CN118178482A - 桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用 - Google Patents
桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域,具体涉及桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用。本发明以桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种为活性成分,能降低高尿酸血症模型小鼠体内的尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脱氨酶(ADA)的水平,减缓高尿酸水平对心脏损伤作用,缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用。
背景技术
高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)是由体内嘌呤代谢障碍和(或)尿酸排泄异常所导致体内血尿酸增高的一种代谢性疾病。目前,高尿酸血症的发病呈现出一种快速增长趋势,高尿酸血症作为独立危险因素发病的同时,还作为诱导发病型因素引发代谢综合征、肾脏疾病、心血管疾病等多种疾病。
目前对高尿酸血症的化学药物治疗已经趋近于成熟,不同作用机制的药物也持续不断地应用于临床,但随着发病的普遍化,化学药物的使用频率和使用适用范围也逐渐增加,其不同程度的副反应也接连体现。现有研究表明,在高尿酸血症初期,通过改变饮食结构和调理身体机能可以对体内尿酸水平具有一定的控制效果,但在现阶段,人们对高尿酸血症的忽视,都使得机体在出现严重反应后才引起注意,通过持续使用化学药物来快速降低尿酸水平,从而增加化学药物的使用剂量和使用周期,诱发各种不良反应,使得用药安全性极大程度的降低。因此,开发安全性高,疗效显著的抗高尿酸血症药物是必要的。
桦褐孔菌Inonotus obliquus(Ach.ex Pers.)Pilát是一种生长在寒带的木腐菌,属于担子菌门、锈革孔菌目、锈革孔菌科、褐卧孔菌属植物,主要寄生在桦树上,也称作桦树茸。桦褐孔菌是一种具有较强医疗保健价值的食药用菌,已经分离得到的活性物质有多糖类、多酚类、黄酮类、三萜类、生物碱类、类固醇、黑色素和木质素类等化合物,具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、免疫调节、降血糖等多种药理学作用,并未有关于高尿酸血症的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用,显著缓解和/或改善高尿酸血症及高尿酸血症相关疾病,安全性高。
本发明提供了桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用;
所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种。
优选的,所述桦褐孔菌水提取物的制备方法包括如下步骤:
按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和水混合煎煮2~3次,每次3~5h;
合并煎煮液后固液分离,收集滤液;所述滤液中含有所述桦褐孔菌水提取物。
优选的,合并煎煮液后,还包括:将所述煎煮液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌水提取物。
优选的,所述桦褐孔菌乙醇提取物的制备方法包括如下步骤:
按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为50%~90%的乙醇水溶液混合,加热回流提取2~3次,每次3~5h;
合并提取液后固液分离,收集滤液;所述滤液中含有所述桦褐孔菌乙醇提取物。
优选的,得到滤液后,还包括:将所述滤液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌乙醇提取物。
优选的,所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物的制备方法包括如下步骤:
按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为80%~95%的乙醇水溶液混合,加热回流提取1~3次,时间为3~5h,得到第一提取液和滤渣;
将所述滤渣和体积浓度为50~70%的乙醇水溶液混合加热回流提取1~3次,时间为3~5h,固液分离,得到第二提取液;所述体积浓度为50%~70%的乙醇水溶液和体积浓度为80%~95%的乙醇水溶液的体积比为1:1;
合并所述第一提取液和第二提取液,浓缩至浸膏状态后重悬,得到混悬液;
将所述混悬液和乙酸乙酯混合,萃取,收集乙酸乙酯层溶液;所述乙酸乙酯层溶液含有所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物。
优选的,得到所述乙酸乙酯层溶液后,还包括:将所述乙酸乙酯层溶液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物。
优选的,所述混悬液和乙酸乙酯的体积比为1:1~3;
所述桦褐孔菌和混悬液的质量体积比为2g:1~5mL。
优选的,所述缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病为降低高尿酸血症所上调的血清尿酸、肌酐、尿素氮、黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶中的一种或多种的水平;所述相关疾病包括与高尿酸血症相关的心肌病。
本发明还提供了一种缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物,所述药物的活性成分包括桦褐孔菌提取物;
所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种。
有益效果:
本发明提供了桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用;所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种。本发明以桦褐孔菌提取物为活性成分,能降低高尿酸血症模型小鼠体内的尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脱氨酶(ADA)的水平,减缓高尿酸水平对心脏损伤作用,缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1不同样品对黄嘌呤氧化酶活性的影响;
图2为不同处理组小鼠的体重变化;
图3为心脏超声功能检测结果;其中,*表示给药组(BA、BB、HT-A、HT-B、HC-A、HC-B)与模型组(M)比较具有差异(P<0.05),#表示模型组(M)与对照组(C)比较具有差异(P<0.05);
图4为不同处理组小鼠血清中尿酸(UA)含量;其中,*表示给药组(BA、BB、HT-A、HT-B、HC-A、HC-B)与模型组(M)比较具有差异(P<0.05),#表示模型组(M)与对照组(C)比较具有差异(P<0.05);
图5为不同处理组小鼠血清中肌酐(CRE)含量;其中,*表示给药组(BA、BB、HT-A、HT-B、HC-A、HC-B)与模型组(M)比较具有差异(P<0.05),#表示模型组(M)与对照组(C)比较具有差异(P<0.05);
图6为不同处理组小鼠血清中尿素氮(BUN)含量;其中,*表示给药组(BA、BB、HT-A、HT-B、HC-A、HC-B)与模型组(M)比较具有差异(P<0.05),#表示模型组(M)与对照组(C)比较具有差异(P<0.05);
图7为不同处理组小鼠血清中黄嘌呤氧化酶(XOD)含量;其中,*表示给药组(BA、BB、HT-A、HT-B、HC-A、HC-B)与模型组(M)比较具有差异(P<0.05),#表示模型组(M)与对照组(C)比较具有差异(P<0.05);
图8为不同处理组小鼠血清中腺苷脱氨酶(ADA)含量;其中,*表示给药组(BA、BB、HT-A、HT-B、HC-A、HC-B)与模型组(M)比较具有差异(P<0.05),#表示模型组(M)与对照组(C)比较具有差异(P<0.05);
图9为不同处理组小鼠心脏组织病理形态观察(HE染色)结果;其中,A~H依次为空白对照组(C)、高尿酸模型组(M)、阳性对照别嘌呤醇组(BA)、阳性对照药苯溴马隆组(BB)、桦褐孔菌乙醇提取物低剂量组(HT-A)、桦褐孔菌乙醇提取物高剂量组(HT-B)、桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物低剂量组(HC-A)和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物高剂量组(HC-B);
图10为不同样品对H9C2细胞毒性的影响;其中,#表示模型组(M)与对照组(C)比较具有差异(P<0.05)。
具体实施方式
本发明提供了桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用;
所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种。
在本发明中,所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种,优选为桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物或桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物,进一步优选为桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物。本发明所述桦褐孔菌购买自延边丰义土特产有限公司。
在本发明中,所述桦褐孔菌水提取物的制备方法优选包括如下步骤:按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和水混合煎煮2~3次,每次3~5h;合并煎煮液后固液分离,收集滤液;所述滤液中含有所述桦褐孔菌水提取物。在本发明中,所述料液比优选为1g:15mL;每次煎煮的时间优选为4h。得到滤液后,本发明优选将所述滤液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌水提取物。本发明所述干燥的方式优选为真空减压干燥。
在本发明中,所述桦褐孔菌乙醇提取物的制备方法优选包括如下步骤:按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为50%~90%的乙醇水溶液混合,加热回流提取2~3次,每次3~5h;合并提取液后固液分离,收集滤液;所述滤液中含有所述桦褐孔菌乙醇提取物。得到滤液后,本发明优选将所述滤液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌乙醇提取物。本发明优选按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为60%~80%的乙醇水溶液混合,进一步优选按照按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为70%的乙醇水溶液混合。在本发明中,所述料液比优选为1g:15mL;每次煎煮的时间优选为4h。
在本发明中,所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物的制备方法优选包括如下步骤:按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为80%~95%的乙醇水溶液混合,加热回流提取1~3次,时间为3~5h,得到第一提取液和滤渣;将所述滤渣和体积浓度为50%~70%的乙醇水溶液混合加热回流提取1~3次,时间为3~5h,固液分离,得到第二提取液;所述体积浓度为50%~70%的乙醇水溶液和体积浓度为80%~95%的乙醇水溶液的体积比为1:1~3;合并所述第一提取液和第二提取液,浓缩至浸膏状态后重悬,得到混悬液;将所述混悬液和乙酸乙酯混合,萃取,收集乙酸乙酯层溶液;所述乙酸乙酯层溶液含有所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物。在本发明中,所述料液比优选为1g:15mL;每次加热回流提取的时间优选为5h。
得到所述乙酸乙酯层溶液后,本发明优选将所述乙酸乙酯层溶液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物。在本发明中,所述混悬液和乙酸乙酯的体积比优选为1:1~3,进一步优选为1:2;所述桦褐孔菌和混悬液的质量体积比优选为2g:1~5mL,进一步优选为2g:2~4mL,更优选为2g:3mL。
在本发明中,所述缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病优选为降低高尿酸血症所上调的血清尿酸、肌酐、尿素氮、黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶中的一种或多种的水平;所述相关疾病优选包括与高尿酸血症相关的心脏损伤,进一步优选为与高尿酸血症相关的心肌病。
本发明以桦褐孔菌提取物为活性成分,能降低高尿酸血症模型小鼠体内的尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脱氨酶(ADA)的水平,减缓高尿酸水平对心脏损伤作用,缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病。
本发明还提供了一种缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物,所述药物的活性成分包括桦褐孔菌提取物;
所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
桦褐孔菌提取物的制备
1.桦褐孔菌水提取物
称取桦褐孔菌100g,将其粉碎成块状,按照1g:10mL的料液比加蒸馏水煎煮2次,每次3h,合并提取液,滤过,取滤液加热浓缩至浸膏状态,通过真空减压至干粉状,研细,称重,得到桦褐孔菌水提取物,记作样品S1,保存备用;
2.桦褐孔菌乙醇提取物
(1)称取桦褐孔菌100g,将其粉碎成块状,按照1g:10mL的料液比加体积浓度为50%的乙醇溶液,加热回流提取2次,每次3h,合并两次提取液并滤过,滤液经旋转蒸发仪回收溶剂并浓缩至湿浸膏状态,通过真空减压至干粉状,研细,称重,得到桦褐孔菌50%乙醇提取物,记作样品S2,保存备用;
(2)参照步骤(1)的方式,将体积浓度为50%的乙醇溶液替换为体积浓度为60%的乙醇溶液进行提取,最终得到桦褐孔菌60%乙醇提取物,记作样品S3,保存备用;
(3)参照步骤(1)的方式,将体积浓度为50%的乙醇溶液替换为体积浓度为70%的乙醇溶液进行提取,最终得到桦褐孔菌70%乙醇提取物,记作样品S4,保存备用;
(4)参照步骤(1)的方式,将体积浓度为50%的乙醇溶液替换为体积浓度为80%的乙醇溶液进行提取,最终得到桦褐孔菌80%乙醇提取物,记作样品S5,保存备用;
(5)参照步骤(1)的方式,将体积浓度为50%的乙醇溶液替换为体积浓度为90%的乙醇溶液进行提取,最终得到桦褐孔菌90%乙醇提取物,记作样品S6,保存备用;
3.桦褐孔菌有机溶剂提取物
称取桦褐孔菌400g,将其粉碎成块状,先加入体积浓度为95%的乙醇溶液4000mL,加热回流提取1次,时间为3h,滤过后,收集滤液;向滤渣中再加入体积浓度为70%的乙醇溶液4000mL,加热回流提取1次,时间为3h,合并两次提取液后并滤过,滤液经旋转蒸发仪浓缩至无醇味浸膏状态(浓缩物加适量水溶液使呈现混悬状态),浸膏加水混悬至200mL,得到混悬液;
(1)取混悬液,按1:1的料液比向混悬液中加入石油醚(60~90℃)萃取,萃取至无色,收集石油醚萃取层,旋转蒸发仪浓缩至浸膏状态,通过真空减压至干粉状,研细,称重,得桦褐孔菌石油醚提取物,记作样品S7,保存备用;
(2)取混悬液,按1:1的料液比向混悬液中加入三氯甲烷萃取,萃取至无色,收集三氯甲烷萃取层,旋转蒸发仪浓缩至浸膏状态,通过真空减压至干粉状,研细,称重,得桦褐孔菌三氯甲烷提取物,记作样品S8,保存备用;
(3)取混悬液,按1:1的料液比向混悬液中加入乙酸乙酯萃取,萃取至无色,收集乙酸乙酯萃取层,旋转蒸发仪浓缩至浸膏状态,通过真空减压至干粉状,研细,称重,得桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物,记作样品S9,保存备用;
(4)取混悬液,按1:1的料液比向混悬液中加入正丁醇萃取,萃取至无色,收集正丁醇萃取层,旋转蒸发仪浓缩至浸膏状态,通过真空减压至干粉状,研细,称重,得桦褐孔菌正丁醇提取物,记作样品S10,保存备用;将萃取剩余水相部分,加热浓缩干燥,记为样品S11,称重分装备用。
实施例2
不同样品对黄嘌呤氧化酶抑制作用的浓度效应测定
1.体外孵育体系建立
体外孵育条件保持在总量为5mL的条件下,以黄嘌呤溶液为底物,吸取底物和黄嘌呤氧化酶各800μL置于样品瓶中,震荡摇匀启动反应,将样品瓶处于恒温水浴锅中固定反应时间,反应完毕取出后置于95℃热水中5min终止反应,后再用PBS 3.4mL定容摇匀至刻度。反应溶液经精细滤头滤过,采用s 6000液相色谱仪进行HPLC分析,检测反应产物尿酸的含量。
其中,酶促反应过程中,黄嘌呤氧化酶的反应终浓度为0.06U/mL、底物的反应终浓度为400μmol·L-1,反应时间为30min,反应温度为25℃;
色谱条件为,流动相A(乙腈):流动相B水(含0.1%甲酸溶液)=3:97;洗脱时间:10min;进样量:10μL;流速:0.8mL/min;柱温箱:30℃;尿酸检测波长:293nm。
2.取实施例1中待测物样品(S1~S11)进行浓度效应的测定,用PBS缓冲液将待测溶液分别稀释为1、2、4、6、8、10mg/mL 6个浓度梯度。将不同浓度待测液各400μL加入到步骤1反应体系中进样分析,测定不同待测液的吸收峰面积(E),平行操作3次,记录平均值,按照下述公式计算抑制率,结果如表1和图1所示。
抑制率(%)=(E样品-E空白)/E空白×100%
其中,E空白为不加待测样品反应体系生成尿酸的吸收峰面积值;E样品为加入待测样品于反应体系后生成尿酸的吸收峰面积值。
表1待测物样品对黄嘌呤氧化酶抑制效果
根据表1和图1可以看出,S1(水提取物)、S2(50%乙醇提取物)S3(60%乙醇提取物)、样品S4(70%乙醇提取物)、样品S5(80%乙醇提取物)、样品S6(90%乙醇提取物)、S9(乙酸乙酯萃取物)均对黄嘌呤氧化酶具有抑制活性,S9呈现明显的抑制活性。由于在实验过程中,S7(石油醚提取物)、S8(三氯甲烷提取物)、S10(正丁醇提取物)和S11这4个样品并未检测到吸收峰面积,即没有黄嘌呤氧化酶抑制活性,因此,并未在图1中体现。
实施例3
动物实验
1.动物模型造模
氧嗪酸钾作为尿酸氧化酶抑制剂抑制小鼠体内尿酸的自行分解,次黄嘌呤作为补充合成尿酸前体物质增加尿酸的合成,经过持续给药干预,最终使得小鼠尿酸水平保持持续升高的状态;本发明采用通过联合用药造模机制选择氧嗪酸钾和次黄嘌呤建立高尿酸血症(HUA)小鼠模型,具体步骤如下:
6~8周龄C57BL/6J雄性小鼠(SPF级)48只,按照体重随机分为8组,每组6只,适应性饲养一周,随机分为8组,每组小鼠均自由摄食,并将明暗交替维持在12h/12h的环境中。所有动物实验操作均符合瑞安市人民医院动物伦理委员会的要求;
①空白对照组(C):以0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na)溶液,按照0.3mL/天的剂量灌胃;
②高尿酸模型组(M):以氧嗪酸钾300mg/kg/天联合次黄嘌呤500mg/kg/天给药,其中,氧嗪酸钾以腹腔注射方式给药,次黄嘌呤以灌胃方式给药;
③阳性对照别嘌呤醇组(BA):以别嘌呤醇5mg/kg/天灌胃;
④阳性对照药苯溴马隆组(BB),以药苯溴马隆7.8mg/kg/天灌胃;
⑤桦褐孔菌乙醇提取物低剂量组(HT-A):以实施例1制备的桦褐孔菌80%乙醇提取物50mg/kg/天灌胃;
⑥桦褐孔菌乙醇提取物高剂量组(HT-B):以实施例1制备的桦褐孔菌80%乙醇提取物100mg/kg/天灌胃;
⑦桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物低剂量组(HC-A):实施例1制备的桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物50mg/kg/天灌胃;
⑧桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物高剂量组(HC-B):以实施例1制备的桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物100mg/kg/天灌胃。
除空白对照组(C)外,对其余7组小鼠每天以高尿酸模型组(M)给药剂量及给药方式连续给药14天进行造模,在第14天时,每组随机取出一只,通过试剂盒测定血尿酸浓度判断模型成立程度是否可以进行给药。判断造模成功,按照每组设定给予相应的药物进行干预治疗,所有药物均使用0.5%CMC-Na作为溶剂配置。
2.小鼠的一般状态观察
观察各组小鼠的精神状态、活动情况、饮食状态、毛色变化等,每周监测记录小鼠的体重。
结果表明,实验周期时长为6周过程中,空白对照组小鼠体重呈正常上升趋势,其精神状态良好无任何异常,饮食及排泄状况无任何异常且反应动作敏捷。模型组小鼠在持续给予药物的作用下,体重出现增长缓慢,4周后下降趋势,同时精神状态与正常小鼠对比略显异常,活动程度也有所降低并伴随毛色出现棕灰色的颜色变化,饮食出现摄食量减少,饮水量增加的情况。其他各个给药组相比模型组均出现不同程度的好转,阳性药物组和治疗给药组的体重无显著差异,趋势基本一致,个别出现小幅度的下降(图2)。
3心脏超声功能检测
灌胃前和灌胃第28天(共计42天)这两个时间节点对各组小鼠进行心超功能检测,具体操作如下:
小鼠胸腹部进行脱毛,调整麻醉机中异氟烷气体浓度至2%,麻醉小鼠。诱导麻醉完成后,设置维持麻醉浓度至1-1.5%,然后转换开关将气体流入麻醉面罩,将小鼠头/鼻放入面罩内,确认状态良好即可进行后续检测。涂抹耦合剂后,将探头平行于小鼠正中线置于其左胸,探头头端朝向小鼠头端,此时将探头头端向右先转45°,使探头与小鼠左室长轴平行,获取图片即为胸骨旁左心室长轴切面图。在长轴基础上,探头头端向左旋转90°左右,有规律移动倾斜探头,显示乳头肌水平,获取图像即为左心室短轴乳头肌切片图。
左心功能测试:选择8个点,分别是舒张末期室间隔上壁、舒张末期室间隔下壁、舒张末期游离壁上缘、舒张末期游离壁下缘、收缩末期室间隔上壁、收缩末期室间隔下壁、收缩末期游离壁上缘、收缩末期游离壁下缘进行测量即得射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、舒张末期左心室内径(LVIDd)、收缩末期左心室内径(LVIDs)、舒张末期左心室壁厚度(LVPWd)收缩末期左心室壁厚度(LVPWs)、舒张末期左心室内容积(LVEDV)、收缩末期左心室容积(LVESV)。
检测结果表明,与正常组相比,模型组小鼠心脏心功能指标,LVEF,E/A有所下降,表明心肌受损。给药后,给药组的LVEF,E/A均高于对照组,其中BB组、HT-B组、HC-B组心功能指数显著升高(P<0.05)。说明桦褐孔菌的乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物高剂量组,可以改善高尿酸诱导的心肌损伤(图3)。
4.桦褐孔菌对高尿酸血症小鼠血清生化指标的影响
(1)血清及组织样品的制备
按照步骤1的方式灌胃给药28天(共计42天)后,将各组小鼠用异氟烷麻醉后取血,于4℃3000r/min转速下离心20min,取上清液,放置-80℃保存。麻醉后取小鼠心脏,取一部分置于4%多聚甲醛固定,其他过液氮中后,放置于-80℃保存备用。
(2)血清中生化指标的测定
①小鼠血清中尿酸(UA)的含量测定
按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)操作,精确加入试剂和各测定样品,于37℃孵育10min,酶标仪检测吸光度数值(510nm波长)按照说明书中的公式计算血清中尿酸的浓度值。结果表明,与空白组小鼠相比,模型组小鼠的UA值出现显著程度的增加(p<0.05),说明模型造模成功;与模型组相比,在持续给予桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物治疗干预后,给药剂量组均发挥不同程度的药理作用,显著的降低了小鼠的UA值(p<0.05),桦褐孔菌乙醇提取物高剂量组和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物低剂量组一定程度的接近于空白组正常小鼠的UA值,同时选用两个阳性对照药物组的小鼠,UA值也出现不同程度的降低并趋近于/或低于空白组小鼠的UA值(p<0.01)(图4)。
②小鼠血清中肌酐(CRE)的含量测定
按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)操作,精确加入试剂和各测定样品,于37℃孵育5min,酶标仪检测吸光度数值A1(546nm波长),后再加入试剂液二混匀,37℃孵育5min,酶标仪检测吸光度数值A2(546nm波长),按照说明书中的公式计算血清中肌酐的浓度值。结果表明,与空白组小鼠相比,模型组小鼠的CRE值出现极显著程度的增加(p<0.5),与模型组相比,在持续给予桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物治疗干预后,桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物的两个给药剂量组均发挥不同程度的药理作用,显著的降低了小鼠的CRE值(p<0.05),并一定程度的接近于空白组正常小鼠的CRE值,同时选用两个阳性对照药物组的小鼠,CRE值也出现不同程度的降低并趋近于空白组小鼠的CRE值(p<0.05),但是桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物低剂量组的CRE无显著差异(图5)。
③小鼠血清中尿素氮(BUN)的含量测定
按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)操作,精确加入试剂和各测定样品,于37℃孵育10min,酶标仪检测吸光度数值(640nm波长)按照说明书中的公式计算血清中尿素氮的浓度值。结果表明,与空白组小鼠相比,模型组小鼠的BUN值出现极显著程度的增加(p<0.5),与模型组相比,在持续给予桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物治疗干预后,桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物的两个给药剂量组均发挥不同程度的药理作用,显著的降低了小鼠的BUN值(p<0.05),并一定程度的接近于空白组正常小鼠的BUN值与,同时选用两个阳性对照药物组的小鼠,BUN值也出现不同程度的降低并趋近于空白组小鼠的BUN值(p<0.05)(图6)。
④小鼠血清中黄嘌呤氧化酶(XOD)的含量测定
按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)操作,精确加入试剂和各测定样品,于37℃孵育20min,后再加入试剂液五混匀,酶标仪检测吸光度数值A(530nm波长),放置在酶标仪上,设置530nm波长条件下检测吸光度数值A,按照说明书中的公式中计算血清中黄嘌呤氧化酶的浓度值。结果表明,与空白组小鼠相比,模型组小鼠的XOD活力值出现极显著程度的增加(p<0.05),与模型组相比,在持续给予萃取物治疗干预后,桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物的两个给药剂量组均发挥不同程度的药理作用,显著的降低了小鼠的XOD活力值(p<0.05),并一定程度的接近于空白组正常小鼠的XOD活力值,同时选用两个阳性对照药物组的小鼠,XOD活力值也出现不同程度的降低并趋近于空白组小鼠的黄XOD活力值(p<0.05)(图7)。
⑤小鼠血清中腺苷脱氨酶(ADA)的含量测定
按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)操作,精确加入试剂和各测定样品,于37℃孵育3min,酶标仪检测吸光度数值A1(546nm波长);120s后在同等检测条件下检测吸光度值A2,按照说明书中的公式中计算血清中黄嘌呤氧化酶的浓度值。结果表明,与空白组小鼠相比,模型组小鼠的ADA活力值出现显著程度的增加(p<0.05),与模型组相比,在持续给予萃取物治疗干预后,桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物的两个给药剂量组均发挥不同程度的药理作用,显著的降低了小鼠的ADA活力值(p<0.05),并一定程度的接近于空白组正常小鼠的ADA活力值,同时选用两个阳性对照药物组的小鼠,ADA活力值也出现不同程度的降低并趋近于空白组小鼠的ADA活力值(p<0.05)(图8)。
5.心脏组织病理形态观察
根据步骤4可以看出,模型组给药使小鼠的生化指标出现明显病理状态变化,提示高尿酸状态对脏器组织具有较大程度的影响,其他各治疗给药组使小鼠生化指标得到明显改善,提示桦褐孔菌可能对脏器组织具有一定程度的保护作用。因此,接下来通过对高尿酸血症小鼠的心脏病理切片进行观察,具体步骤如下:
5.1石蜡包埋切片
(1)4%多聚甲醛固定小鼠心组织24-48h后,取组织装入包埋盒,流水冲洗30min以上;
(2)脱水后透明并浸蜡包埋:组织置于40%和70%乙醇各20min,80%、乙醇I、乙醇II、无水乙醇I和无水乙醇II各10min,二甲苯I和二甲苯II各5min,56-58℃软蜡30min,硬蜡包埋40min;
(3)包埋:组织放在包埋盒的中央,避免气泡产生;
(4)切片:组织包埋好后,切成3μm厚度;
(5)捞片、展片、烤片:于50℃水浴展开,在烘片机上烤1h,防止脱片。
5.2HE染色
(1)切片脱蜡至水:切片放入二甲苯I中10min,二甲苯II、无水乙醇I、无水乙醇II、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇各5min,流水冲洗5min;
(2)HE染色:苏木素液染色2min后,用小水流冲洗5min,1×PBS返蓝2min,流水冲洗5min,伊红染色6min,流水冲洗5min;
(3)脱水、透明、封固:切片依次在85%、90%、95%I、95%II、100%I、100%II乙醇浓度各10下,二甲苯I和二甲苯II各3min,中性树胶封片,显微观察,结果如图9所示。
根据图9可以看出,与空白组相比,模型组存在明显的炎症细胞浸润,心肌细胞排列无序,细胞核深色。与模型组相比,别嘌呤醇组和苯溴马隆组改善了小鼠心脏的炎症浸润;桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物组也改善了小鼠心脏的炎症浸润,改善程度未达到阳性药物组。
实施例4
不同样品对H9C2细胞毒性的影响
取对数生长期的H9C2细胞,消化计数后用完全培养基调整到浓度为3×104个/孔,以每孔100μL的体积接种于96孔板中,随机分为阳性对照别嘌呤醇组(BA),阳性对照药苯溴马隆组(BB),桦褐孔菌乙醇提取物(HT)和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物(HC)4个处理组,每个处理组设置空白对照组(C)、高尿酸对照组(M)和给药组;各处理组在培养箱中培养24h后,弃去原有培养基,空白对照组(C)给予正常培养基,其余处理组给与含有2.5μmol/L腺苷的培养基进行高尿酸刺激,24-48h后,为了避免血清中生长因子等条件影响,将培养条件替换成无血清培养基DMEM,进行血清饥饿;12h后,将各孔中培养基替换给药,其中,空白对照组(C)给DMEM(Free)培养基;阳性对照别嘌呤醇组(BA),阳性对照药苯溴马隆组(BB),桦褐孔菌乙醇提取物(HT),桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物(HC)用培养基梯度稀释给药浓度为0.14、1.4、14、28、70μM各孔给药100μL,每个浓度设置6个复孔;在培养箱中培养24h后,吸出原有培养基,在各孔中缓慢加入100μL含有10%CCK-8试剂的Free培养基,操作过程中应避免产生气泡,置于培养箱中避光孵育2h;孵育后使用酶标仪在450nm波长下对各孔OD值进行检测,按照下述公式计算细胞存活率,并用Excel与GraphPad Prism程序对数据进行分析处理。结果表明,桦褐孔菌乙醇提取物(HT)和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物(HC)在给药浓度为0.14~70μM的浓度范围内细胞毒性无显著差异,均为安全浓度范围,说明其细胞毒性小,安全性高(图10)。
细胞存活率(%)=实验组所测OD值/空白组所测OD值×100%。
根据上述内容可以看出,桦褐孔菌萃取物安全性高,能降低高尿酸血症模型小鼠的UA、CRE、BUN、XOD、ADA指标的体内水平,能减缓高尿酸水平对心脏损伤作用,其存在的作用机制,可能是通过抑制XOD活性及减少XOD的含量来减少尿酸的合成。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.桦褐孔菌提取物在制备缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物中的应用;
所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述桦褐孔菌水提取物的制备方法包括如下步骤:
按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和水混合煎煮2~3次,每次3~5h;
合并煎煮液后固液分离,收集滤液;所述滤液中含有所述桦褐孔菌水提取物。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,得到滤液后,还包括:将所述滤液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌水提取物。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述桦褐孔菌乙醇提取物的制备方法包括如下步骤:
按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为50%~90%的乙醇水溶液混合,加热回流提取2~3次,每次3~5h;
合并提取液后固液分离,收集滤液;所述滤液中含有所述桦褐孔菌乙醇提取物。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,得到滤液后,还包括:将所述滤液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌乙醇提取物。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物的制备方法包括如下步骤:
按照1g:10~20mL的料液比将桦褐孔菌和体积浓度为80%~95%的乙醇水溶液混合,加热回流提取1~3次,时间为3~5h,得到第一提取液和滤渣;
将所述滤渣和体积浓度为50%~70%的乙醇水溶液混合加热回流提取1~3次,时间为3~5h,固液分离,得到第二提取液;所述体积浓度为50%~70%的乙醇水溶液和体积浓度为80~95%的乙醇水溶液的体积比为1:1;
合并所述第一提取液和第二提取液,浓缩至浸膏状态后重悬,得到混悬液;
将所述混悬液和乙酸乙酯混合,萃取,收集乙酸乙酯层溶液;所述乙酸乙酯层溶液含有所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,得到所述乙酸乙酯层溶液后,还包括:将所述乙酸乙酯层溶液浓缩至浸膏状态,干燥,得到所述桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述混悬液和乙酸乙酯的体积比为1:1~3;所述桦褐孔菌和混悬液的质量体积比为2g:1~5mL。
9.根据权利要求1~8任一项所述的应用,其特征在于,所述缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病为降低高尿酸血症所上调的血清尿酸、肌酐、尿素氮、黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶中的一种或多种的水平;
所述相关疾病包括与高尿酸血症相关的心肌病。
10.一种缓解和/或改善高尿酸血症及相关疾病的药物,其特征在于,所述药物的活性成分包括桦褐孔菌提取物;
所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌水提取物、桦褐孔菌乙醇提取物和桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中的一种或多种。
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