CN110302380B - 一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用，本发明将荔枝草水提取物作为放疗增敏剂用应用在抑制结直肠癌CT26细胞株荷瘤小鼠瘤组织的生长。荔枝草水提取物作为放疗增敏剂的使用明显改善了CT26细胞移植瘤模型小鼠一般活动情况，抑制瘤组织生长，降低瘤重，对结直肠癌生长、增殖具有明显的抑制作用，且部分作用机制与下调CT26细胞移植瘤小鼠瘤组织VEGF与Survivin的表达有关。本发明进一步扩大了荔枝草水提取物的用途，明确了荔枝草水提取物放疗增敏剂对抑制结直肠癌的作用，采用中药辅助放疗的方法为临床医学治疗肿瘤提供了有效手段。
Description
技术领域
本发明涉及放疗增敏剂技术领域，尤其涉及一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用。
背景技术
结直肠癌是结肠或直肠内的细胞异常生长所形成的癌症，具有恶性程度高、易转移浸润、预后差及5年生存率低等特点，是临床上常见的胃肠道恶性肿瘤。大多数患者就诊时已发展到中晚期或有转移，常规的手术切除虽然对原发病灶有所控制，但其预后仍然不佳。放射治疗是用于控制恶性肿瘤的重要措施，可及时控制肿瘤的生长和增殖，但是对结直肠癌进行放射治疗存在肿瘤的放射抵抗性、肠周围正常组织器官对放射线的耐受性等问题，影响了放疗剂量的给予，限制了放疗在结直肠癌治疗中的应用。因此，需要进一步探索结直肠癌对放射治疗反应的潜在机制，寻找一些有前途的放射增敏剂来增强辐射对肿瘤组织的损伤。
放射增敏剂是指一类能增强射线的杀伤作用的药物。近些年来一些放射增敏化合物，如甘氨双唑钠，虽然具有较高的增敏性，但由于其对正常组织具有一定的毒性，从而一定程度上限制了其在临床上的运用。近年来，研究者们发现一些中药同样具有较好的放射增敏效应，采用中药辅助放疗的方法治疗肿瘤越来越受到临床重视，并取得了较好的疗效
荔枝草又称“雪见草、癞蛤蟆草”等，属唇形科鼠尾草属植物，在我国河南、山东、四川等地广泛分布，是中医处方中常用的一味具有清热解毒、凉血利水等功效的中药材，可以全草入药。研究报道，荔枝草提取物具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、止咳平喘及减少骨丢失等药理作用，但关于其是否具有抗肿瘤作用尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于在于提供一种荔枝草水提取物放疗增敏剂在抑制结直肠癌CT26细胞株荷瘤小鼠瘤组织的生长中的应用。为实现本发明目的，本发明提供一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用。
一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用，其特征步骤在于包括以下步骤：
(1)制备及配置荔枝草水提取物：荔枝草0.5-1.0kg加入2.5-5倍体积蒸馏水，浸泡4-6h，煎煮2-4h，用纱布过滤得药液；将滤渣再加入1-2倍体积蒸馏水，煎煮1-3h，用纱布过滤得药液；将滤渣再加入0.5-1倍体积蒸馏水，煎煮30-45min，用纱布过滤得药液；将3次所得药液混合，旋转蒸发至含生药2.5-5g/mL即为荔枝草水提物，冷藏保存备用。
(2)对结直肠癌CT26细胞荷瘤小鼠模型进行制备：将CT26细胞接种于含胎牛血清(15％)和青-链霉素溶液(含青霉素100U/mL，链霉素0.1mg/mL)的RPMI1640培养液中，细胞生长至铺满瓶底70-85％时用胰酶消化后进行传代，取指数生长期细胞，制成1×106个/mL浓度细胞悬液，取0.2ml细胞悬液，无菌条件下接种于BALB/c小鼠右前肢腋窝皮下，造模后3-5天可在皮下触及明显瘤块(约1-3mm×1-3mmm)即为结直肠癌CT26细胞荷瘤小鼠模型；
(3)药物干预：取50只移植成功的荷瘤小鼠，灌胃步骤(1)所得的荔枝草水提取物400-500mg/kg，每日给药一次，连续给药21-30天；给药期间每间隔5-6天用2Gy剂量X线照射一次。
(4)移测定植瘤体积：药物干预后，每天观察小鼠活动、饮食、毛发情况；于给药后第0、7、14、21天分别测定瘤体积。末次测量瘤体积结束后，取小鼠颈椎脱臼处死，快速剥离瘤组织并去除包膜，置于电子天平称取瘤重，然后放入液氮中保存待用。
(6)RT-PCR法测定小鼠瘤组织VEGF、Survivin mRNA表达水平：取冻存的瘤组织50mg置于经DEPC水处理的研钵中，加入适量液氮充分研磨，然后再加入1.0mL RNA提取试剂，移入1.5mL EP管中，根据TRIzolTM Plus RNA Purification Kit RNA提取试剂盒说明进行总RNA提取，按照RT-PCR实验方案进行逆转录和扩增实验。
(7)Western blot法分析小鼠瘤组织VEGF、Survivin蛋白表达水平：取冻存的瘤组织50mg，用组织剪剪碎，置入2.0mL离心管中，加入1.5mL RIPA蛋白裂解液，用电动匀浆器于冰上充分匀浆，静置裂解20min，然后4℃下12000rpm离心15min，取上清于1.5ml离心管中即为提取的总蛋白，调整各样本蛋白浓度一致，严格按照Western blot实验操作流程依次进行变性、上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育及显色拍照等步骤，以β-actin为内参蛋白条带灰度值为参照分析待测蛋白相对表达水平。
本发明的优势：
本发明提供了一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用，本发明将荔枝草水提取物作为放疗增敏剂应用在抑制结直肠癌CT26细胞株荷瘤小鼠瘤组织的生长。实验结果表明本发明改善了CT26细胞移植瘤模型小鼠一般活动情况，能够抑制瘤组织生长，降低瘤重，比荔枝草水提取物或X线各自单独应用效果更佳，且与使用5-氟尿嘧啶的效果相当，说明荔枝草水提取物作为放疗增敏剂对结直肠癌具有更好的抑制作用。通过探究发现，荔枝草水提取物作为放疗增敏剂的作用部分机制与下调CT26细胞移植瘤小鼠瘤组织VEGF与Survivin因子的表达有关。本发明进一步开发了荔枝草水提取物在抑制结直肠癌方面的用途，提供一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用，实验结果证明本发明对结直肠癌生长、增殖具有明显抑制作用。
附图说明
图1为移植瘤体积增长曲线。
图2为RT-PCR法测定下不同药物干预方法对移植瘤组织VEGF、Survivin mRNA表达水平的影响(注：1.对比例1；2.对比例2；3.对比例3；4.对比例4；5.实施例1)。
图3为Western blot法分析下不同药物干预方法对移植瘤组织VEGF、Survivin蛋白表达水平的影响(注：1.对比例1；2.对比例2；3.对比例3；4.对比例4；5.实施例1)。
具体实施方式
实施例1
一种荔枝草水提取物的使用方法，包括以下步骤：
(1)制备及配置荔枝草水提取物：荔枝草1.0kg加入5倍体积蒸馏水，浸泡6h，煎煮2h，用纱布过滤得药液；将滤渣再加入2倍体积蒸馏水，煎煮1h，用纱布过滤得药液；将滤渣再加入1倍体积蒸馏水，煎煮30min，用纱布过滤得药液；将3次所得药液混合，旋转蒸发至含生药5g/mL即为荔枝草水提物，冷藏保存备用。
(2)对结直肠癌CT26细胞荷瘤小鼠模型进行制备：将CT26细胞接种于含胎牛血清(15％)和青-链霉素溶液(含青霉素100U/mL，链霉素0.1mg/mL)的RPMI1640培养液中，细胞生长至铺满瓶底85％时用胰酶消化后进行传代，取指数生长期细胞，制成1×106个/mL浓度细胞悬液，取0.2ml细胞悬液，无菌条件下接种于BALB/c小鼠右前肢腋窝皮下，造模后3-5天可在皮下触及明显瘤块(约3mm×3mm)即为结直肠癌CT26细胞荷瘤小鼠模型；
(3)药物干预：取50只移植成功的荷瘤小鼠，灌胃步骤(1)所得的荔枝草水提取物500mg/Kg，每日给药一次，连续给药21天；给药期间每间隔5天用2Gy剂量X线照射一次。
(4)移测定植瘤体积：药物干预后，每天观察小鼠活动、饮食、毛发情况；于给药后第0、7、14、21天分别测定瘤体积。末次测量瘤体积结束后，取小鼠颈椎脱臼处死，快速剥离瘤组织并去除包膜，置于电子天平称取瘤重，然后放入液氮中保存待用。
(6)RT-PCR法测定小鼠瘤组织VEGF、Survivin mRNA表达水平：取冻存的瘤组织50mg置于经DEPC水处理的研钵中，加入适量液氮充分研磨，然后再加入1.0mL RNA提取试剂，移入1.5mL EP管中，根据TRIzolTM Plus RNA Purification Kit RNA提取试剂盒说明进行总RNA提取，按照RT-PCR实验方案进行逆转录和扩增实验。
(7)Western blot法分析小鼠瘤组织VEGF、Survivin蛋白表达水平：取冻存的瘤组织50mg，用组织剪剪碎，置入2.0mL离心管中，加入1.5mL RIPA蛋白裂解液，用电动匀浆器于冰上充分匀浆，静置裂解20min，然后4℃下12000rpm离心15min，取上清于1.5ml离心管中即为提取的总蛋白，调整各样本蛋白浓度一致，严格按照Western blot实验操作流程依次进行变性、上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育及显色拍照等步骤，以β-actin为内参蛋白条带灰度值为参照分析待测蛋白相对表达水平。
对比例1
对比例1中的对移植成功的荷瘤小鼠的药物干预为灌胃给予生理盐水，计量为0.1mL/10g，不进行X线照射，其余步骤与实施例1相同。
对比例2
对比例2中的对移植成功的荷瘤小鼠的药物干预为腹腔注射5-氟尿嘧啶注射液，计量为30mg/Kg，不进行X线照射，其余步骤与实施例1相同。
对比例3
对比例3中的对移植成功的荷瘤小鼠的药物干预为灌胃荔枝草水提取物，计量为500mg/Kg，不进行X线照射，其余步骤与实施例1相同。
对比例4
对比例4中的对移植成功的荷瘤小鼠的药物干预为2Gy计量X线照射，每间隔5天进行照射1次，其余步骤与实施例1相同。
观察实施例1与对比例1-4中移植瘤小鼠的一般情况可发现：对比例1中小鼠进食量下降，活动减少，毛色欠光泽并有脱落现象，体重增长缓慢；对比例2-4中小鼠进食、精神、毛色尚可，活动不多，体重略有增加；实施例1中小鼠状态较其他组小鼠精神状态及毛色明显好转，进食增加，活动较多。
分析实施例1与对比例1-4中瘤体积增长情况可发现：与对比例1比较，对比例2-4及实施例1中小鼠第7、14及21d移植瘤体积增长显著降低(P<0.01)；与对比例2比较，对比例3和对比例4第7、14及21d移植瘤体积增长较快(P<0.01)；实施例1中移植瘤体积增长速度与对比例2相当，详细数据结果见表1和图1。
表1荔枝草水提物联合X线放疗对荷瘤小鼠瘤体积增长的影响(
n＝10)
注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组组比较：#P<0.05，##P<0.01。
计算实施例1与对比例1-4中移植瘤重量及抑瘤率，从结果可知，与对比例1比较，对比例2-4及实施例1中小鼠第7、14及21d移植瘤重显著降低(P<0.05，P<0.01)；与对比例2比较，对比例3和对比例4第7、14及21d移植瘤重明显增高(P<0.01)；实施例1中移植瘤重量与对比例2相当，对比例2-4和实施例1的抑瘤率分别为52.79％、11.04％、15.08％和46.99％。结详细数据结果见表2。
表2荔枝草水提物联合X线放疗对荷瘤小鼠移植瘤重量及抑瘤率的影响(
n＝10)
注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组组比较：#P<0.05，##P<0.01。
通过RT-PCR法测定实施例1与对比例1-4中移植瘤组织的VEGF、Survivin mRNA表达水平可知，与对比例1比较，对比例2-4和实施例1中小鼠移植瘤组织的VEGF、SurvivinmRNA表达水平显著降低(P<0.01)；与对比例2比较，对比例3和对比例4的小鼠移植瘤组织VEGF、Survivin mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。实施例1中小鼠移植瘤组织的VEGF、Survivin mRNA表达水平与对比例2相当，详细数据结果见表3和图2。
表4荔枝草水提物联合X线放疗对移植瘤组织VEGF、Survivin mRNA表达水平的影响(
n＝5)
注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组组比较：#P<0.05，##P<0.01。
通过Western blot法分析实施例1与对比例1-4中移植瘤组织的VEGF、SurvivinmRNA表达水平可知，与对比例1比较，对比例2-4和实施例1中小鼠移植瘤组织的VEGF、Survivin mRNA表达水平显著降低(P<0.01)；与对比例2比较，对比例3和对比例4的小鼠移植瘤组织VEGF、Survivin mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。实施例1中小鼠移植瘤组织的VEGF、Survivin mRNA表达水平与对比例2相当，详细数据结果见表5和图3。
表5荔枝草水提物联合X线放疗对移植瘤组织VEGF、Survivin蛋白表达水平的影响(
n＝5)
注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组组比较：#P<0.05，##P<0.01。
本发明利用荔枝草水提取物放疗增敏剂，改善了放射治疗CT26细胞移植瘤模型小鼠一般活动情况，能够抑制瘤组织生长，降低瘤重，比其各自单独应用效果更佳，且与使用氟尿嘧啶注射液的效果相当，说明荔枝草水提取物放射增敏剂的使用对结直肠癌具有更好的抑制作用。通过探究发现，荔枝草水提取物放疗增敏剂的部分作用机制与下调CT26细胞移植瘤小鼠瘤组织VEGF与Survivin因子的表达有关。本发明进一步开发了荔枝草水提取物在抑制结直肠癌方面的用途，提供一种荔枝草水提取物放疗增敏剂的应用，实验结果证明本发明对结直肠癌生长、增殖具有明显抑制作用。
实验计量数据以
表示，应用SPSS19.0软件进行统计学分析；组间样本均数比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)和LSD-t检验，以P<0.05为组间统计有差异。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用以限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种荔枝草水提取物在制备放疗增敏剂中的应用，其特征在于：增敏剂按照以下步骤应用：
(1)药物干预：对移植成功的结直肠癌CT26细胞荷瘤小鼠，灌胃增敏剂荔枝草水提取物400-500mg/kg，每日给药一次，连续给药21-30天；同时给药期间每间隔5-6天用2Gy剂量X线照射一次；
(2)移测定植瘤体积：药物干预后，每天观察小鼠活动、饮食、毛发情况；于给药后第0、7、14、21天分别测定瘤体积，末次测量瘤体积结束后，取小鼠颈椎脱臼处死，快速剥离瘤组织并去除包膜，置于电子天平称取瘤重，然后放入液氮中保存待用；
(3)RT-PCR法测定小鼠瘤组织VEGF、Survivin mRNA表达水平；
(4)Western blot法分析小鼠瘤组织VEGF、Survivin蛋白表达水平。
2.根据权利要求1所述的一种荔枝草水提取物在制备放疗增敏剂中的应用，其特征在于：所述荔枝草水提取物按照以下步骤制备得到：荔枝草0.5-1.0kg加入2.5-5倍体积蒸馏水，浸泡4-6h，煎煮2-4h，用纱布过滤得药液；将滤渣再加入1-2倍体积蒸馏水，煎煮1-3h，用纱布过滤得药液；将滤渣再加入0 .5-1倍体积蒸馏水，煎煮30min，用纱布过滤得药液；将3次所得药液混合，旋转蒸发至含生药2.5-5g/mL即为荔枝草水提物，冷藏保存备用。
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