管加400μl ONPG，倒转混匀；

(4)放置37℃温箱，至显黄色；

(5)加Na₂CO₃1mL终止反应；

(6)测OD420值；

(7)计算标准化荧光素酶活性。

二、统计处理

实验数据以

表示，SPSS13.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)统计处理。

三、实验结果

1.生地黄水提物对MCF-7细胞的增殖的影响实验结果

结果显示，生地黄水提物在0.001～0.1mg·ml^-1时对MCF-7细胞与空白组比均有极显著的促增殖作用(P＜0.01)，且呈剂量依赖性。见表1。说明在体外实验中，生地黄水提物在低浓度时即有促MCF-7细胞的增殖作用。

表1生地黄对MCF-7细胞增殖的影响(

n＝9)

注：与空白对照组比较，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01。

2.生地黄水提物对小鼠子宫增重实验结果

结果显示，生地黄水提物组性未成熟雌性小鼠子宫系数与空白对照组相比均有极显著性差异(P＜0.01)，说明生地黄水提物在体内具有雌激素样活性。见表2。

表2生地黄对性未成熟小鼠子宫系数的影响(

n＝30)

注：与至白对照组比较，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01。

3.ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术评价生地黄水提物是否通过受体途径发挥的雌激素作用

阳性对照组即17β-雌二醇(E₂)加入的终浓度为10^-8mol/L，生地黄加药浓度分别为0.001mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL。

结果显示，不论是由ERα或ERβ介导，E2标准化后的荧光素酶活性都显著高于空白孔(P＜0.01)。

由ERα介导时，生地黄水提物0.1mg/mL、1mg/mL组标准化后的荧光素酶活性都低于空白孔(P＜0.01)。见表3，图1。

由ERβ介导时，生地黄水提物0.001mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL组标准化后的荧光素酶活性都高于空白孔(P＜0.01)，且具有剂量依赖性。见表4，图2。

表3生地黄水提物对ERE调控的报告基因载体ERα瞬时表达的诱导作用(

n＝3)

注：与空白对照组比较，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01。

表4生地黄水提物对ERE调控的报告基因载体瞬时表达的诱导作用(

n＝3)

注：与至白组比较，★表示P＜0.01，☆表示P＜0.05；与E₂组比较，▲表示P＜0.01，△表示P＜0.05

MCF-7细胞增殖实验结果显示，生地黄水提物在低浓度0.001mg/ml～0.1mg/ml时对MCF-7具有显著的增殖作用，且增殖作用具有剂量依赖性，在0.01mg/ml时作用最强。

小鼠子宫增重实验结果显示，生地黄水提物可极显著增加性未成熟雌性小鼠子宫系数，说明生地黄水提物在体内、外均具有雌激素样活性。

ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果显示，生地黄提取物的雌激素样作用主要是通过ERβ介导，浓度在0.001mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL均能激活ERβ介导的基因转录，且具有剂量依赖性；但对ERα介导的基因转录，高剂量0.1mg/mL、1mg/mL时可抑制ERα介导的基因转录；

综上所述，动物及细胞实验结果显示，生地黄提取物具有一定的雌激素样作用，其主要是通过ERβ介导而发挥雌激素样作用。

四、结论

MCF-7细胞是雌激素受体(ER)阳性的人乳腺癌细胞株，能特异地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖，是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。MCF-7细胞雌激素样增殖试验非常灵敏，可以区分雌激素激动剂和拮抗剂，因而被广泛应用于体外大量、快速筛选和评价环境雌激素和植物雌激素。在生地黄对MCF-7细胞影响的实验中，生地黄水提物0.001mg/ml～0.1mg/ml时对MCF-7均具有显著的增殖作用，且作用的强弱具有剂量依赖性。

上述试验反复进行多次，均取得了相同或相近的结果，提示，生地黄在体外具有一定的雌激素样作用。

子宫增重实验是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，在评价雌激素活性时，它考虑了物质的吸收、代谢、与血浆蛋白结合以及药代动力学等多方面因素，直接反映受试药物经体内代谢后的总体生物学效应。因此，本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体重之比(子宫系数)作为评价雌激素活性的指标。结果显示，生地黄水提物可显著增加性未成熟雌性小鼠子宫系数，证明了生地黄在体内具有雌激素样作用，可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)的药物。以治疗妇女更年期综合症病例为例，有关临床实验资料如下：

1.选择病例的标准

所谓更年期综合症是由于卵巢功能减退，体内雌激素水平下降，从而引出了机体多系统功能紊乱而出现一系列症状，如月经不调、面色潮红、心悸、失眠、乏力、抑郁、多虑、情绪不稳定，易激动，注意力难以集中等，对工作、学习和正常生活产生不良影响，凡具有上述症状的均作为选择病例的标准，并给予治疗。

2.诊断标准

凡妇女更年期有月经变化、面色潮红、心悸、失眠、乏力、抑郁、多虑、情绪不稳定，易激动，注意力难以集中等症状的，均诊断为患有更年期综合症。

3.治疗方案

患者每天服用本发明水提物两次，每次服用相当于生地黄原药材15g的水提物，一个月为一个疗程，一个疗程后统计疗效。

4.疗效评定标准

治愈：更年期综合症的症状完全消失。

有效：更年期综合症的症状有明显好转或好转。

无效：更年期综合症的症状没有明显好转，甚而有加重的趋势，需用其他药物治疗。

5.统计处理结果

经对患有更年期综合症158人服用，其中治愈者95人，有效者61人，无效者2人，总有效率为98％以上。

从上述实验结果清楚的表明，本发明提取物具有雌激素样作用，可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，是中草药现代药理作用上的一大创新。

报告基因(reporter gene)是其表达产物非常容易检测、与内源性背景蛋白较易区别的一类基因。通过基因工程手段，将应答元件和报告基因相连，通过检测报告基因表达活性，可得知信号转导途径的活性及其对细胞内基因表达的调控和影响。报告基因技术灵敏度高、选择性强且操作简单。在生地黄对报告基因载体pERE-TAL-luc瞬时表达的诱导作用实验中，用以ERE调控报告基因的瞬时转染，将分别载有ERα、ERβ及以ERE序列作为调控元件构建的重组报告基因载体质粒瞬时共转染靶细胞(HEK 293)为药物筛选模型，加入不同受试药物后，通过观察报告基因的表达情况，即荧光强度的高低可以检测到受试物是否可与ER结合，从而了解生地黄的雌激素样作用的强弱以及其与ERα或ERβ亲和力的大小。从实验结果中可见，生地黄水提物可通过ERα或ERβ诱导luc荧光的表达，且生地黄水提物激活基因转录主要是通过ERβ介导的，这与文献报道植物性雌激素对ERβ亲和力更高的普遍倾向一致。

有机体是一个复杂的体系，体内体外结果存在一定偏差。本实验应用体外细胞实验、体内整体动物实验及报告基因技术相结合共同来验证受试物的雌激素活性，保证了结果的准确性。

通过上述实验，证明生地黄能够促进MCF-7细胞的增殖和性未成熟雌性小鼠子宫的生长，进一步的ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术提示生地黄主要是通过ERβ介导而发挥雌激素样作用。由实验结果可知，生地黄具有雌激素样作用，所以其可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)的药物，是中药生地黄在用途上的新发现。

Claims (1)

1.一种单味中药生地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，所述的生地黄水提物是，将生地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到生地黄浸膏状水提物。

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