CN115998815B - 一种治疗急性冠脉综合征合并肾功能不全的中药组合物及其应用 - Google Patents
一种治疗急性冠脉综合征合并肾功能不全的中药组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物及其应用。该中药组合物包括以下原料药：肉苁蓉、枸杞子、赤芍、薤白、人参和川芎。本发明还公开了上述中药组合物的制备方法及在制备延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展药物中的应用。本发明中药组合物主要通过调控NEAT1/miR‑139‑5p/Fos轴抑制血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的凋亡从而延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展。
Description
技术领域
本发明涉及中医药技术领域。更具体地，涉及一种延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物及其应用。
背景技术
心脏病和肾脏病是我国重大疾病，发病率高，死亡率高，严重威胁人类健康。近些年，现代医学研究逐步发现，心脏病与肾脏疾病具有相关性，许多慢性肾脏疾病的常见指标是心脏病发生发展的独立危险因素，临床上二者往往伴随出现，若在初期不能得到有效控制，后期极易发展为心肾综合征(CRS)，心、肾两者中一个器官对另一个器官的功能损害不能进行代偿，互为因果，形成恶性循环，最终导致心脏与肾脏功能的共同损害及衰竭，其中血管内皮细胞凋亡和肾小管上皮细胞的凋亡是其重要的病理过程，如何通过中西医结合手段延缓该病理过程的发生，从而延缓动脉粥样硬化及肾功能不全的进展，是目前亟待解决的关键问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的一个目的在于提供一种新的中药组合物，该中药组合物能有效延缓动脉粥样硬化及肾功能不全的进展。
本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述中药组合物在制备延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种有效延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物，该中药组合物包括以下原料药：肉苁蓉、枸杞子、赤芍、薤白、人参和川芎。
优选的，该中药组合物包括以下重量份的原料药：肉苁蓉6-40份、枸杞子10-40份、赤芍3-20份、薤白6-20份、人参3-15份和川芎6-30份。
本发明中药组合物主要用于动脉粥样硬化及肾功能不全者，症见胸痛胸闷，或痛引肩背，口唇紫暗，腰膝酸软，夜尿频多等。心脏病和肾脏病初期，存在血管内皮细胞凋亡和肾小管上皮细胞的凋亡的病理改变，发明人通过大量的筛选发现本发明的中药组合物可以显著提高动脉粥样硬化及肾功能不全患者的临床疗效，其机制可能是通过调控lncRNANEAT1/miR-139-5p/Fos轴，减轻H2O2对HUVEC和HK-2细胞的损伤，抑制ROS生成，减少AP-1、Caspase 3和Caspase 9的表达，抑制HUVEC和HK-2细胞的凋亡，进而发挥延缓动脉粥样硬化进展和保护肾脏的作用。
在本发明处方中，君药为肉苁蓉。肉苁蓉：味甘、咸、温，归肾、大肠经，补肾益精、润肠通便，《本草汇言》曰：肉苁蓉，养命门，滋肾气，补精血之药也。补阳不燥，温通肾阳补肾虚；补阴不腻，润肠通腹治便秘。
臣药为枸杞子、赤芍、薤白。枸杞子：味甘、平，归肝、肾经，滋补肝肾，益精明目。赤芍：苦，微寒。归肝、脾经，清热凉血，活血祛瘀。薤白：味辛、苦，温，归肺、胃、大肠经，辛温通阳散结气。
佐使药为人参、川芎。人参：味甘、微苦，性微温，归脾、肺、心、肾经，主治大病、久病、失血、脱液所致元气欲脱，神疲脉微，适用于心气虚衰之失眠多梦，惊悸健忘，体虚多汗。诸药相伍，通补兼施，共奏散瘀血、温肾阳、强筋骨、固中气、化痰湿之功，为胸痹心痛之肾虚血瘀者标本兼治之剂。川芎：味辛、温，归肝、胆、心包经，为血中之气药，活血行气，祛风止痛，辛温香燥，走而不守，既能行散，上行可达巅顶，又入血分下行达血海，其寓辛散、解郁、通达、止痛等功能。
在本发明中，示例性的，所述延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物，包括以下重量份的原料药：肉苁蓉30份、枸杞子40份、赤芍15份、薤白10份、人参10份和川芎10份。
示例性的，所述延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物，包括以下重量份的原料药：肉苁蓉40份、枸杞子30份、赤芍20份、薤白20份、人参15份和川芎30份。
示例性的，所述延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物，包括以下重量份的原料药：肉苁蓉6份、枸杞子10份、赤芍3份、薤白6份、人参3份和川芎6份。
本发明上述中药组合物的各原料药组成基本方，具体实施时，根据临床症状在上述中药组合物的基础上可以进行调整，以达到延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展并改善某些特殊临床症状的目的，进一步增强本发明组合物的适应性，提高治疗效果。基于本发明的基本方所做的这些调整方也在本申请的保护范围内。
第二方面，本发明提供了一种上述延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物的制备方法，该制备方法包括：
将制成所述中药组合物的原料药粉碎后混合，加6-10倍质量的水浸泡0.5-2小时，再煎煮2-3次，每次煎煮40-60分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至每毫升药液相当于生药0.2-3g，即得所述中药组合物；或者，
将制成所述中药组合物的人参，破碎后用6-10倍质量的60-80％乙醇水溶液回流提取2-3次，每次提1-2小时，每次提取完毕后，滤过，收集合并滤液，回收乙醇，将滤液减压浓缩至每毫升药液含0.1-1g生药的人参醇提浸膏；再将提取后剩余的人参药渣与制成所述中药组合物的其它各味原料药合并，用6-10倍质量的水煎煮2-3次，每次煎煮40-60分钟，合并煎液，过滤，滤液与所述人参醇提浸膏合并，再进一步浓缩成每毫升药液相当于生药0.2-3g，即得所述中药组合物；或者，
将制成所述中药组合物的人参粉碎成细粉，待用；将制成所述中药组合物的其它各味原料药合并，用6-10倍质量的水煎煮2-3次，每次煎煮40-60分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至每毫升药液相当于生药0.2-3g，然后向浓缩液中加入人参细粉混匀，即得所述中药组合物。
第三方面，本发明提供了一种延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的药物，该药物以上述中药组合物作为活性成分。
根据实际需要，所述药物还可以包括药学上可接受的辅料。按照常规制剂工艺，制成各种制剂，如煎剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、口服液等剂型。
本发明还提供了上述中药组合物在制备延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的药物中的应用。
另外，如无特殊说明，本发明中药组合物各原料药均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围的中药组合物均可以达到延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的目的。
本发明的有益效果如下：
心脏病和肾脏病是我国重大疾病，发病率高，死亡率高，严重威胁人类健康。近些年，现代医学研究逐步发现，心脏病与肾脏疾病具有相关性，许多慢性肾脏疾病的常见指标是心脏病发生发展的独立危险因素，临床上二者往往伴随出现。本发明中药组合物配方严谨，从科学问题角度来看，可以同时改善心、肾两个重要脏器的损伤及衰竭，避免心肾综合征的发生，从中医理论角度来看，具有补肾固本，活血化瘀，通补兼施的功效。通过对其药用机理的研究，发现其可能通过调控lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos轴，减轻H2O2对HUVEC和HK-2细胞的损伤，抑制ROS生成，减少AP-1、Caspase 3和Caspase 9的表达，抑制HUVEC和HK-2细胞的凋亡，进而发挥延缓动脉粥样硬化进展和保护肾脏的作用。
附图说明
图1示出差异lncRNA热图；
图2示出lncRNA火山图；
图3示出差异miRNA热图；
图4示出miRNA火山图；
图5示出差异mRNA热图；
图6示出mRNA火山图；
图7示出前30的GO富集(注：绿色代表生物过程；蓝色代表细胞组成；红色代表分子功能)；
图8示出382个差异mRNA的KEGG功能富集；
图9示出249个上调mRNA的KEGG功能富集；
图10示出133个下调mRNA的KEGG功能富集；
图11示出ceRNA调控网络(注：蓝色圆形为lncRNA；绿色三角形为miRNA；红色钻石形为mRNA)；
图12示出lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos调控轴的筛选流程；
图13示出本发明中药组合物对lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos轴的影响(注：与治疗前相比，*P<0.05，**P<0.01)；
图14示出本发明中药组合物对患者血浆Fos蛋白的影响(注：与治疗前相比，*P<0.05，**P<0.01)；
图15示出lncRNA NEAT1与miR-139-5p靶向结合的验证(注：与未转染miR-139-5p的细胞相比，*P＜0.05，**P<0.01)；
图16示出lncRNA NEAT1与miR-139-5p可能的结合位点；
图17示出miR-139-5p与Fos靶向结合的验证(注：与未转染miR-139-5p的细胞相比，*P＜0.05，**P<0.01)；
图18示出miR-139-5p与Fos可能的结合位点；
图19示出CCK8检测各组HUVEC和HK-2细胞的OD值和细胞抑制率(注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01)；
图20示出流式细胞术检测各组细胞ROS水平(注：A：HUVEC对照组；B：HUVEC模型组；C：HUVEC治疗组；D：HK-2对照组；E：HK-2模型组；F：HK-2治疗组)；
图21示出各组HUVEC和HK-2细胞的凋亡率(注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01)；
图22示出流式细胞术检测各组细胞凋亡情况(注：A：HUVEC对照组；B：HUVEC模型组；C：HUVEC治疗组；D：HK-2对照组；E：HK-2模型组；F：HK-2治疗组)；
图23示出Tunel染色检测各组HUVEC细胞凋亡指数(注：绿色荧光为Tunel染的凋亡细胞核，蓝色荧光为DAPI染的总细胞核)；
图24示出Tunel染色检测各组HUVEC细胞凋亡指数(注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01)；
图25示出Tunel染色检测各组HK-2细胞凋亡指数(注：绿色荧光为Tunel染的凋亡细胞核，蓝色荧光为DAPI染的总细胞核)；
图26示出Tunel染色检测各组HK-2细胞凋亡指数(注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01)；
图27示出本发明中药组合物对各组HUVEC和HK-2细胞lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos轴的影响(注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01)；
图28示出本发明中药组合物对各组HUVEC和HK-2细胞Caspase 3和Caspase 9的影响(注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01)；
图29示出Western Blot检测各组HUVEC细胞蛋白表达水平(注：A：HUVEC对照组；B：HUVEC模型组；C：HUVEC治疗组)；
图30示出Western Blot检测各组HK-2细胞蛋白表达水平(注：D：HK-2对照组；E：HK-2模型组；F：HK-2治疗组)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1一种延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物
原料药配方：肉苁蓉30g、枸杞子40g、赤芍15g、薤白10g、人参10g和川芎10g。
将制成所述中药组合物的人参，破碎后用8倍质量的75％乙醇水溶液回流提取2次，每次提1小时，每次提取完毕后，滤过，收集合并滤液，回收乙醇，将滤液减压浓缩至每毫升药液含1g生药的人参醇提浸膏；再将提取后剩余的人参药渣与制成所述中药组合物的其它各味原料合并，用8倍质量的水煎煮2次，每次煎煮60分钟，合并煎液，过滤，滤液与所述人参醇提浸膏合并，再进一步浓缩成每毫升药液相当于生药3g，即得所述中药组合物。
实施例2一种延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的中药组合物
原料药配方：肉苁蓉40g、枸杞子30g、赤芍20g、薤白20g、人参15g和川芎30g。
将制成所述中药组合物的人参粉碎成细粉，待用；将制成所述中药组合物的其它各味原料药合并，用10倍质量的水煎煮3次，每次煎煮60分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至每毫升药液相当于生药3g，然后向浓缩液中加入人参细粉混匀，即得所述中药组合物。
实施例3一种延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的药物
原料药配方：肉苁蓉6g、枸杞子10g、赤芍3g、薤白6g、人参3g和川芎6g。
将制成所述中药组合物的原料粉碎后混合，加6倍质量的水浸泡2小时，再煎煮2次，每次煎煮60分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至每毫升药液相当于生药3g，即得所述中药组合物。
实施例4本发明中药组合物调控NEAT1/miR-139-5p/Fos轴抑制血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的凋亡延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的基础研究
1.1高通量测序和qRT-PCR病例收集：选择5例急性冠脉综合征合并肾功能不全患者，将实施例3制备的中药组合物给患者服用，日1剂，早晚2次分服，疗程为4周，收集其运用本发明组合物(实施例3)治疗前后外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcells，PBMCs)进行二代高通量测序，筛选治疗前后的差异lncRNA、miRNA和mRNA，并构建ceRNA调控网络。与此同时，进一步扩大样本量，收集20例患者治疗前后PBMCs，并利用qRT-PCR技术验证本发明中药组合物对lncRNA-miRNA-mRNA轴的调控作用。
1.2样本采集：受试者分别于治疗前和治疗4周后的清晨空腹抽血，采用EDTA真空抗凝管抽取患者外周静脉血4-8ml，保存于4℃冰箱中，并在4小时内分离。
1.3PBMCs和血浆的分离：EDTA采血管离心后提取血浆；使用红细胞裂解液和TRIzol试剂提取PBMCs。
1.4总RNA提取和质检：使用氯仿和异丙醇提取总RNA；取1μl样品，用NanoDrop2000分光光度计测定样品浓度及纯度，检测RNA样本质量。
1.5文库构建和高通量测序：使用UltraTM RNA Library Prep Kit forIllumina和Ribo-Zero Magnetic Gold Kit对lncRNA和mRNA进行文库的构建，采用HiSeq4000 PE150测序仪对每个样品进行测序分析。使用/>Small RNA Library PrepSetfor Illumina对miRNA进行文库构建。采用Hiseq X Ten PE150测序仪对每个样品的miRNA进行测序分析。
1.6差异基因的筛选：利用DESeq软件对各样本中lncRNA、miRNA和mRNA的counts数目进行标准化处理，运用Benjamini-Hochberg方法分析差异基因，并计算差异倍数(foldchange，FC)。以P value<0.05和|log2 FC|>0.58作为筛选差异基因的标准。使用R软件的“ggplot2”和“pheatmap”包绘制差异lncRNA、差异miRNA和差异mRNA的火山图和热图。
实验结果：
通过转录组高通量测序，研究发现本发明中药组合物治疗前后存在696个差异lncRNA(314个上调，382个下调)，86个差异miRNA(74个上调，12个下调)和382个差异mRNA(249个上调，133个下调)。各差异lncRNA、miRNA和mRNA的热图及火山图如图1-图6所示。
1.7差异mRNA的GO和KEGG功能富集：为了进一步明确本发明中药组合物的潜在作用机制，本研究采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在线数据库对差异mRNA进行GO和KEGG功能富集，P<0.05为差异有统计学意义。
实验结果：
利用DAVID在线数据库对382个差异mRNA进行GO和KEGG功能富集。GO富集包括3个部分，生物过程(Biological Processes，BP)，细胞组成(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)。前30的GO富集如图7所示，结果显示BP主要涉及了血小板激活、血液凝固、磷脂酰肌醇3-激酶信号转导的正向调节以及白细胞迁移等生物过程；CC主要涉及细胞膜、细胞外间隙和肌动蛋白细胞骨架等方面；而MF主要涉及趋化因子的活性、鸟苷酸环化酶活性和肌动蛋白结合等方面。
在KEGG富集分析中，对382个差异mRNA进行了功能富集(图8)，研究发现本发明中药组合物干预的信号通路主要包括了血小板激活、血管平滑肌收缩、细胞因子受体相互作用和TGF-β信号通路等方面。与此同时，针对249个上调mRNA(图9)和133个下调mRNA，分别进行了KEGG功能富集(图10)。在上调的mRNA中，本发明中药组合物影响的通路包括了血小板激活、cGMP-PKG信号通路、血管平滑肌收缩和TGF-β信号通路等方面。而在下调mRNA的KEGG富集中，信号通路主要囊括了Toll样受体信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路和MAPK信号通路等方面。
1.8靶基因预测和ceRNA网络构建：使用miRcode数据库预测差异lncRNA的靶miRNA，并与测序得到的差异miRNA取交集。miRNA靶向结合的mRNA，通过TargetScan、miRDB和miRTarBase数据库进行预测，只有在3个数据库中均有相关报道，才认为存在miRNA-mRNA的调控关系。最后，将预测的mRNA与高通量测序筛选的差异mRNA取交集。基于以上lncRNA-miRNA和miRNA-mRNA的相互作用，利用Cytoscape 3.8.0软件对lncRNA-miRNA-mRNA网络进行可视化。
实验结果：
使用miRcode数据库预测miRNA靶向的lncRNA，二者之间存在靶向调控关系的才纳入到ceRNA网络构建中。研究发现，696个差异lncRNA中有27个lncRNA可在数据库中找到靶向结合的miRNA，通过2024条lncRNA-miRNA调控轴，与205个miRNA靶向结合。将预测的205个miRNA与高通量测序筛选得到的86个miRNA取交集，得到了3个差异miRNA(hsa-miR-139-5p、hsa-miR-126-3p和hsa-miR-135a-5p)。进一步运用TargetScan，miRDB和miRTarBase数据库，预测miRNA靶向结合的mRNA，只有在三个数据库中均存在miRNA-mRNA调控关系时，才被纳入到ceRNA网络构建中。最终3个差异miRNA，通过66条miRNA-mRNA调控轴，预测到了65个mRNA。将65个预测的mRNA与高通量测序结果得到的382个差异mRNA取交集，最后得到了4个差异mRNA(FOS、SLC6A4、PTK2和KLF4)。利用Cytoscape 3.8.0软件最终形成了13lncRNA-2miRNA-4mRNA的ceRNA调控网络(如表1和图11)。根据ceRNA网络的调控机制，并结合既往文献资料，初步确定本发明中药组合物可能通过调节lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos轴发挥治疗作用(图12)。
表1本发明中药组合物的ceRNA调控网络
1.9为了进一步验证本发明中药组合物是否通过lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos轴延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展，从治疗组中另外选取20例患者进行了qRT-PCR验证。
RNA反转录：采用lncRcute lncRNA First-Strand cDNA Kit试剂盒，进行lncRNA反转录。采用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit试剂盒进行miRNA反转录。采用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒进行mRNA的反转录。
引物设计：运用Primer Premier 5.0软件设计lncRNA NEAT1，Fos，Caspase 3，Caspase9以及内参ACTB的引物序列，所需引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。此外，U6和miR-139-5p引物购买于北京天根生化科技有限公司，引物序列如表2所示。
表2引物序列
实时定量逆转录聚合酶链反应：采用ABI7900HT荧光定量PCR仪进行分析，lncRNA使用lnRcute lncRNA qPCR Kit(SYBR Green)试剂盒配制反应体系，miRNA采用miRcutePlus miRNA qPCR Kit(SYBR Green)试剂盒配制反应体系，mRNA采用Power SYBR GreenPCR Master Mix试剂盒配制反应体系。
结果显示(如图13)，通过本发明中药组合物治疗可以显著降低lncRNA NEAT1(P＝0.012)和Fos(P＝0.033)的表达，升高miR-139-5p的表达(P＝0.028)。qRT-PCR的结果与转录组高通量测序的结果保持一致，初步证实了本发明中药组合物可能通过干预lncRNANEAT1/miR-139-5p/Fos轴对动脉粥样硬化合并肾功能不全的患者起到治疗作用。Fos作为激活蛋白转录因子1(activator protein transcription factor-1，AP-1)的重要组成部分，能够调控细胞的凋亡，为此我们进一步验证了患者Caspase 3和Caspase 9的表达情况。研究发现，本发明中药组合物可以显著下降Caspase 3水平(P＝0.038)，并有抑制Caspase9表达的趋势，但尚无统计学差异(P＝0.095)。
1.10血浆Fos蛋白的Elisa检测：使用Human-c-fos ELISA Kit试剂盒检测治疗前后血浆Fos的表达水平。
实验结果：
qRT-PCR已经初步证实lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos轴可能是本发明中药组合物延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的作用靶点，本发明中药组合物可显著降低患者Fos的mRNA水平，为进一步探究本发明中药组合物能否影响mRNA的转录，降低患者血浆中Fos蛋白的水平。我们通过ELISA技术，检测本发明中药组合物治疗前后患者血浆中Fos蛋白的表达情况(图14)。结果显示，针对5例测序患者，本发明中药组合物有下降血浆Fos蛋白水平的趋势，但尚无统计学差异(P＝0.064)，进一步扩大样本量，对20例验证组患者进行分析发现，本发明中药组合物可以显著降低患者血浆Fos蛋白水平(P＝0.04995)，而将测序组和验证组患者一同联合分析，亦发现本发明中药组合物可显著降低患者血浆Fos蛋白水平(P＝0.008)。
1.11细胞复苏及日常维护：取出冻存细胞，置于42℃水浴中，1min内快速解冻，放置于100mm培养皿中培养。细胞复苏后24h，更换新鲜生长培养基，当细胞密度增加至80％以上时，加入0.25％胰酶，室温下消化2min，细胞充分消化、悬浮后，再加入生长培养基以终止反应。置于离心机离心5min，细胞沉淀用生长培养基重悬继续培养，或用冻存液重悬后冻存，以备后续使用。293细胞生长培养基：90％ DMEM培养基+10％胎牛血清；HUVEC细胞生长培养基：90％1640培养基+10％胎牛血清；HK-2细胞生长培养基：90％1640培养基+10％胎牛血清。
1.12 293细胞转染：293细胞经常规消化终止后，调整细胞密度为5×104个/ml，当细胞汇合度达到70％以上时，无菌状态下配置A液(每孔反应体系：100μl无血清培养基+稀释25倍的Lipofectamine2000转染试剂，室温混匀5min)和B液(每孔反应体系：100μl无血清培养基+2μg质粒)。将A液和B液混合，室温反应15min。细胞转染分组，见表3。
表3 293细胞转染情况
1.13双荧光素酶报告基因检测：发光仪检测Firefly发光值和内参Renillia发光值，计算发光比值和相对表达量。
(1)lncRNA NEAT1与miR-139-5p的靶向结合
研究发现，lncRNA NEAT1野生型293细胞转染miR-139-5p mimic时，发光值会显著降低(P<0.001)，而lncRNA NEAT1突变型293细胞转染miR-139-5p mimic时，并不会引起发光值的显著变化(P＝0.549)，图15。此外，在基线水平上将miR-139-5p mimic转染至293细胞中不会引起发光值的显著变化(P＝0.137)。可见，miR-139-5p可与lncRNA NEAT1靶向结合，并能够抑制lncRNA NEAT1的表达，二者可能的结合位点如图16所示。
(2)miR-139-5p与Fos的靶向结合
研究还发现，Fos野生型293细胞转染miR-139-5p mimic时，发光值会显著降低(P<0.001)，而Fos突变型293细胞转染miR-139-5p mimic时，不会引起发光值的显著变化(P＝0.155)。此外，在基线水平上将miR-139-5p mimic转染至293细胞中不会引起发光值的显著变化(P＝0.576)，图17。因此，我们通过双荧光素酶报告基因证实了miR-139-5p可以与Fos靶向结合，并能够抑制Fos的表达，其可能结合的位点如图18所示。
1.14本发明中药组合物无毒浓度筛选：用不同浓度的中药组合物(作用浓度为：400、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78和0μg/ml)作用于HUVEC和HK-2细胞24h用酶标仪在450nm下读取不同浓度本发明中药组合物作用下的吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％。分析各组细胞的细胞增殖情况，筛选出本发明中药组合物对HUVEC细胞的最大无毒浓度C1，以及对HK-2细胞的最大无毒浓度C2。
实验结果：
本研究将400μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml和0.78μg/ml的本发明中药组合物分别作用于HUVEC和HK-2细胞，CCK8检测结果显示(见表4)，随着本发明中药组合物浓度的降低，细胞抑制率逐渐降低，本发明中药组合物对于HUVEC细胞最大无毒浓度为3.12μg/ml，对于HK-2细胞本发明中药组合物的最大无毒浓度为1.56μg/ml。
表4本发明中药组合物无毒浓度筛选结果
1.15本发明中药组合物对HUVEC和HK-2细胞增殖的影响
HUVEC和HK-2细胞模型：细胞分组，A组：HUVEC细胞，正常对照组；B组：HUVEC细胞，H2O2模型组；C组：HUVEC细胞，H2O2+中药组合物治疗组；D组：HK-2细胞，正常对照组；E组：HK-2细胞，H2O2模型组；F组：HK-2细胞，H2O2+中药组合物治疗组。HUVEC细胞预先加入C1(3.12μg/ml)浓度的中药组合物作用23h后，在B组和C组中加入100μM的H2O2作用1h；同样，HK-2细胞预先加入C2(1.56μg/ml)浓度的中药组合物作用23h后，在E组和F组加入600μM的H2O2作用1h。
细胞增殖检测：各组细胞模型制备完成后，每孔加入10μl CCK8溶液，充分混匀，37℃下反应2h。使用酶标仪，在450nm下读取OD值，计算细胞抑制率，分析本发明中药组合物对各组细胞增殖的影响。
研究发现(见表5和图19)：H2O2诱导的HUVEC细胞模型组相较对照组而言，OD值显著降低(P<0.001)，细胞平均抑制率达58.89％，细胞增殖水平受到抑制，而本发明中药组合物治疗组相较模型组而言，可以显著升高OD值(P<0.001)，提高细胞存活率，减轻H2O2对HUVEC细胞的损伤。在HK-2细胞方面，H2O2诱导的HK-2细胞相较模型组而言，可以显著降低OD值(P＝0.002)，细胞平均抑制率达37.02％，细胞增殖水平受到抑制，而本发明中药组合物治疗组相较模型组而言，可显著升高OD值(P＝0.029)，提高细胞存活率。可见，本发明中药组合物可以减轻H2O2对HUVEC和HK-2细胞增殖的抑制，提高细胞存活率。
表5本发明中药组合物对各组HUVEC和HK-2细胞增殖的影响
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注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。
1.16流式细胞术检测：各指标取100μl稀释后的染料反应液(ROS指标稀释比例为1：100；凋亡指标稀释比例为1：20)，重悬细胞，常温下避光反应30min。每孔再加入400μlPBS，重悬细胞后，使用流式细胞仪进行检测。ROS指标收集细胞总量10000个/次，通道FL1；凋亡指标收集细胞总量10000个/次，AnnwxinV-PE为通道FL2，7-AAD为通道FL4。使用CellQuest软件对数据进行分析。
(1)ROS水平
采用流式细胞术检测各组细胞ROS水平。研究发现(见表6和图20)，针对HUVEC细胞，H2O2诱导会显著升高HUVEC细胞ROS水平(P<0.001)，而本发明中药组合物干预后，能够显著降低H2O2诱导的HUVEC细胞中ROS水平(P＝0.001)；针对HK-2细胞，H2O2诱导会显著升高HK-2细胞中ROS水平(P<0.001)，与模型组相比，本发明中药组合物治疗组可显著降低H2O2诱导的HK-2细胞中ROS水平(P<0.001)。可见，本发明中药组合物能够抑制H2O2诱导的HUVEC和HK-2细胞中ROS的合成。
表6本发明中药组合物对各组HUVEC和HK-2细胞ROS水平的影响
| 组别 | ROS荧光强度 |
| HUVEC对照组 | 82.79±0.86 |
| HUVEC模型组 | 532.04±83.40** |
| HUVEC治疗组 | 270.44±9.79## |
| HK-2对照组 | 170.36±0.24 |
| HK-2模型组 | 497.71±5.95** |
| HK-2治疗组 | 405.23±1.71## |
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。
(2)细胞凋亡
采用流式细胞术分析各组细胞中早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞以及总凋亡细胞所占的比例。研究发现(如图21和图22所示)，H2O2诱导的HUVEC细胞相较对照组可显著升高HUVEC细胞的早期凋亡率(P<0.001)、晚期凋亡率(P<0.001)和总凋亡率(P<0.001)，而经本发明中药组合物治疗后，治疗组相较模型组可显著降低HUVEC细胞的早期凋亡率(P<0.001)、晚期凋亡率(P<0.001)和总凋亡率(P<0.001)。对于HK-2细胞而言，H2O2诱导的HK-2细胞相较对照组，可显著升高HK-2细胞的早期凋亡率(P<0.001)、晚期凋亡率(P<0.001)和总凋亡率(P<0.001)，经本发明中药组合物治疗后，治疗组相较模型组显著降低了晚期凋亡率(P＝0.004)和总凋亡率(P＝0.001)，对HK-2细胞的早期凋亡率没有显著的影响(P＝0.065)。可见，本发明中药组合物具有抗H2O2诱导HUVEC和HK-2细胞凋亡的作用。
1.17Tunel染色：各组模型制备完成后，弃上清，用PBS洗涤细胞2次。加入500μl细胞固定液，室温下固定15min或4℃过夜后，用PBS洗涤细胞2次。加入1：200稀释的Tunel试剂和1：200稀释的DAPI试剂，室温下避光反应30min后，用PBS洗涤细胞数次。在荧光显微镜下观察各组细胞，各分组100倍拍照1张，200倍拍照6张，检测和分析各组细胞的凋亡情况。
实验结果：
采用Tunel染色技术分析各组细胞的凋亡情况，绿色荧光为Tunel染的凋亡细胞核，蓝色荧光为DAPI染的总细胞核。研究发现，H2O2诱导的HUVEC细胞导致绿色荧光点数明显增加，凋亡指数升高(P<0.001)，经本发明中药组合物治疗后，相较模型组而言，治疗组的绿色荧光点数明显减少，凋亡指数下降(P<0.001)，本发明中药组合物可显著降低H2O2诱导HUVEC细胞的凋亡指数，发挥抗HUVEC细胞凋亡的作用，见图23和图24。
针对HK-2细胞，H2O2诱导的HK-2细胞导致绿色荧光点数明显增加，凋亡指数升高(P＝0.0017)，经本发明中药组合物治疗后，相较模型组而言，治疗组可以减少绿色荧光数量，降低凋亡指数(P＝0.0241)，发挥抗HK-2细胞凋亡的作用，见图25和图26。
1.18qRT-PCR检测：在qRT-PCR检测中，总RNA提取、RNA反转录，引物序列以及qRT-PCR反应条件和操作步骤均与1.4、1.9中的内容相同。
研究发现(如图27和图28)，H2O2诱导的HUVEC细胞氧化损伤模型相较对照组而言，可以显著升高lncRNA NEAT1(P＝0.040)和Fos(P<0.001)水平，降低miR-139-5p(P<0.001)水平，本发明中药组合物治疗组相较模型组而言可以降低lncRNA NEAT1(P＝0.003)和Fos(P＝0.012)水平，升高miR-139-5p(P＝0.026)水平。在凋亡相关基因Caspase 3和Caspase9表达方面，H2O2模型组相较对照组而言可以显著升高Caspase 3(P＝0.040)，并有升高Caspase 9的趋势(P＝0.081)，但尚无统计学意义。经本发明中药组合物治疗后，治疗组相较模型组而言，可以显著降低Caspase 3(P＝0.008)和Caspase 9水平(P＝0.030)。同样，H2O2诱导的HK-2细胞氧化损伤模型相较对照组而言，同样可以显著升高lncRNA NEAT1(P＝0.016)和Fos(P＝0.004)水平，降低miR-139-5p(P＝0.014)水平；与模型组相比，本发明中药组合物治疗组可以降低lncRNA NEAT1(P＝0.025)和Fos(P＝0.011)水平，升高miR-139-5p(P＝0.036)水平。在凋亡相关基因Caspase 3和Caspase 9表达方面，与对照组相比，模型组可以显著升高Caspase 3水平(P＝0.007)和Caspase 9水平(P＝0.019)。与模型组相比，治疗组可以显著降低Caspase 3的表达(P＝0.046)和Caspase 9(P＝0.026)。
1.19Western Blot检测：经过蛋白提取、BCA法蛋白定量、Western Blot蛋白检测和内参蛋白的Western Blot检测的方法，使用eBlot曝光仪进行曝光，曝光时间设置为10s，选择合适曝光时间的图片，采用Image J软件分析各蛋白的灰度值。
研究发现，与对照组相比，H2O2诱导的HUVEC细胞会导致Fos蛋白(P＝0.029)、AP-1蛋白(P＝0.008)、Caspase 3蛋白(P＝0.030)和Caspase 9蛋白(P＝0.025)的显著上升；经本发明中药组合物干预后，治疗组相较模型组而言，可显著降低Fos蛋白(P＝0.037)、AP-1蛋白(P＝0.040)、Caspase 3蛋白(P＝0.025)和Caspase 9蛋白(P＝0.013)水平，见图29。
针对HK-2细胞，与对照组相比，H2O2诱导的HK-2细胞会显著升高AP-1蛋白(P＝0.004)，Caspase 3蛋白(P＝0.022)和Caspase 9蛋白(P<0.001)水平，而对于Fos蛋白没有显著性差异(P＝0.895)；与模型组比较，本发明中药组合物治疗组可以显著降低AP-1蛋白水平(P＝0.007)，Caspase 3蛋白水平(P<0.001)和Caspase 9蛋白水平(P＝0.001)，而对于Fos蛋白没有显著性差异(P＝0.121)，见图30。
本实施例使用的统计方法：本研究采用SPSS Statistics 20.0进行数据统计分析，若数据符合正态分布，则采用两独立样本t检验或配对样本t检验；若不符合正态分布，则采用Man-Whitney U非参数检验或Wilcoxon秩和检验。组间比较时采用卡方检验、校正卡方检验、Fisher精确检验、McNemar检验或单因素ANOVA。在qRT-PCR研究中，基因的相对表达量分析使用2-△△CT方法。△△CT＝(CT目的基因-CT内参基因)治疗后-(CT目的基因-CT内参基因)治疗前。所有检验均采用双侧检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
小结
心脏病和肾脏病初期，存在血管内皮细胞凋亡和肾小管上皮细胞的凋亡的病理改变，本发明中药组合物可以显著提高动脉粥样硬化及肾功能不全患者的临床疗效，其机制可能是通过调控lncRNA NEAT1/miR-139-5p/Fos轴，减轻H2O2对HUVEC和HK-2细胞的损伤，抑制ROS生成，减少AP-1、Caspase 3和Caspase 9的表达，抑制HUVEC和HK-2细胞的凋亡，进而发挥延缓动脉粥样硬化进展和保护肾脏的作用。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种治疗急性冠脉综合征合并肾功能不全的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：肉苁蓉6-40份、枸杞子10-40份、赤芍3-20份、薤白6-20份、人参3-15份和川芎6-30份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：肉苁蓉30份、枸杞子40份、赤芍15份、薤白10份、人参10份和川芎10份。
3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：肉苁蓉40份、枸杞子30份、赤芍20份、薤白20份、人参15份和川芎30份。
4.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：肉苁蓉6份、枸杞子10份、赤芍3份、薤白6份、人参3份和川芎6份。
5.权利要求1-4任一所述的治疗急性冠脉综合征合并肾功能不全的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将制成所述中药组合物的原料药粉碎后混合，加6-10倍质量的水浸泡0.5-2小时，再煎煮2-3次，每次煎煮40-60分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至每毫升药液相当于生药0.2-3g，即得所述中药组合物；或者，
将制成所述中药组合物的人参，破碎后用6-10倍质量的60-80％乙醇水溶液回流提取2-3次，每次提1-2小时，每次提取完毕后，滤过，收集合并滤液，回收乙醇，将滤液减压浓缩至每毫升药液含0.1-1g生药的人参醇提浸膏；再将提取后剩余的人参药渣与制成所述中药组合物的其它各味原料药合并，用6-10倍质量的水煎煮2-3次，每次煎煮40-60分钟，合并煎液，过滤，滤液与所述人参醇提浸膏合并，再进一步浓缩成每毫升药液相当于生药0.2-3g，即得所述中药组合物；或者，
将制成所述中药组合物的人参粉碎成细粉，待用；将制成所述中药组合物的其它各味原料药合并，用6-10倍质量的水煎煮2-3次，每次煎煮40-60分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至每毫升药液相当于生药0.2-3g，然后向浓缩液中加入人参细粉混匀，即得所述中药组合物。
6.一种治疗急性冠脉综合征合并肾功能不全的药物，其特征在于，所述药物以权利要求1-4任一所述的中药组合物为活性成分。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为煎剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂或口服液。
9.权利要求1-4任一所述的中药组合物在制备治疗急性冠脉综合征合并肾功能不全的药物中的应用。
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