CN102805760A

CN102805760A - 怀牛膝水提物在制备雌激素类药物中的应用

Info

Publication number: CN102805760A
Application number: CN2012102513898A
Authority: CN
Inventors: 郑晓珂; 冯卫生; 蒋贇; 刘朝妍; 王小兰
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2012-07-19
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2012-12-05

Abstract

本发明涉及怀牛膝水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效解决由于体内雌性激素分泌异常而引起的疾病用药问题，其解决的技术方案是，将怀牛膝每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到怀牛膝浸膏状水提物，该怀牛膝水提物可有效用于制备和预防由于体内雌激素分泌异常引起的相关疾病的药物，实现怀牛膝水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌异常而引起的相关疾病药物中的应用，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了怀牛膝药用新用途，临床意义巨大。

Description

怀牛膝水提物在制备雌激素类药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药新用途，特别是一种怀牛膝水提物在制备雌激素类药物中的应用。

背景技术

怀牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bibentata Bl.的干燥根。牛膝，在四州、湖北、陕西等省均有生产，但怀牛膝质量最佳，数量也居全国之首，怀牛膝因产于历史上的怀庆府而得名，位于今河南焦作一带。怀牛膝的特点是：条子粗壮、明亮、色泽鲜艳、油性多。历代名家对其均有论述和研究，认为其性平，味苦、甘、酸。归肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行的功能。用于经闭，痛经，腰膝酸痛，筋骨无力，淋证，水肿，头痛，眩晕，牙痛，口疮，吐血，衄血等症。现代药理及临床研究表明怀牛膝具有降压，改善肝功能，增强体液免疫，抗炎与镇痛，利尿，解痉，抗衰老等作用。妇女进入绝经期后，体内雌激素水平下降，进而引起一系列症状，如骨质疏松症，老年痴呆症，心脑血管疾病等，其中骨质疏松症和心脑血管疾病导致的死亡率呈逐年上升趋势。怀牛膝的抗衰老作用，自《神农本草经》即有记载，诸多延年益寿方中应用比例极高。现代的研究报道亦较多，如怀牛膝对家蚕寿命及生长发育影响实验表明：怀牛膝可延长家蚕龄期，减轻家蚕体重，并有减缓家蚕身长增长的作用；怀牛膝还可明显改善戊巴比妥钠所致小鼠记忆障碍，明显延长小鼠负荷游泳时间，从而增强记忆和提高耐力。以0.4g/kg的怀牛膝粉拌食喂养Wistar雌性9月龄大鼠至19月龄，可明显提高大鼠全血SOD活性，降低LPO的形成。但关于怀牛膝具有雌激素样作用方面的研究尚未见报道。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的就是提供一种怀牛膝水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效解决由于体内雌性激素分泌异常而引起的疾病（如妇女更年期综合症等）用药问题。

本发明解决的技术方案是，将怀牛膝每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到怀牛膝浸膏状水提物，该怀牛膝水提物可有效用于制备和预防由于体内雌激素分泌异常引起的相关疾病的药物，实现怀牛膝水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌异常而引起的相关疾病（如妇女更年期综合症等）药物中的应用。

本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了怀牛膝药用新用途，临床意义巨大。

附图说明

图1为本发明的怀牛膝水提物对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响作用图。

图2为本发明的怀牛膝水提物对MCF-7细胞增殖的影响作用图。

图3为本发明的怀牛膝水提物对ERE调控的报告基因载体ERα瞬时表达的诱导作用图。

图4为本发明的怀牛膝水提物对ERE调控的报告基因载体ERβ瞬时表达的诱导作用图。

具体实施方式

以下结合实施例和有关试验资料对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，所述的怀牛膝水提物是，将怀牛膝(Achyranthes bibentata Bl.)100g用其10倍重量的水1000g（即1000mL）煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到怀牛膝浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为68.76%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌异常而引起的相关疾病，如妇女更年期综合症等。

实施例2

本发明在具体实施中，所述的怀牛膝水提物是，将怀牛膝(Achyranthes bibentata Bl.)200g用其10倍重量的水2000g（即2000mL）煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到怀牛膝浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为68.58%，该水提物可制备雌激素类药物。

实施例3

本发明在具体实施中，所述的怀牛膝水提物是，将怀牛膝(Achyranthes bibentata Bl.)300g用其10倍重量的水3000g（即3000mL）煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到怀牛膝浸膏状水提物，连续反复三次，平均得率为68.29%，该水提物可制备雌激素类药物。

根据上述方法按怀牛膝和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的怀牛膝水提物，用于制备雌激素类药物，有效解决由于体内雌性激素分泌异常而引起的疾病（如妇女更年期综合症等）的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下：

首先，通过小鼠子宫增重实验，证明怀牛膝能够增加性未成熟雌性小鼠的子宫系数，说明其在体内具有雌激素样作用。

其次，通过MCF-7细胞增殖实验（E-SCREEN），发现怀牛膝能够促进MCF-7细胞增殖，说明其在体外具有雌激素样作用。

最后，通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术，进一步验证怀牛膝水提物是通过与雌激素受体ERβ结合而发挥雌激素样作用。

发明人已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途。其主要实施方案如下：

一、实验材料与方法

1.实验药物

采用本发明怀牛膝水提物。

2.实验动物与细胞株及质粒

昆明种小鼠，雌性，出生21d（刚断乳），体重9～12g，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞（MCF-7）由中国军事医学科学院生物工程研究所提供。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)对照质粒pβgal-Control、重组报告基因pERE-TAL-luc、重组人ERα（humanERα,hERα）表达载体pCXN2-hERα和重组人ERβ（humanERβ,hERβ）表达载体pCXN2-hERβ由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。

3.主要试剂

RPMI1640培养基、小牛血清（Newborn Calf Serum，NCS）和脂质体Lipofectamine^TM2000Reagent购自Gibco Invitrogen公司；胎牛血清、无酚红RPMI1640培养基、17β-雌二醇（17β-estrogen，E2）、氨苄青霉素（Amp）、Tris碱和活性炭(Charcoal)均购自Sigma公司；葡聚糖T-70(Dextran-70)购自上海化学试剂公司；己烯雌酚片（合肥久联制药）；邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（O-Nitrophenyl-β-D-galactopy ranoside,ONPG）、EDTA、MTT及DMSO为Amresco公司产品；17-β雌二醇（E₂）为Sigma公司产品；

稳定荧光素酶检测系统试剂盒

Luciferase Assay Systerm)、闪亮裂解缓冲液(Glo lysis Buffer)购自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司；感受态大肠杆菌DH5α（E.coli CompetentCells DH5α）购自Solarbio公司；西班牙琼脂糖为Biowest生产；质粒提取试剂盒(Plasmid MiniKitⅠ)购自OMEGA公司；其余试剂均为国产分析纯。

4.所用主要仪器

普通手术器械；二氧化碳培养箱（REVCO）；倒置显微镜（NIKON ECLIPSE TS100）；KDC-160HR高速低温冷冻离心机（科大创新股份有限公司）；酶标仪（BIO-RAD680）；纯水仪(Sartorius 611VF)；90-3磁力搅拌器（上海振捷实验设备有限公司）；ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；微量加样器（Nichipet EX PLUS）；AB204-N电子读数分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品）；10cm培养皿、96孔培养板、冻存管均为Corning公司生产；超净工作台（江苏苏净集团）；UV-7504PC型紫外-可见分光光度计（福州健洋科技仪器有限公司）；Veritas^TM微板光度计（Turner BioSystems公司）；SK6200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；电泳仪，电泳槽（北京市六一仪器厂）；HZS-H型水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；SHP-150型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

5.实验方法

5.1小鼠子宫增重实验

将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7d。空白对照组每日蒸馏水0.2mL·10g^-1灌胃；阳性对照组每日己烯雌酚悬浊液(0.35mg·kg^-1·d^-1)灌胃；怀牛膝水提物按临床用药的20倍量×提取率计算，配成相应浓度的混悬液，每日按0.2mL·10g^-1灌胃。最后一次给药24h后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数（子宫湿重×（体重）^-1×100%）。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。

5.2MCF-7细胞增殖实验

MCF-7细胞经无酚红含10%去激素血清的RPMI1640培养基培养2周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入无酚红含2%去激素血清的RPMI1640培养基吹打均匀，以2×10³个/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μL。培养24h待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37℃、5%CO₂培养72h后，每孔加入MTT溶液（5mg·mL^-1）20μL，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150μL DMSO，震荡100s，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在570nm下测定各孔吸光度值（A），计算平均A值和增殖率（Proliferation Rate，RP）。实验平行重复三次。

RP=(实验组A值/空白组A值－1)×100%

5.3ERE调控的报告基因瞬时表达检测

5.3.1细胞接种

于转染前48h将处于对数生长期的HEK293细胞接种于24孔板，密度为16.0×10⁴个/孔，且培养液为无抗生素、含10%CDT-FBS的无酚红1640培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。

5.3.2质粒的转染

(1)36~48h后开始转染，小心吸出原培养基，加入400μL含10%去雌激素血清、无庆大霉素和酚红的新鲜RPMI1640培养基。

(2)取3只EP管，ERα管中加500μL无酚红RPMI1640培养基、8μLpCXN2-hERα质粒、8μLpERE-TAL-luc质粒、8μLpβgal-Control质粒；ERβ管中加500μL无酚红RPMI1640培养基、8μLpCXN2-hERβ质粒、8μL pERE-TAL-Iuc质粒、8μlβgal-Control质粒；脂质体管中加入1000μL无酚红RPMI1640培养基和24μL脂质体。

(3)倒转混匀脂质体管，室温放置5min，取500μL分别加入ERα和ERβ管，室温放置20min；

(4)倒转混匀ERα和ERβ管，取80μLERα管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ERα实验孔，取80μLERβ管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ERβ实验孔。前后摇匀，放入培养箱。

(5)6h后加入对照药物和检测药物。

5.3.3ERE调控的报告基因瞬时表达检测

加药后24h的细胞，吸去培养液，用1mL PBS洗一次，并弃去PBS。按照

稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Steady-GloAssay Systerm)及闪亮裂解缓冲液(Glolysis Buffer)改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物（荧光素），置于暗处，用VeritasTM微板光度计检测荧光强度。

5.3.4β-gal活性检测

为了考察转染效率，对内参照β-gal活性进行了检测。

（1）54μLβ-巯基乙醇加入40mL Z-buffer中，混匀，取EP管，每管加1800μL；

（2）每管加20μL裂解上清液；

（3）每管加400μL ONPG，倒转混匀；

（4）放置37℃温箱，至显黄色；

（5）加Na₂CO₃ 1mL终止反应；

（6）测OD₄₂₀值；

（7）计算标准化荧光素酶活性。

二、统计处理

实验数据以

表示，SPSS17.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）统计处理。

三、实验结果

1.怀牛膝水提物对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响

结果显示，怀牛膝水提物组与空白对照组相比极显著地增加了性未成熟雌性小鼠子宫系数（P＜0.01）。见表1，图1。说明怀牛膝水提物在体内具有雌激素样作用。

表1怀牛膝水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响

注:与空白对照组比较，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01。

2.怀牛膝水提物对MCF-7细胞增殖的影响

怀牛膝水提物在0.001mg·mL^-1～1mg·mL^-1时对MCF-7细胞与空白组比有极显著地促增殖作用（P＜0.01），在10mg·mL^-1时对MCF-7细胞与空白组比有极显著地抑制增殖作用（P＜0.01）见表2，图2。说明怀地黄水提物在体外具有雌激素样作用。

表2怀牛膝水提物对MCF-7细胞增殖的影响

3.ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术评价怀牛膝水提物是否通过受体途径发挥的雌激素作用

阳性对照组即17β-雌二醇（E₂）加入的终浓度为10^-8mol·L^-1，怀牛膝的加药浓度分别为0.001mg·mL^-1，0.01mg·mL^-1，0.1mg·mL^-1，1mg·mL^-1。

结果显示：由ERα介导时，怀牛膝水提物0.001mg·mL^-1，0.01mg·mL^-1，0.1mg·mL^-1，1mg·mL^-1组标准化后的荧光素酶活性与空白组相比没有显著性差异。见表3，图3。由ERβ介导时，怀牛膝水提物0.001mg·mL^-1、0.01mg·mL^-1、0.1mg·mL^-1组标准化后的荧光素酶活性低于空白孔，且怀牛膝水提物在较低剂量0.001mg·mL^-1、0.01mg·mL^-1时与空白组相比具有极显著性差异（P<0.01），见表4，图4。说明怀牛膝水提物可经过ERβ介导抑制基因转录而发挥雌激素样作用。

表3怀牛膝水提物对ERE调控的报告基因载体ERα瞬时表达的诱导作用

表4怀牛膝水提物对ERE调控的报告基因载体ERβ瞬时表达的诱导作用

MCF-7细胞增殖实验结果显示，怀牛膝水提物在0.001mg·mL^-1～1mg·mL^-1时有极显著地促增殖作用。

小鼠子宫增重实验结果显示，怀牛膝水提物组能极显著地增加性未成熟雌性小鼠子宫系数，说明怀牛膝水提物在体内、体外均具有雌激素样活性。

ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果显示，怀牛膝水提物的雌激素样作用主要是通过ERβ介导，浓度在0.001mg·mL^-1、0.01mg·mL^-1、0.1mg·mL^-1均能抑制ERβ介导的基因转录，且具有剂量依赖性。

综上所述，动物及细胞实验结果显示，怀牛膝水提物具有一定的雌激素样作用，其主要是通过ERβ介导而发挥雌激素样作用。

四、结论

子宫增重实验是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，在评价雌激素活性时，它考虑了物质的吸收、代谢、与血浆蛋白结合以及药代动力学等多方面因素，直接反映受试药物经体内代谢后的总体生物学效应。因此，本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体重之比（子宫系数）作为评价雌激素活性的指标。结果显示，怀牛膝水提物可显著增加性未成熟雌性小鼠子宫系数，证明了怀牛膝在体内具有雌激素样作用。

MCF-7细胞是雌激素受体(ER)阳性的人乳腺癌细胞株，能特异地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖，是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。MCF-7细胞增殖实验非常灵敏，可以区分雌激素激动剂和拮抗剂，因而被广泛应用于体外大量、快速筛选和评价环境雌激素和植物雌激素。在怀牛膝水提物对MCF-7细胞增殖影响的实验中，怀牛膝水提物0.001mg·mL^-1～1mg·mL^-1对MCF-7细胞有显著地促增殖作用，验证了怀牛膝水提物在体外具有雌激素样活性。

上述试验反复进行多次，均取得了相同或相近的结果，提示，怀牛膝水提物在体内、体外均具有一定的雌激素样作用。

报告基因(reporter gene)是其表达产物非常容易检测、与内源性背景蛋白较易区别的一类基因。通过基因工程手段，将应答元件和报告基因相连，通过检测报告基因表达活性，可得知信号转导途径的活性及其对细胞内基因表达的调控和影响。报告基因技术灵敏度高、选择性强且操作简单。在怀牛膝水提物对报告基因载体pERE-TAL-luc瞬时表达的诱导作用实验中，用以ERE调控报告基因的瞬时转染，将分别载有ERα、ERβ及以ERE序列作为调控元件构建的重组报告基因载体质粒瞬时共转染靶细胞（HEK293）为药物筛选模型，加入不同受试药物后，通过观察报告基因的表达情况，即荧光强度的高低可以检测到受试物是否可与ER结合，从而了解怀牛膝水提物的雌激素样作用的强弱以及其与ERα或ERβ亲和力的大小。从实验结果中可见，怀牛膝水提物可通过ERβ抑制luc荧光的表达，及怀牛膝水提物可经过ERβ介导抑制luc基因转录，即主要通过ERβ介导发挥雌激素样作用。

有机体是一个复杂的体系，体内体外结果存在一定偏差。本实验应用体内整体动物实验、体外细胞实验及报告基因技术相结合共同来验证受试物的雌激素样活性，保证了结果的准确性。

通过上述实验，证明怀牛膝水提物能够促进MCF-7细胞的增殖和增加性未成熟小鼠子宫的湿重，进一步的ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术提示怀牛膝水提物主要是通过ERβ介导而发挥雌激素样作用。由实验结果可知，怀牛膝水提物具有雌激素样作用，所以其可有效用于制备治疗由于体内雌激素分泌不足而引起的相关疾病，如妇女更年期综合症等的药物，本领域技术人员公知的是，妇女更年期综合症等其发病原因就在于体内雌激素分泌不足，促进体内雌激素分泌是治疗妇女更年期综合症等的有效途径，因此怀牛膝水提物在制备雌激素药物中的应用，是中药怀牛膝的新用途。

Claims

1.一种怀牛膝水提物在制备雌激素类药物中的应用，所述的怀牛膝水提物是，将怀牛膝每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2 h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到怀牛膝浸膏状水提物。