CN101049506A - 水泡口炎病毒m蛋白dna制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术和生物工程技术。提供了一种简单易行，成本低廉的表达水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)M蛋白(MatrixProtein)的DNA制剂。水泡口炎病毒是弹状病毒科的原型病毒，具有明确的抗肿瘤作用，其M蛋白是主要的凋亡诱导蛋白。将M蛋白基因扩增出来，克隆到真核表达载体上构建成重组质粒，该重组质粒进入细胞后能够表达出M蛋白。大量扩增并纯化该质粒，然后用阳离子脂质体包裹制备成DNA制剂。该制剂能够诱导肿瘤细胞的凋亡，激发机体的免疫反应，抑制肿瘤的生长和转移，增加肿瘤对放疗的敏感性，可作为一种抗肿瘤制剂的药物加以应用。
Description
技术领域 本发明涉及基因工程和生物工程技术。特别是一种诱导细胞凋亡的病毒蛋白—水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂及其制备方法和应用。
背景技术 细胞生长调节紊乱被认为是肿瘤形成的重要因素，因此诱导肿瘤细胞凋亡是目前大部分抗肿瘤药物发挥作用的机理，也是寻找抗肿瘤药物的重要方向之一。水泡口炎病毒VSV是弹状病毒科的原型病毒，完整的病毒颗粒呈子弹状，有包膜，长约180nm，宽约70nm，病毒基因组是一条长11.6Kb的负链RNA，编码五种蛋白质：核蛋白N，非结构蛋白P，基质蛋白M，表面糖蛋白G和聚合酶L(图1)。我们和其他实验室的研究都表明VSV活病毒能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，具有明显的抗肿瘤作用(参见：Stojdl DF，Lichty B，Knowles S，et al.Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway witha previously unknown oncolytic virus.Nat.Med.2000；6：821-825)。但完整的活病毒做为抗肿瘤制剂加以应用存在着自身难以克服的缺陷：一方面病毒本身作为外源物质存在着很强的免疫原性，能诱导强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应，细胞免疫反应有利于抗肿瘤效应的发挥，但体液免疫反应却能中和掉病毒本身，影响抗肿瘤作用的发挥，因此在多次反复使用后抗肿瘤效果会大大下降甚至完全失效；另一方面活病毒本身存在着潜在的生物安全性的问题，虽然目前为止都认为VSV对人是安全的，大部分时候不会引起人类患病，极少数时候会引起类似感冒症状的自限性症状，但VSV却能感染马、牛、羊等家畜类动物，引起广泛流行和较为严重的后果。但如果是蛋白组分而不是活病毒便不会存在这些生物安全性问题的顾虑。VSV病毒的M蛋白是连接病毒包膜和核衣壳的成分，其基因全长690bp，编码229个氨基酸，M蛋白大小为26KD，其基因和蛋白质序列(图2)来自Genbank NC_001560和NP_041714。M蛋白在病毒包装及VSV引起的细胞病变中起着重要的作用。在VSV其他病毒蛋白缺失的情况下M蛋白仍然能够诱导细胞的凋亡，其诱导细胞凋亡的机制主要是通过抑制宿主细胞的基因表达，与细胞的mRNA转运因子Rae1结合从而阻止核内的mRNA转运到细胞质中有关，同时M蛋白还能引起细胞周期和细胞形态的改变。因此，VSV的M蛋白是强有力的细胞凋亡诱导因子(参见Kopecky SA，Lyles DS.Contrasting effects of matrix protein on apoptosis in HeLa and BHK cells infectedwith vesicular stomatitis virus are due to inhibition of host gene expression.J Virol.2003；77(8)：4658-4669)。
发明内容 本发明正是为了克服活病毒作为抗肿瘤应用的不足之处而提供的一种诱导细胞凋亡的水泡口炎病毒M蛋白，将该基因导入肿瘤细胞后可以引起肿瘤细胞的凋亡，激发机体的抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤的生长，可以作为一种抗肿瘤药物进行开发。
为了避开不必要的免疫反应，也为了避免使用活病毒可能存在的生物安全性问题，我们将主要的发挥诱导细胞凋亡功能的病毒组分M蛋白单独克隆出来，用阳离子脂质体进行包裹，制备成抗肿瘤DNA制剂。该制剂是由组分A和组分B组成，组分A是由表达M蛋白的真核质粒以1-5mg/ml的浓度溶于蒸馏水或者含5-50mmol/l Tris和0.5-5mmol/l EDTA的Buffer中构成；B组分由DOPE和DOTAP合成的脂质体以0.5-5mg/ml的浓度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸馏水中构成，使用前将组分A和组分B以1∶1-10的质量比混合即得。
水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂的制备方法：(1)水泡口炎病毒M蛋白基因的获得：用Indiana株VSV感染BHK-21细胞，24小时后收集细胞，提取细胞总RNA作为逆转录-聚合酶链式反应即RT-PCR的模板，设计并合成相应的引物，通过RT-PCR扩增得到水泡口炎病毒M蛋白的cDNA，即琼脂糖电泳凝胶上690bp的片段，回收该片段得到水泡口炎病毒M蛋白基因；(2)水泡口炎病毒M蛋白真核表达质粒的构建：将得到的M蛋白基因和真核表达载体进行酶切连接反应，转化大肠杆菌，筛选重组子经酶切、测序鉴定正确后得到水泡口炎病毒M蛋白真核表达质粒；(3)水泡口炎病毒M蛋白体外表达：采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000将M蛋白真核表达质粒转染到COS-7细胞中，转染后48-72h，收集细胞做Western blot鉴定重组质粒的体外表达；以未转染的COS-7细胞作为阴性对照，通过免疫印迹实验证实所构建的水泡口炎病毒M蛋白重组质粒能够在真核细胞中表达M蛋白；(4)M蛋白DNA制剂的制备：组分A：扩增M蛋白真核表达质粒，以GE Healthcare商品化的凝胶纯化质粒，最终将质粒以1-5mg/ml的浓度溶于蒸馏水或者含5-50mmol/l Tris和0.5-5mmol/l EDTA的Buffer中；组分B：以DOPE及DOTAP为主要成分，按照实验室方法制备脂质体，脂质体最终以0.5-5mg/ml的浓度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸馏水中。使用前将组分A和组分B以1∶1-10的质量比混合，并轻轻振荡混匀，静置5-30分钟使用。
本发明生产的DNA制剂直接用于抑制肿瘤的发生、发展和转移，并诱导肿瘤细胞的凋亡，用于抗肿瘤制剂的药物的应用。
本发明的水泡口炎病毒基质蛋白DNA制剂，是由水泡口炎病毒M蛋白组成，利用了M蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的特性，又避免了水泡口炎病毒全病毒可能具有的潜在危险性，以及蛋白制剂直接进入机体被诱导的抗体中和从而失效的可能性，同时DNA制剂进入机体被细胞摄取后又会增强机体的细胞免疫反应，从而发挥了诱导凋亡和机体免疫反应的双重作用，使其抗肿瘤作用进一步增强。
以下是本发明说明书附图的说明：
图1：已知的VSV病毒的形态、结构及基因组示意图
图2：已知的水泡口炎病毒M蛋白的核酸序列及编码的相应的蛋白序列。
图3：PCR得到的水泡口炎病毒M蛋白cDNA，经琼脂糖凝胶电泳后的照片。
图4：使用的真核表达载体pcDNA3.1的示意图。
图5：水泡口炎病毒M蛋白重组质粒pcDNA3.1-M的示意图。
图6：重组质粒pcDNA3.1-M在哺乳动物细胞COS-7中RNA水平的瞬时表达情况：
M：marker；
1：未转染pcDNA3.1-M的COS-7细胞G418抗性基因；
2：转染了pcDNA3.1-M的COS-7细胞G418抗性基因；
3：未转染pcDNA3.1-M的COS-7细胞M基因；
4：转染pcDNA3.1-M的COS-7细胞M基因；
图7：显示重组质粒pcDNA3.1-M在哺乳动物COS-7细胞中蛋白水平的瞬时表达情况：
1.转染pcDNA3.1-M的COS-7细胞
2.转染pcDNA3.1空载的COS-7细胞
图8：显示脂质体水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂瘤内注射抗肿瘤治疗效应：
横坐标表示治疗时间(天数)，纵坐标表示肿瘤体积(mm3)或生存率(％)
a和b LL/2c小鼠Lewis肺癌细胞；
c和d MethA纤维肉瘤细胞；
e和f CT26小鼠结肠癌细胞；
各组小鼠n＝10，扪及皮下长出肿瘤结节(约7天)后开始瘤内注射脂质体质粒复合物p-m(△)、e-p(▲)、单独脂质体(○)、生理盐水(●)，a、c、d反映肿瘤生长情况；e、f、g反映荷瘤小鼠生存情况
图9是大鼠胶质瘤模型静脉内注射M蛋白DNA制剂治疗后的磁共振扫描图谱
A为Lip-MP，B为Lip-Null组，C为Saline组，横坐标表示治疗时间。
图10是大鼠胶质瘤模型静脉内注射M蛋白DNA制剂治疗后肿瘤体积和生存时间
A-治疗组肿瘤体积明显小于对照组，B-治疗组平均生存时间较对照组延长
图11是M蛋白DNA制剂静脉注射治疗CT26结肠癌肺转移模型后取肺脏在解剖显微镜下观察到的肺形态，显示治疗组肺转移结节数明显少于对照组。
图12是显示水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂对小鼠肿瘤细胞的凋亡作用
a未处理组；b脂质体单独处理组；c空载体转染组；d水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂转染组；
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.应用水泡口炎病毒M蛋白基因，产生诱导细胞凋亡的作用；
2.可以用于多种肿瘤，如肺癌、纤维肉瘤、结肠癌、胶质瘤等的治疗；
3.可以抑制多种肿瘤的生长和转移，延长荷瘤小鼠和大鼠的生存期，延长时间分别为50％以上和30％以上；
4.可以产生放疗增敏作用，增强了肿瘤细胞对放疗的敏感性，放疗与M蛋白DNA制剂联合使用有效率提高了30％以上；
5.利用了病毒蛋白能够诱导细胞凋亡的优点，但相对于活病毒又具有更高的生物安全性；不用担心会引起人类疾病，更不用担心在自然界的播散流行。
6.由于核酸的性质与蛋白质的性质差别很大，所以质粒纯化相比较于蛋白纯化和病毒纯化要简单快捷得多，并且更加容易大量扩增，因此该制剂的制备相对简单快捷，成本相对低廉，如制备1mg的质粒其成本还不到制备1mg蛋白的成本的1/10，时间可节约1/3到1/2。
具体实施方案 本发明以下将结合实施例和说明书附图作进一步详述：
实施例1.水泡口炎病毒M蛋白基因的获得：
用Indiana株VSV感染BHK-21细胞，24小时后收集细胞，提取细胞总RNA作为逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的模板，设计并合成相应的引物(上游引物：5′-CGC GGA TCC ATC ATG AGT TCC TTA AAG AAG-3′，设计引入了BamH1酶切位点；下游引物：5′-CGG AAT TCT CAT TTG AAG TGG CTG ATA GAA TCC-3′，设计引入了EcoR1酶切位点)，RT-PCR扩增得到水泡口炎病毒基质蛋白的cDNA，得到的片段与预期的片段一致(690bp)(如图2、3)，胶回收该片段，得到M蛋白基因。
实施例2.水泡口炎病毒M蛋白真核表达质粒的构建1：
BamHI和EcoRI双酶切真核表达载体pcDNA3.1(+)(图4)，琼脂糖凝胶电泳回收相应大小的线性化的pcDNA3.1(+)，与用相同酶切并胶回收的M蛋白cDNA于16℃水浴进行连接反应16小时，转化大肠杆菌细胞，提取质粒，经酶切、PCR、测序鉴定后得到重组水泡口炎病毒基质蛋白真核表达质粒pcDNA-M(图5)，其碱基和氨基酸序列与文献报道序列一致。
实施例3.水泡口炎病毒M蛋白真核表达质粒的构建2：
BamHI和EcoRI双酶切真核表达载体pVax1，琼脂糖凝胶电泳回收相应大小的线性化的pVax1，与用相同酶切并胶回收的M蛋白cDNA于16℃水浴进行连接反应16小时，转化大肠杆菌细胞，提取质粒，经酶切、PCR、测序鉴定后得到重组水泡口炎病毒基质蛋白真核表达质粒pVax-M。
实施例4.M蛋白体外表达：
采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染COS-7细胞，转染后48-72h，收集细胞做PT-PCR及Western blot鉴定重组质粒的体外表达。按Invitrogen公司操作说明提取细胞总RNA，RT-PCR按照TaKaRa公司操作说明进行，反应结束后将反应产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳上鉴定，以未转染的COS-7细胞中提取的RNA作为阴性对照(图6)。通过免疫印迹实验鉴定pcDNA-M转染COS-7细胞后M蛋白的瞬时表达(图7)，表明所构建的重组水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂可以在真核细胞中表达M蛋白。也可使用实施例3得到的重组水泡口炎病毒基质蛋白真核表达质粒pVax-M，按本实施例做M蛋白体外表达。
实施例5.一种M蛋白DNA制剂的制备：
组分A：扩增M蛋白真核表达质粒pcDNA-M，以GE Healthcare商品化的凝胶纯化质粒，最终将质粒以5mg/ml的浓度溶于蒸馏水或者含5mmol/l Tris和0.5mmol/l EDTA的Buffer中；组分B：以DOPE及DOTAP为主要成分，按照实验室方法制备脂质体，脂质体最终以5mg/ml的浓度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸馏水中。使用前将组分A和组分B以1∶10的质量比混合，并轻轻振荡混匀，静置5分钟使用。
实施例6.一种M蛋白DNA制剂的制备：
组分A：扩增M蛋白真核表达质粒pVax-M，以GE Healthcare商品化的凝胶纯化质粒，最终将质粒以0.5mg/ml的浓度溶于蒸馏水或者含50mmol/l Tris和5mmol/l EDTA的Buffer中；组分B：以DOPE及DOTAP为主要成分，按照实验室方法制备脂质体，脂质体最终以0.5mg/ml的浓度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸馏水中。使用前将组分A和组分B以1∶1的质量比混合，并轻轻振荡混匀，静置30分钟使用。
实施例7.一种M蛋白DNA制剂的制备：
本制剂由两个组分构成，组分A：大量扩增pcDNA-M，以GE Healthcare商品化的质粒纯化凝胶和方法纯化该质粒，最终将质粒以1mg/ml的浓度溶于含＝10m mol/l Tris和1mmol/l EDTA的Buffer中；组分B：以DOPE及DOTAP为主要成分，按照实验室方法制备脂质体，脂质体最终以2mg/ml的浓度溶于10％的左旋葡萄糖溶液中。使用前将组分A和组分B以1∶5的质量比混合，并轻轻振荡混匀，静置十分钟使用。
以下的所有实施例都是用此DNA制剂进行抗肿瘤治疗。也可参照下述实施例8-12的方法使用实施例5、6制备的M蛋白DNA制剂进行类似的抗肿瘤实验。
实施例8.M蛋白DNA制剂瘤内注射抗肿瘤：
每一种模型分别采用6～8周龄、18-24g的雌性小鼠。小鼠纤维肉瘤(MethA)和小鼠结肠腺癌(CT26)采用BALB/c小鼠，小鼠Lewis肺癌(LL/2c)采用C57BL/6小鼠。分别将MethA、CT26、LL/2c细胞接种到小鼠右侧胁皮下，每只接种1×106个细胞(0.1ml)。
接种肿瘤细胞后第7天，当扪及肿瘤直径约4～5mm时，将荷瘤小鼠随机分为A、B、C、D 4组，每组10只；A组：质粒p-m与脂质体复合物组每只小鼠瘤内注射50μg质粒和250μg脂质体(100μl)；B组：空质粒(p-e)与脂质体复合物组每只小鼠瘤内注射50μg质粒和250μg脂质体(100μl)；C组：单纯脂质体组每组注射250g脂质体(100μl)；D组：生理盐水组每只小鼠瘤内注射生理盐水100μl/次，每3天注射一次，连续注射6次。结果显示，在MethA、CT26和LL/2c肿瘤模型中均产生了明显的抗肿瘤效应，从接种肿瘤第14天(即治疗开始后7天)开始，A组小鼠(M组)肿瘤的生长明显较其它各组为慢，结果具有统计学意义(P＜0.01)(图8a-c-e)；治疗组小鼠的平均生存期也明显长于对照组，结果具有统计学意义(P＜0.05)(图8b-d-f)；在接种肿瘤后第30天时，治疗组与对照组的肿瘤体积差异显著，CT26肿瘤模型中抑瘤率为82.9％，LL/2肿瘤模型中抑瘤率为87％，而在MethA模型中A组小鼠肿瘤完全消退，其它各组之间无显著性差异。
实施例9：M蛋白DNA制剂静脉内注射抗肿瘤：
1.选择4-6周雄性SD大鼠(体重约200g)15只，随机分成3组：M蛋白DNA制剂治疗组(Lip-MP)5只，空质粒对照组(Lip-Null)5只，生理盐水对照组(Saline)5只。
2.构建大鼠脑胶质瘤模型，采用野生型C6细胞脑内注射，方法如下：将实验组大鼠固定于立体定向手术头架，切开头皮，暴露颅骨矢状缝与冠状缝，于前囟点前1mm，右侧3mm处颅骨上钻一小孔，使用微量注射器经钻孔处穿刺入脑皮质下5mm，将C6细胞(106/10μl)缓慢(约2分钟)注入脑实质中。
3.建模后10天开始治疗，Lip-MP组经尾静脉注射脂质体包裹的M蛋白质粒150μg，隔三天注射一次，共6次。对应的Lip-Null组注射脂质体包裹的pcDNA3.1(+)空质粒150μg，Saline组注射生理盐水200μl。
4.肿瘤细胞种植术后10天、17天、24天使用Gd增强的磁共振扫描检测肿瘤生长情况，可见术后24天，Lip-MP组肿瘤明显小于Lip-Null组与Saline组。Lip-MP组平均生存时间较Lip-null组与Saline组约延长11天。(图9、图10)
实施例10：M蛋白DNA制剂的放疗增敏作用：
每一种模型分别采用6-8周龄、20g左右的雌性小鼠。小鼠Lewis肺癌(LL2)采用C57BL/6小鼠，小鼠MethA纤维肉瘤采用BALB/c小鼠。分别将LL2和Meth A细胞接种到小鼠右侧后大腿皮下，肿瘤体积达300mm3左右开始处理。
将小鼠随机分为瘤内注射和尾静脉注射组，每组30只，每组再分为6组，每组5只。6组小鼠分别予以未处理、Lip-null、Lip-MP、放射治疗、Lip-null加放射治疗和Lip-MP加放射治疗处理，每种动物模型的瘤内注射组和尾静脉注射组的未处理组相同、放射治疗组也相同，瘤内注射Lip-null、Lip-MP分别为DNA50μg、DNA50μg，尾静脉注射Lip-null、Lip-MP分别为DNA30μg、DNA30μg，两种注射均于第0、3、6、9进行。
放射治疗于第2、3、4、5、6天进行，将未麻醉的小鼠固定于特制的木板上，将肿瘤中心置于由特制的铅模所形成的直径为3cm的照射野中央，并在肿瘤表面覆盖一补偿物，以提高建成区，SSD＝100cm，放射治疗剂量为Lewis肺癌(LL2)小鼠DT＝5GY/天/次，Meth A纤维肉瘤小鼠DT＝4GY/天/次。
对Lewis肺癌C57BL/6小鼠肿瘤模型和Meth A纤维肉瘤BALB/c小鼠肿瘤模型经处理后的肿瘤体积进行分析，结果Lip-MP和放射治疗能够产生协同的抗肿瘤效应。在Lewis肺癌C57BL/6小鼠肿瘤模型中，开始处理后18天时，放射治疗组的肿瘤体积相对未处理组的肿瘤体积减小了37.2％，依此类推，Lip-MP处理组相对未处理组的肿瘤体积减小了27％(瘤内注射组)和34.1％(尾静脉注射组)，如果Lip-MP和放射治疗能够产生相加的抗肿瘤效应，预期减小的肿瘤体积为未处理组的肿瘤体积的54.1％(瘤内注射组)和58.6％.(尾静脉注射组)，但实际减小的肿瘤体积百分比为89.1％和92.9％，明显高于相加的抗肿瘤效应的预期值，生存期也得到明显延长；在Meth A纤维肉瘤BALB/c小鼠肿瘤模型中我们观察到了相似的结果(表1、2)
表1 Lip-MP和放射治疗产生了协同的抗肿瘤效应。
| 肿瘤 | Lip-MP | 相对未处理组的肿瘤体积减小的百分比 | ||
| 放疗 | 联合(预期) | 联合(实际) | ||
| LL2(A)LL2(B)Meth A(A)Meth A(B) | 0.2700.3410.2540.329 | 0.3720.3720.2880.288 | 0.5410.5860.4680.522 | 0.8910.9290.6780.749 |
表中：A：瘤内注射组 B：尾静脉注射
表2显示在Lewis肺癌C57BL/6小鼠肿瘤模型和Meth A纤维肉瘤BALB/c小鼠肿瘤模型中，瘤内注射组和尾静脉注射组的Lip-MP加放射治疗组的肿瘤生长延迟情况。
| 肿瘤 | 未处理a | 肿瘤生长延迟时间(天) | ||
| Lip-MP | 放疗 | Lip-MP+放疗 | ||
| LL2(A)LL2(B)Meth A(A)Meth A(B) | 6.8±1.56.3±1.88.3±1.88.0±2.1 | 1.4±0.32.5±0.62.3±0.72.7±0.6 | 3.4±0.83.8±0.95.2±1.46.1±1.3 | 14.5±3.817.2±4.213.4±3.617.2±5.6 |
表中：A：瘤内注射组 B：尾静脉注射组。a：未处理组肿瘤体积达1000mm3的时间。
实施例11：M蛋白DNA制剂抑制肿瘤转移作用：
小鼠纤维肉瘤和小鼠结肠腺癌(CT26)采用BALB/c小鼠模型，分别采用6～8周龄、18-24g的雌性小鼠。尾静脉注射5×105CT26细胞。3天后将小鼠分为三组，分别为生理盐水(200ul生理盐水/次)、脂质体包裹空载体组(200ulLip-null(50mg DNA)/次)、脂质体包裹M蛋白DNA疫苗组(200ul Lip-MP(50mgDNA)/次)。接种肿瘤细胞后第3天开始进行静脉注射治疗，每2天治疗1次，共6次。
结果在肺转移动物模型中肺表面肿瘤结节计数，证实动物静脉递送的脂质体包裹的M蛋白制剂抑制减少了肺表面结节的形成(图11)，实验组平均结节数为60±19，Lip-null组为104±20，生理盐水组为137±22(P＜0.05)。
实施例12：M蛋白DNA制剂诱导肿瘤细胞凋亡的作用：
LL/2c、CT26分别用10％血清DMEM和1640培养基培养，当细胞融合达60％-80％，用胰酶消化细胞，计数后接种六孔板，每孔接种1-2×105，放入二氧化碳孵箱培养16-24h，观察细胞生长情况当细胞密度达70-80％融合时，用脂质体转染细胞，转染细胞分为4组：pcDNA3.1-M组、pcDNA3.1空载体组、单纯脂质体组和未处理组，另外设pcDNA3.1-GFP作为对照，以观察转染效率(图12)。
PI染色进行流式细胞术样品准备
1)细胞处理后48-72h，收集细胞(1～5)×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2)3ml PBS洗一次。
3)离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4)离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。
5)400目的筛网过滤1次；500～1000r/min离心5min，弃去PBS。
6)用1ml PI染液，4℃避光30min。
7)流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析PI荧光的直方图，定量观察104个细胞中亚G1期细胞所占比例。
结果M蛋白质粒处理细胞后出现了明显的细胞病变，MTT也观察到细胞生长抑制，流式细胞检测定量观察104个细胞中亚G1期细胞所占比例(图10)，G1期细胞所占比例明显高于其他三组。
Claims (3)
1.一种水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂，其特征在于：由组分A和组分B组成，组分A是由表达M蛋白的真核质粒以1-5mg/ml的浓度溶于蒸馏水或者含5-50mmol/l Tris和0.5-5mmol/l EDTA的Buffer中构成；B组分由DOPE和DOTAP合成的脂质体以0.5-5mg/ml的浓度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸馏水中构成，使用前将组分A和组分B以1∶1-10的质量比混合即得。
2.根据权利要求1所述的水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂的制备方法，其特征在于：
(1)水泡口炎病毒M蛋白基因的获得：用Indiana株VSV感染BHK-21细胞，24小时后收集细胞，提取细胞总RNA作为逆转录-聚合酶链式反应即RT-PCR的模板，设计并合成相应的引物，通过RT-PCR扩增得到水泡口炎病毒M蛋白的cDNA，即琼脂糖电泳凝胶上690bp的片段，回收该片段得到水泡口炎病毒M蛋白基因；
(2)水泡口炎病毒M蛋白真核表达质粒的构建：将得到的M蛋白基因和真核表达载体进行酶切连接反应，转化大肠杆菌，筛选重组子经酶切、测序鉴定正确后得到水泡口炎病毒M蛋白真核表达质粒；
(3)水泡口炎病毒M蛋白体外表达：采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000将M蛋白真核表达质粒转染到COS-7细胞中，转染后48-72h，收集细胞做Western blot鉴定重组质粒的体外表达；以未转染的COS-7细胞作为阴性对照，通过免疫印迹实验证实所构建的水泡口炎病毒M蛋白重组质粒能够在真核细胞中表达M蛋白；
(4)M蛋白DNA制剂的制备：组分A：扩增M蛋白真核表达质粒，以GE Healthcare商品化的凝胶纯化质粒，最终将质粒以1-5mg/ml的浓度溶于蒸馏水或者含5-50mmol/l Tris和0.5-5mmol/l EDTA的Buffer中；组分B：以DOPE及DOTAP为主要成分，按照实验室方法制备脂质体，脂质体最终以0.5-5mg/ml的浓度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸馏水中。使用前将组分A和组分B以1∶1-10的质量比混合，并轻轻振荡混匀，静置5-30分钟使用。
3.根据权利要求1和2所述的水泡口炎病毒M蛋白DNA制剂的应用，其特征在于：生产直接用于抑制肿瘤的发生、发展和转移，并诱导肿瘤细胞的凋亡，用于抗肿瘤制剂的药物的应用。
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