CN1956739A - 用福尔马林和紫外线处理来灭活样品中的病原体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用有效浓度的福尔马林处理含病毒的样品及在流经设备中用有效剂量的紫外线处理样品以灭活样品中病毒的方法。

Description

用福尔马林和紫外线处理来灭活样品中的病原体
技术领域
本发明涉及一种用有效浓度的福尔马林处理含病毒的样品及在流经设备中用有效剂量的紫外线处理样品以灭活病毒的方法。
背景技术
医学产品中病菌的有效灭活关系到公众健康因为已经发现先前不知道的疾病能通过治疗经营迅速传播。因此，在越来越严格的标准下出现生物技术产品，通过使用其来降低输送试剂的风险。潜在污染物不仅是血液产品制造中的问题，也是安全疫苗生产中的问题。
抗病菌疫苗特别是病毒疫苗的生产中最危险的步骤之一是病毒的灭活。在病毒灭活的情况中，福尔马林是疫苗生产中最常使用的灭活试剂。福尔马林灭活步骤用确定的分析程序确认。但是，高度严格的质量控制检验的采用，例如哺乳动物细胞培养检验，例如非洲绿猴肾细胞株系安全性检验，证实有时有残留的污染性。为了消除这种残留的污染性，整体的机械破坏和/或过滤是不成功的。
已经考虑紫外线灭活作为福尔马林处理的替代并入制造过程中。紫外线照射灭活用于人类疫苗以前已被证实。Milzer et al.(Am.J.Pub.Health(1954)44：26-33)和Wolf et al.(JAMA(1956)161：775-81)已经报导在人上使用紫外线灭活的急性骨髓灰白质炎疫苗的研究的免疫结果。脊髓灰质炎病毒是无核膜的小核糖核酸病毒，单个节段中有一正单链RNA基因组。脊髓灰质炎病毒壳蛋白的情况中，因为病毒的基因组比病毒的表面抗原更易受到紫外线的损害，所以显示紫外线灭活对产品的生化特性或免疫性有少许负面影响。紫外线灭活的目标主要是核酸和福尔马林的目标是蛋白形成对比。科学家通过将福尔马林和紫外线灭活结合设法克服灭活特别反弹的脊髓灰质炎病毒时分别单独紫外线灭活或单独福尔马林灭活的局限性。参见，例如，McLean，et al.“脊髓灰质炎病毒疫苗生产中的实验”Prog，Med.Virol.，卷1，第122-164页(1958.)。
紫外线照射技术广泛应用于食品，药物，化妆品，和饮料工业，和饮用水。紫外线消毒是一个物理化学的过程，其中紫外线波长照射的激发能量裂解嘌呤碱基和嘧啶碱基环状分子的共价键，损害核酸及它们编码的基因信息。微生物如细菌和酵母等及病毒暴露于有效的UVC(100至280nm)照射下，几秒内被灭活。因此，成功的消毒依赖于等价减少照射的剂量。在照射区用生物剂量计测量以J/m2表示的平均杀菌照射剂量。但是，单独的紫外线灭活不适合生产安全有效的疫苗。
Taylor et al.(J.Immunol.(1957)79：265-75)描述了结合福尔马林和紫外线照射灭活急性骨髓灰白质炎病毒。Molner et al.(Am.J.PubHealth(1958)48：590-8)描述了用紫外线照射及福尔马林灭活的polyomyelitis疫苗接种的受试者的血液中循环抗体测量水平的形成。Truffelli et al.(Appl.Microbiol.(1967)15：516-27)报导了由福尔马林，紫外线和β-丙内酯组成的三步灭活法在大颊鼠类上灭活腺病毒和猿病毒40致瘤性。Miyamae(Microbiol.Immunol.(1986)30：213-23)描述了通过紫外线和福尔马林的处理制备仙台病毒的免疫原。上述观念没有一个被采纳于疫苗生产中常规使用，尽管在工业水平的安全有效疫苗的生产有一个长期存在的需要。另外，所引用的研究中没有一个作如目前研究中所用的非洲绿猴肾细胞株系安全性检验一样灵敏的安全性检验来测定“失活病毒”残留的传染性。
令人惊讶地，发明者发现福尔马林和紫外线灭活步骤的结合能用于在高容量生产量系统的大批量病毒生产中完全灭活病毒以为了工业水平制造失活病毒用于疫苗制备。这也在实施例所用的高滴定度浓缩的病毒制备中显示了，其中用非常灵敏的非洲绿猴肾细胞株系细胞培养检验没有测到残留的病毒活性。发明者还惊讶地证明了与无核膜的病毒如脊髓灰质炎小RNA病毒相比，此方法对有核膜的病毒如粘病毒特别有效。此发现对用于新兴并快速变化的病毒疾病如流行病爆发间期和流行病期间的流行性感冒菌株的安全并高度免疫的疫苗的快速生产有重要寓意。
发明概述
本发明的目的是提供一种允许高度有效而安全地灭活样品中所含的病毒同时保留失活病毒的高度抗原性及免疫原性的方法。特别地，本发明的方法在高体积同量系统中联合利用福尔马林灭活步骤和紫外线灭活步骤以生产大批量的用于疫苗制备的高抗原量并安全的病毒。
发明详述
根据本发明的一个方面，通过提供一种灭活样品所含病毒的方法来达到目的，方法包括步骤(i)用有效浓度的福尔马林处理样品，和(ii)在流经设备中使样品接受有效剂量的紫外线，其中步骤(i)在步骤(ii)之前进行或反之亦然。优选，样品通过设备的流速为约50升/小时至约1000升/小时。
将病毒灭活至失活方法的另一个优选方面分别是包膜病毒或包膜RNA病毒，有核膜的病毒或有核膜的RNA病毒分别完全灭活。
根据另一方面，提供了一种灭活样品所含病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用有效浓度的福尔马林处理样品，和(ii)在含紫外灯和薄层室的流经设备中使样品接受有效剂量的紫外线，设备充分垂直于紫外灯的直径，其中步骤(i)在步骤(ii)之前进行或反之亦然，其中步骤(ii)中的样品经过设备中的薄层室。
本发明的一个优选实施方案中，样品在有效浓度的福尔马林处理后，在流经设备中用有效剂量的紫外线处理。尽管发明者不被任何理论束缚，但是想到福尔马林对病毒表面分子上的交联作用稳定了病毒，用于紫外线灭活流经设备的高体积流动动力学的严密。
根据本发明的灭活方法有效而安全，因为在实施例2和4(A)中已证明。此外，如实施例4(B)所示灭活方法允许生产具有高度抗原性和免疫原性，其引起了保护性的免疫应答。
这里所用的术语“样品”包括任何含有病菌或其部分的样品例如一些流体，如源自用于制备如血液产品或疫苗的生物，医学，或药物产品的细胞培养过程的生物流体或溶液。可以是包括生物流体的样品，例如血液或血浆。也可以是含细胞培养收获组分的流体(例如，培养物的细胞或培养基片断)。在一个优选实施方案中，样品是用于制造治疗试剂的流体，例如生产疫苗，其中失活病毒或其部分是治疗试剂。在特别优选的实施方案中，在灭活方法之前细胞组分从样品中分离，例如通过过滤或离心。
本申请的一个优选实施方案中，从上清液和细胞组成的细胞培养物中收获生产病毒，其进一步用作如疫苗的医学产品的制备。本发明的更优选的实施方案中，所述培养物中细胞用病菌感染。细胞可以是原始细胞或任何适合生产病毒的培养细胞系。可用细胞的例子包括哺乳动物细胞(如中华仓鼠卵巢细胞，仓鼠肾细胞，非洲绿猴肾细胞株系，宫颈癌细胞)，鸟类细胞(如小鸡胚胎纤维原细胞，或来自鸟类的连续细胞系)和昆虫细胞(如Sf9细胞)。本发明的优选实施方案中，在化学(福尔马林)灭活步骤和/或紫外线照射灭活步骤之前，来自大批量病毒的细胞培养生产中的细胞和细胞碎片被从大批量病毒中分离出。
本发明中，将被灭活的病毒是有核膜的或无核膜的DNA或RNA病毒，其具有单链或双链(DNA)基因组，致敏或抗致敏，连续的或分割的。病毒可以选自杆状病毒，痘病毒，腺病毒，乳多泡病毒，细小病毒，嗜肝DNA病毒，冠状病毒，黄病毒，外衣病毒，星状病毒，细小的核糖核酸病毒，逆转录酶病毒，粘病毒，丝状病毒，副粘病毒，棒状病毒，沙粒病毒和布尼亚病毒。本发明的优选实施方案中，病毒选自包膜病毒，包括黄病毒，外衣病毒，逆转录酶病毒，冠状病毒，丝状病毒，棒状病毒，布尼亚病毒，粘病毒，副粘病毒，沙粒病毒，嗜肝DNA病毒，疱疹病毒和痘病毒。如实施例6和7所证，与无包膜脊髓灰质炎病毒和腺病毒相比，本发明的灭活方法对包膜病毒如流行性感冒和罗斯河病毒特别有效。本发明的另一优选实施方案中，病毒选自包膜RNA病毒，包括黄病毒，外衣病毒，逆转录酶病毒，冠状病毒，丝状病毒，棒状病毒，布尼亚病毒，粘病毒，副粘病毒和沙粒病毒。一特别优选的实施方案中，病毒选自粘病毒，如流感病毒菌株：流感病毒菌株可以具有hemaglutianin和神经氨酸酶表面蛋白的不同组合。另一特别优选实施方案中，病毒选自外衣病毒，例如α病毒，如罗斯河病毒(RRV)。另一组优选用作大批量病毒溶液的病毒冠状病毒，包括与严重急性呼吸综合病症(SARS)有关的病毒。另一组优选病毒是黄病毒，包括日本脑炎，虱传脑炎(TBE)，登革热发热病毒，黄热病病毒和出血性发热病毒。另一病毒优选是痘病毒，包括正痘病毒(如牛痘或变更牛痘安卡拉病毒)和禽痘病毒。
本发明还包括失活病毒病原体的部分。本申请的一个优选实施方案中，所述部分可以作为免疫原的抗原决定部位。此抗原决定部位可以用于引起对抗病菌的免疫反应。本申请一个优选实施方案中，病菌的部分用作对抗病菌的疫苗。一个特别优选的实施方案中，病菌的所述部分是断裂病毒，其可在分裂前后被灭活。
本发明中，当用根据本发明的灭活方法生产的失活病毒通过哺乳动物细胞培养检验如实施例2详述的安全性检验时，本方法被认为是安全的，或完全灭活的。这些检验被证明比其他所用检验如蛋检验更灵敏。优选的安全性检验通过/不合格的标准如实施例1和2所述。
本申请一个优选实施方案中，因为样品中病毒失活的病毒滴定度减少是至少约1×105，在一个更优选的实施方案中至少约1×107，在一个更优选的实施方案中至少约1×1010，在一个最优选的实施方案中至少约1×1014。
本发明一个优选实施方案中，用有效浓度的福尔马林处理样品约12至约96小时。在一个更优选的实施方案中，用有效浓度的福尔马林处理样品约24至约48小时，更优选约24至约30小时。
本发明一个特别优选实施方案中，用有效浓度的福尔马林处理样品约24至约24.5小时。
一个进一步的实施方案中，用有效浓度的福尔马林处理样品的步骤在约10至约40℃进行。本申请一个特别优选实施方案中，用有效浓度的福尔马林处理样品的步骤在约32℃进行。
本发明一个优选实施方案包括用有效浓度的福尔马林处理样品，其中福尔马林的有效浓度范围优选约0.01％至约1％(w/w)之间，优选约0.01％至约0.1％之间，更优选约0.025％至约0.1％当用37％福尔马林溶液调整有效浓度时其分别对应约92mg/l和约368mg/l福尔马林。
本申请中，术语“紫外线”意指波长100至400nm的紫外线照射。紫外线可以选自UVC(100至280nm)，UVB(280至320nm)，UVA(320至400nm)。光敏剂如那些插入DNA并通过紫外线失活，举例来说补骨脂素，可以用于增强紫外线照射的灭活效果。本发明一个优选实施方案中，紫外线是约100至约280nm波长的UVC。本发明一个更优选实施方案中，紫外线波长介于约240至约290nm之间。本发明一个特别优选实施方案中，约85％或更多的紫外线波长约254nm。
紫外线发射可以是紫外线发射的连续形式，如水银灯技术，或脉冲紫外线，如单频激光技术。所要的紫外线强度可以是通过联合两个或多个灯产生。一个优选实施方案中，紫外线通过约110W的灯连续发射。实施例所举例的优选实施方案中，紫外灯长约1米，如实施例所用的灯长(950mm)。
本发明的主题包括紫外线的任何有效剂量，也就是当如前所述与福尔马林处理联用时任何紫外线安全灭活特定病毒的剂量。有效剂量可以依赖于领域中普遍知道的多种因素，举例来说，紫外线灭活室的物理参数例如灯和室的大小和直径，含培养基病毒与紫外线源之间的距离，室材料的光吸收和反射性质。出于同样原因，UVC光的波长和强度及病毒暴露于紫外线下的接触时间也定为有效剂量。此外，有效剂量也受病毒本身，含病毒的培养基和它们的光吸收性质影响。优选，有效剂量足至杀死至少99.99％的样品所含病毒，更优选灭活病毒至哺乳动物细胞培养检验，优选根据实施例2的检验，测不到活性病毒的水平，或完全灭活。一个优选实施方案中，用UVC光，含病毒的样品暴露于范围在约5至约200mJ/cm2之间的有效剂量。一个优选实施方案中，有效剂量范围在约20至约100mJ/cm2之间，另一个优选实施方案中，有效剂量范围在约40至约90mJ/cm2之间。作为一个对照，杀死饮用水中99.99％病菌的有效剂量是约≥40mJ/cm2。一个优选实施方案中，有效剂量减少了初始病毒滴定度的1×105。在大批量疫苗灭活中，有效剂量应是足至消除初始化学(福尔马林)灭活步骤之后可能存在的任何残留活性病毒。如实施例所述，这可以通过非常灵敏的哺乳动物细胞培养感染检验如所述的非洲绿猴肾细胞株系细胞培养检验来测定。
实施例提供了本发明的进一步优选的实施方案和特别的紫外线室。
本发明一个进一步优选的实施方案，样品与紫外线接触时间范围在约1至约20秒之间，优选约1.4至14秒之间。接触时间优选根据样品沿着光源切线约1mm厚和约110W紫外灯的瓦特数来计算。因为现有技术中一个技巧，样品深度越厚和光源能量(瓦特数)越小，将提高暴露时间，反之亦然。本发明一个更优选的实施方案中，样品与紫外线接触时间是约1.4至约7秒，本申请一个特别优选的实施方案中，样品与紫外线接触时间是约2.8至约4.2秒。
为了检验用了特定的有效紫外线剂量的本发明方法的特定安排是否根据本发明灭活病菌，应检验失活病毒的残留病毒活性。这可以通过使用哺乳动物细胞培养检验来实现，例如优选应用实施例1和2所述标准的非洲绿猴肾细胞株系安全性检验。
根据本发明，用有效剂量的紫外线处理样品在流经设备中进行，优选表1和图1所列的。
本发明一个优选实施方案中，流经设备含有薄层室。室的最小厚度应允许大批量病毒溶液充分流动以合理的迅速处理，和为了全部的失活病毒疫苗防止病毒的分裂。因而，为了生产全部失活的病毒，薄层优选至少约0.1mm厚。也因为大批量病毒溶液吸收紫外线照射和需要保证充分照射溶液中所有病毒，最大厚度不应允许任何病毒不经充分照射就通过设备。因而，薄层不应超过约1cm厚度。薄层优选厚度在0.5mm至3mm之间，更优选约1mm以便紫外灯和将被灭活病菌之间的最大距离小于约1mm。作为选择，样品可以平行于灯的长度经过灯，以便样品被从样品室的外直径照射，胜于内直径。同样地，在含一个灯(或循环灯)的样品室中的灯可被用作从内外直径照射样品室的构造。另外，室优选设计成通过室的样品流动不是严格的薄层状，而宁可是混浊的。这将帮助混合样品媒介中的病毒，保证恰好暴露于紫外线照射下。
本申请另一个优选实施方案中，流经设备含有紫外线灭活室，其中紫外灯直径约30mm以及样品流经的包围紫外灯的室直径约32mm。本申请一个优选实施方案中，室总体积约92ml。
将被照射的样品能通过设备。一个优选实施方案中，当经过紫外线照射室时，样品被冷却。本申请一个进一步优选的实施方案中，经过紫外线照射室的样品温度约2至约32℃，更优选约2至约8℃。
流经设备中样品流速优选范围在约50至约1000升/小时之间，更优选约230至约480升。一个特别优选的实施方案中，流经设备中样品流速范围在约230至约250升/小时之间，更优选约240升/小时。实施例所示的这些优选流速考虑到节约大批量病毒溶液的大量紫外线处理。
一个优选实施方案中，接触时间依赖于样品暴露于紫外线照射下的样品室的长度和样品通过室的流速。因而，能通过增加流经设备中紫外灯数目和增加暴露于紫外线照射下的样品室的有效长度来简单调整有效剂量。作为选择，用同样数目的更长的灯-室将增加有效剂量，与此同时使用更多数目的更短的灯-室可以等同于相同的有效剂量。
本申请一个进一步优选的实施方案中，在流经设备中用有效剂量的紫外线处理样品的步骤以循环或连续方式重复。可以重复约2至约10次。本申请一个优选的实施方案中，在流经设备中用有效剂量的紫外线处理样品的步骤重复约2至约5次，本申请一个更优选的实施方案中，它重复约2至约3次。连续使用多个灯室或再次流经同样的灯的另一个益处是样品可以在室之间或循环中更彻底地混合以保证病毒恰好暴露于紫外线照射下。
样品中病毒被灭活后，失活病毒可以再被纯化用于多种应用中，包括疫苗和其他药物组合物。根据本发明另一个优选实施方案，灭活方法进一步包括纯化样品中失活病毒至药物纯度的步骤和将纯化病毒合成药物组合物用作疫苗。纯化可以通过现有技术中已知的方法完成，包括，但不局限于，过滤或渗滤，色谱法(如，大小排阻层析，离子交换，免疫亲和层析，和类似方法)或离心。作为选择，病毒可以在被本发明方法灭活之前被纯化。
根据本发明另一个优选实施方案，灭活方法进一步包括纯化步骤，也就是将样品进行纯化步骤以除去样品中残留的福尔马林。如果残留福尔马林的水平高于药物可接受的水平，这样的纯化是有用的。在可选的纯化步骤后，失活病毒可再被合成药物组合物。配方可选择包括载体(如生理盐水或缓冲液)，赋形剂，稳定剂(如清蛋白，糖类和/或氨基酸)，盐，和/或辅料(如明矾)。作为选择，失活病毒可以进一步变化为药物用途，如密封在脂质体中。
本发明在以下实施例中进一步被阐明，不局限于实施例。在发明被详细描述后，没有超出所附权利要求书所定义的发明范畴的改进和变化显然是可能的。
附图
图1显示可用于本发明紫外线灭活步骤的紫外线薄层室。
图2显示装有紫外线传感器的紫外线灭活系统。紫外线传感器和流量计是可选零件。本申请一个进一步的实施方案中，泵和/或流量计可被安装在出口管上。
图3显示应用了数个为让样品在流经设备中重复接受有效剂量紫外线的互相连接的紫外线薄层室的紫外线灭活系统。紫外线薄层室的数目可在约2至约10之间变化。紫外线传感器和流量计是可选零件。本申请一个进一步的实施方案中，泵和/或流量计可被安装在出口管上。具有连续连接灭活室的连续紫外线发生器可在大量制造过程中使用，因而允许样品的高吞吐量。
实施例
实施例1：标准蛋安全性检验的原理
标准蛋安全性检验用于检验失活流感菌株的残留感染性。单抗原大批量产品，也就是蔗糖梯度离心及超速渗滤后的纯化病毒抗原，被注射到10个蛋中(0.2ml/个蛋)。在32℃孵育3天后，获得及集中蛋，和再次注射10个蛋(0.2ml/个蛋)。在另一个32℃孵育3天的步骤后，蛋被获得，集中，和被检验红血球凝聚素(HA)。
HA-检验基于流感病毒能用它们的表面蛋白红血球凝聚素凝固红血球的事实。此检验在无菌环境中进行。用确定的HA滴定度的流感病毒悬浮液作为阳性对照，0.9％氯化钠溶液作为阴性对照。50μl用0.9％氯化钠1∶2稀释的将被检验的样品放入96槽盘的一个槽中。每个槽加50μl含小鸡红血球的溶液。随后，盘子在室温下培养30至45分钟。然后目测红血球凝聚，其中如果5个含同样样品的槽不显示任何红血球凝聚，样品就通过HA检验。
实施例2：标准非洲绿猴肾细胞株系安全性检验的原理
标准非洲绿猴肾细胞株系安全性检验是用于失活流感菌株残留感染性的非常严格的质量检验。此检验也应用于其他病毒。单抗原大批量产品，也就是蔗糖梯度离心及超速渗滤后的纯化病毒抗原，被加到5个Roux烧瓶中(4ml/个烧瓶)。在非洲绿猴肾细胞株系培养基中32℃孵育7天后，细胞培养物被获得，集中，和加到5个Roux烧瓶中(10ml/个烧瓶)。在另一个32℃孵育7天的步骤后，细胞培养物被获得，集中，和被检验如实施例1所述的红血球凝聚素(HA)。
实施例3：福尔马林灭活
使用福尔马林灭活的第一个步骤是在无细胞，有感染性的单抗原病毒收获物上进行，也就是澄清离心后的生物反应器收获物。在30至34℃收集后，单抗原病毒收获物用约0.9至约1.1U/ml的Benzonase在30至34℃处理4至8小时。然后用≤92mg/l福尔马林在32±2℃处理24至24.5小时。
实施例4：使用65瓦紫外灯的灭活实验
许多福尔马林灭活过的病毒的灭活实验是用具有65瓦紫外灯和薄层室的灭活室进行的。尽管，当使用100升/小时的流速循环3次时能证明单抗原病毒收获物完全失活，但是此设备不允许即时测量紫外线信号。用于流感产品的非洲绿猴肾细胞株系细胞培养基含有各种吸收紫外线信号的有机化合物。因此，系统装有允许处理单抗原病毒收获物时连续监控紫外线信号的110瓦紫外灯。
实施例5：使用110瓦紫外灯的灭活实验
福尔马林处理过的单抗原巴拿马流感收获物用作灭活研究的模型底物。为了用薄层紫外线技术连续灭活，使用装有VISA灯(110W/4V)的WEDECO VISA系统(德国)。紫外线薄层室是具有30mm直径石英管(比较表1)的不锈钢1.4435装置。一个校准过的紫外线传感器允许即时控制紫外线信号。紫外线薄层室以240±10升/小时的流速室温下运作。流速条件通过校准过的流量计控制(比较表2)。
表1
紫外线灭活室的特征
  紫外灯   110W
  灯长度   950mm
  Φ紫外灯   30mm
  Φ包围紫外灯的室   32mm
  薄层   1mm
  总体积/室   92ml
  接触时间/室   1.4秒
单抗原收获物暴露于10个紫外线循环下。每次循环后，20升的紫外线处理过的单抗原收获物被除去并通过使用没有预澄清器的SorvallCC40离心机(Hitachi Koki Co，LTD.，东京，日本)以20mMTris缓冲液中的超过42％蔗糖梯度和从48％至36％蔗糖获得的确定的纯化单抗原收获物(PMVH)为连续超离心条件的蔗糖梯度纯化来进一步纯化。
表2
福尔马林和紫外线处理过的巴拿马流感的超离心运转的观察
  超离心运转   灭活状况
  UZ-INF-45-03   无紫外线
  UZ-INF-48-03   240l/小时，1次循环
  UZ-INF-52-03   240l/小时，2次循环
  UZ-INF-51-03   240l/小时，3次循环
  UZ-INF-50-03   240l/小时，4次循环
  UZ-INF-49-03   240l/小时，5次循环
  UZ-INF-58-03   240l/小时，7次循环
  UZ-INF-57-03   240l/小时，10次循环
(A)抗原产量和纯度
流感抗原产量和纯度的比较基于红血球凝聚素(HA)含量，总的蛋白和非洲绿猴肾细胞株系-蛋白(宿主细胞蛋白)。纯化病毒的比较基于HA/蛋白之比，宿主细胞蛋白/HA之比和病毒安全性(比较表3)。对于所有紫外线处理过的收获物，未能测到病毒生长。相反，来自标准福尔马林灭活方法(无紫外线照射应用)的纯化病毒能在非洲绿猴肾细胞株系细胞培养中扩大。尽管在7次循环和10次循环后能看到HA/蛋白之比轻微降低，但是关于以HA/蛋白比和宿主细胞蛋白/HA比衡量的抗原纯度，福尔马林灭活和双重灭活的产品未测到显著区别。
表3
福尔马林和紫外线处理后的蔗糖梯度纯化的巴拿马病毒。
0至10次紫外线循环下的HA/蛋白比，宿主细胞蛋白/HA比和安全性的对比。
  紫外线循环次数   接触时间(秒)   HA/蛋白之比   宿主细胞蛋白/HA之比   Vero安全性
  0   0(无紫外线)   0.85   0.04   失败
  1   1.4   1.09   0.04   通过
  2   2.8   0.88   0.04   通过
  3   4.2   0.91   0.04   通过
  5   7.0   0.83   0.04   通过
  7   9.8   0.60   0.02   通过
  10   14   0.58   0.03   通过
进行进一步研究以通过红血球凝聚素抑制(HAI)分析表征紫外线灭活对豚鼠和鼠的抗原性和免疫原性的影响。
(B)抗原性
通过对抗巴拿马特异抗血清的HAI化验分析抗原性。尽管增加的紫外线接触时间导致HA的轻微损失，但是HAI滴定度显示无阴性作用(比较表4)。
表4
福尔马林和紫外线处理后的蔗糖梯度纯化的巴拿马病毒。
基于0至10次紫外线循环下巴拿马特异抗血清的HA和HAI滴定度的抗原性对比。
  紫外线循环次数   接触时间(秒)   HA(μg/ml)  HAI滴定度
  0   0(无紫外线)   211  640
  1   1.4   209  640
  2   2.8   200  640
  3   4.2   196  640
  5   7.0   191  640
  7   9.8   177  640
  10   14   154  640
(C)免疫原性
免疫原性是通过用不同等份的纯化单抗原病毒收获物使豚鼠和鼠免疫随后第一次免疫后的三周激发来分析的。免疫动物的血清在三周和六周后被收集和集中并通过对抗来自蛋和非洲绿猴肾细胞株系的抗原的HAI化验来分析。三周和六周后在豚鼠和小鼠上检验的免疫原性给出了非常有希望的结果，未能看到双重灭活的病毒相对标准福尔马林处理的病毒有显著区别(比较表5)。
表5
福尔马林和紫外线处理(0至10次循环)后的蔗糖梯度纯化的巴拿马病毒。豚鼠和小鼠上检验到的免疫的对比。A)三周后，B)6周后。用来自蛋和非洲绿猴肾细胞株系的流感抗原的HAI。
A
  紫外线循环次数   接触时间(秒)   豚鼠三周后HAI滴定度   小鼠三周后HAI滴定度
  蛋   Vero   蛋   Vero
  0   0(无紫外线)   160   320   320   1280
  1   1.4   160   320   320   1280
  2   2.8   160   640   320   1280
  3   4.2   160   320   320   1280
  5   7.0   160   320   320   1280
  7   9.8   160   320   320   1280
  10   14   160   640   320   1280
  对照   -   40   20   80   80
B
  紫外线循环次数   接触时间(秒)   豚鼠六周后HAI滴定度(激发剂)   小鼠六周后HAI滴定度(激发剂)
  蛋   Vero   蛋   Vero
  0   0(无紫外线)   1280   1280   1280   2560
  1   1.4   1280   2560   640   1280
  2   2.8   1280   1280   640   1280
  3   4.2   640   1280   1280   2560
  5   7.0   1280   2560   1280   2560
  7   9.8   640   1280   1280   2560
  10   14   1280   2560   1280   2560
  对照   -   160   80   160   40
表4和表5总结的结果显示紫外线处理不导致HAI滴定度的显著差别证明产品的抗原性和后来的免疫原性不受影响。
所有双重灭活实验中，总的安全性能恰在1次紫外线处理循环后被证明。实验室的详细研究和最终比例证明紫外线照射步骤与福尔马林处理结合的效果。紫外线处理后的纯化病毒抗原的免疫学特性得出相对从非紫外线未处理产品获得的结果。未能测到病毒产品的生化特征的阴性作用和免疫原性。
实施例6：用福尔马林和/或紫外线灭活的病毒滴定度减少
用不同病毒检验用有效浓度福尔马林和流经设备中的有效浓度紫外线联合处理样品的病毒滴定度减少。福尔马林灭活在32℃以0.025％(w/v)福尔马林终浓度进行24小时。流经设备中的紫外线灭活以240l/小时的流速进行3次循环。每次循环样品与紫外线的接触时间是1.4秒。
表6
用福尔马林和/或紫外线灭活的病毒滴定度减少。
  病毒   病毒类型   所测福尔马林处理后病毒滴定度减少(对数减少)   所测紫外线处理后病毒滴定度减少(对数减少)   所计算的福尔马林和紫外线处理后病毒滴定度减少(对数减少)
  新喀里多尼亚流感   A/H1N1/20/99   ≥7.4   ≥7.3   ≥14.7
  巴拿马流感   A/H3N2/2007/99   ≥8.4   ≥6.7   ≥15.1
  Shangdong流感   B/7/97   ≥6.7   ≥7.2   ≥13.9
  脊髓灰质炎   1型   3.0   4.9   7.9
  腺病毒   5型   3.1   2.5   5.6
结果显示通过福尔马林和紫外线联合处理病毒，获得各自病毒滴定度的急剧降低。
实施例7：罗斯河病毒(RRV)候选疫苗的紫外线灭活
罗斯河病毒(RRV)是蚊子带有的α病毒，其引起人类疾病已知的如流行性多发性关节炎(EPA)。症状包括关节炎，特别在膝盖和手脚的小关节，通常伴随发热，皮疹和其他非特异的体质变化。关节炎症状一般持续30至40周，25％病人发作后一年还有残留症状。这是澳大利亚的地方病，每年超过8000个病例，并遍及太平洋地区。在1979/80年，罗斯河病毒传染的流行病也发生在斐济，萨摩亚群岛，Cook岛和新喀里多尼亚(岛)。当前没有疫苗存在。
(A)无血清微载体基的1200升非洲绿猴肾细胞株系细胞发酵罐培养物的RRV接种和福尔马林灭活
微载体基无血清非洲绿猴肾细胞株系细胞的1200升发酵罐培养物被用罗斯河产品病毒接种。培养物在37℃孵育3天。每天取样品滴定。第3天，当100％细胞被CPE(细胞病理效应)破坏时，收获病毒。从感染的病毒收获物中分离出细胞碎片和微载体和第一次过滤步骤(1.2μm/0.2μm)之后，加入benzonase降解核酸(DNA/RNA)。福尔马林灭活以0.1％(w/v)的福尔马林终浓度进行8天。在2小时和24小时后分别进行第2次和第3次过滤步骤。在第24小时加入Benzonase除去残留的核酸。根据表7，取样品来病毒滴定＝非洲绿猴肾细胞株系细胞的组织培养感染剂量50(TCID50/ml)和C6-36细胞及非洲绿猴肾细胞株系细胞的安全性检验。
1200升发酵罐用RRV接种后一天，对数TCID50/ml5.8的病毒滴定度能被证实，其升至7.8(第2天)，8.1(收获前3天)和病毒收获后8.0。分离后，第一次过滤后和Benzonase添加后，病毒滴定度分别降至7.5，7.2和7.4。福尔马林加入后，通过离心和再次悬浮病毒颗粒除去细胞毒素福尔马林悬浮液之后测定滴定度(表7，列：TCID50/mlTL100)。福尔马林加入病毒收获物之后15分钟，滴定度急剧降至1.6。福尔马林灭活之后12小时，无更大的病毒滴定度能被证实。
福尔马林灭活开始后24小时，样品接受在C6-36细胞及非洲绿猴肾细胞株系细胞上的安全性检验，然而灭活后24小时和26小时之后，能证实非洲绿猴肾细胞株系细胞上1个阳性(CPE)样品和4个阴性样品，用灵敏更多的C6-36细胞系得到4个阳性和1个阴性样品。从第2天开始，在非洲绿猴肾细胞株系细胞上所有样品是阴性。在第2天和第3天，C6-36细胞系仍显示1个CPE样品和4个阴性样品。第4天和第5天，在C6-36细胞上所有样品检验到阴性，但是第6天和第7天，一个样品再次显示CPE。第8天后，在非洲绿猴肾细胞株系细胞和C6-36细胞上都未能显示更多的阳性样品。
表71200升发酵罐收获的罗斯河病毒的安全性结果
 样品   TCID50/ml   TCID50/mlTL100   C6-36的安全性   Vero的安全性
 感染第1天   5.8   n.d.   n.d.   n.d.
 感染第2天   7.8   n.d.   n.d.   n.d.
 感染第3天   8.1   n.d.   n.d.   n.d.
 收获   8.0   n.d.   n.d.   n.d.
 分离后   7.5   n.d.   n.d.   n.d.
 第1次过滤后(1.2μm/0.2μm)   7.2   n.d.   n.d.   n.d.
 加入Benzonase后   7.4   n.d.   n.d.   n.d.
 福尔马林0小时(15分钟)   n.d.   1.6   n.d.   n.d.
 福尔马林1小时   n.d.   1.4   n.d.   n.d.
 福尔马林2小时(第2次过滤前)   n.d.   1.4   n.d.   n.d.
 福尔马林3小时(第2次过滤后)   n.d.   1.7   n.d.   n.d.
 福尔马林6小时   n.d.   1.1   n.d.   n.d.
 福尔马林12小时   n.d.   ＜0.2   n.d.   n.d.
 福尔马林18小时   n.d.   ＜0.2   n.d.   n.d.
 福尔马林24小时(第3次过滤前，第2次加Benzonase前)   n.d.   ＜0.2   4阳1阴   1阳4阴
 福尔马林26小时(第3次过滤后，第2次加Benzonase后)   n.d.   ＜0.2   4阳1阴   1阳4阴
 福尔马林第2天   n.d.   ＜0.2   1阳4阴   5阴
 福尔马林第3天   n.d.   ＜0.2   1阳4阴   5阴
 福尔马林第4天   n.d.   ＜0.2   5阴   5阴
 福尔马林第5天   n.d.   ＜0.2   5阴   5阴
 福尔马林第6天   n.d.   ＜0.2   1阳4阴   5阴
 福尔马林第7天   n.d.   ＜0.2   1阳4阴   5阴
 福尔马林第8天   n.d.   ＜0.2   5阴   5阴
(B)用RRV RNA的转染和感染实验
前面提到的安全性检验的结果引起了质疑，即在灭活过程中基因组RRV RNA可能被释放出。这就可能导致基因组RRV RNA与个别细胞的结合。尽管Benzonase处理应该导致RNA的完全降解，但是脂质体的形成和其他类似蛋白碎片掩盖基因组RRV RNA的机制可以解释完整RNA的逃脱策略。
RRV基因组RNA从梯度纯化病毒中分离出。经RT-PCR，颗粒等份数目能被测定。第一次实验中(表8，编号1)，颗粒等份(基因组RNA)在转染培养基(也就是转染)和正常培养基(也就是感染)中都被稀释10倍。用两者混合物接种C6-36细胞和非洲绿猴肾细胞株系细胞。在培养基交换后，细胞培养物培养数天。各个上清液的样品用于病毒滴定和HA测定。使用基因组RNA的感染实验进行数次(表8，编号1-编号5)。
转染实验在C6-36细胞和非洲绿猴肾细胞株系细胞上都显示TCID50的阳性结果。非洲绿猴肾细胞株系细胞上清液也显示HA-滴定度。用很多颗粒等份(108)感染非洲绿猴肾细胞株系细胞显示6，8对数TCID50/ml的病毒滴定度和128的HA-滴定度，但是没有感染C6-36细胞。另一个使用基因组RRV RNA的感染实验(编号4)结果显示C6-36细胞和非洲绿猴肾细胞株系细胞均被感染，分别的滴定度为8.4对数TCID50/ml和6.6对数TCID50/ml。第2，3和5个感染实验在非洲绿猴肾细胞株系细胞上无阳性结果。第3个感染实验在C6-36细胞上有1.6对数TCID50/ml的低滴定度。
尽管所有用纯基因组RRV RNA感染细胞的实验未显示阳性结果，但是似乎高浓度的基因组RNA能偶尔感染细胞。所有用脂质体转染试剂的实验显示阳性结果。因此，蛋白掩盖RNA或脂质体形成机制将解释表7中福尔马林灭活及Benzonase降解自由DNA/RNA后的阳性安全性检验。
表8
使用RRV RNA的转染和感染实验
  编号   样品   感染.PA*   RNA-转染(DMRIE-C)   RNA-感染
  C6-36   Vero   C6-36   Vero
  对数TCID50   HA   对数TCID50   HA   对数TCID50   对数TCID50   HA
  1   RNA-1   1×108   7.4   阴性   7.1   128   0.2   6.8   128
  1×107   5.5   阴性   7.1   64   0.2   阴性   n.d.
  1×106   7.6   阴性   7.2   128   0.2   阴性   n.d.
  1×105   5.2   阴性   5.6   128
  1×104   0.2   阴性   0.2   阴性
  2   RNA-1   1×108   0.2   0.2   n.d.
  3   RNA-1   1×108   7.5   n.d.   4.6   n.d.   1.6   0.2   n.d.
  4   RNA-2   1×108   7.2   n.d.   4.2   n.d.   8.4   6.6   n.d.
  RNA-2   1×107   7.0   n.d.   5.0   n.d.
  5   RNA-2   1×108   0.2   0.2   n.d.
*PA：感染粒子等份
n.d.：：未做
(C)感染RRV的紫外线灭活
为了前面提到的考虑事项，进行小规模实验以通过紫外线照射灭活RRV。RRV PV上清液被两种紫外线强度紫外线照射不同时间：2.1mW/cm2(样品1-10)和3.3mW/cm2(样品11-20)。随后，这些样品接受病毒滴定，抗原-滴定(EIA)和测红血球凝聚滴定度。被照射超过3分钟的样品(编号6-10和14-19)也接受C6-36细胞安全性检验(表9)。
紫外线照射10分钟后两种紫外线强度下从7.4对数TCID50/ml(对照，样品#1)到1.5对数TCID50/ml滴定病毒滴定度。红血球凝聚在2.1mW/cm2紫外线强度下用为9的HA-滴定度保持稳定15分钟，但在3.3mW/cm2紫外线强度滴至8。抗原-滴定度(EIA)也在15分钟照射下保持稳定，范围在640-1280之间。用在2.1mW/cm2紫外线强度下照射3分钟和5分钟的样品(样品编号6和7)进行的安全性检验还显示细胞培养物呈CPE，分别的病毒滴定度为8.2对数TCID50/ml和8.6对数TCID50/ml。用在更高的3.3mW/cm2紫外线强度下照射2分钟，3分钟和5分钟的样品(样品编号14-16)进行的安全性检验还显示细胞培养物呈CPE，分别的病毒滴定度为8.2对数TCID50/ml，8.6对数TCID50/ml和8.7对数TCID50/ml。照射10分钟后，所有安全性检验为阴性。
2.1mW/cm2和3.3mW/cm2强度下的超过10分钟的紫外线照射均完全灭活RRV制剂。如HA-和EIA-检验所示的抗原性在两种照射强度下15分钟均未被破坏。30分钟后，抗原性受到影响。
表9
感染病毒的紫外线灭活
编号 样品 处理   时间(秒)   TCID50/ml HA EIA   紫外线强度mW/cm2   总紫外线mJ/cm2   安全性C6-36TCID50/ml
  1   RRV PV/Sp5/57/4/98   初始材料   -   7.4   9   640   -   0   n.d.
  2345678910   RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98   4ml，5cm，30秒4ml，5cm，60秒4ml，5cm，90秒4ml，5cm，2分钟4ml，5cm，3分钟4ml，5cm，5分钟4ml，5cm，10分钟4ml，5cm，15分钟4ml，5cm，30分钟   3060901201803006009001800   4.43.71.71.83.21.51.51.51.5   999999997   640640640640128012801280640320   2.12.12.12.12.12.12.12.12.1   63126189252378630126018903780   n.d.n.d.n.d.n.d.+(8.2)+(8.6)-(0.2)-(0.2)-(0.2)
  111213141516171819   RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98RRV PV/Sp5/57/4/98   4ml，3cm，30秒4ml，3cm，60秒4ml，3cm，90秒4ml，3cm，2分钟4ml，3cm，3分钟4ml，3cm，5分钟4ml，3cm，10分钟4ml，3cm，15分钟4ml，3cm，30分钟   3060901201803006009001800   3.83.01.72.21.61.51.51.51.5   999988872   6406406406406401280640640160   3.33.33.33.33.33.33.33.33.3   99198297396594990198029705940   n.d.n.d.n.d.+(8.2)+(8.6)+(8.7)-(0.2)-(0.2)-(0.2)
  20   阳性对照   -   7.2   9   -   -   -   n.d.
(D)福尔马林灭活过的1200升发酵罐收获物的紫外线灭活
一部分福尔马林处理过的1200升发酵罐病毒收获物300l/h流速循环3次，150l/h流速循环3次和75l/h流速循环3次被紫外线照射。第二部分的福尔马林处理过的1200升发酵罐病毒收获物300l/h流速循环10次被紫外线照射，但此时间在除去高浓度残存小蛋白的渗滤之后。每次运转后，测HA-滴定度，抗原-EIA-滴定度，病毒滴定度和安全性(CPE)(表10)。
第一次实验(无渗滤)的病毒滴定度在流速150l/h的紫外线照射1次循环之后从6.13对数TCID50/ml滴定至测定界限。安全性检验也显示无CPE。但是，流速150l/h的紫外线照射3次循环之后，细胞培养物的安全性检验显示阳性结果并病毒滴定也是阳性(6.7对数TCID50/ml)。流速75l/h的紫外线照射3次循环病毒滴定和安全性检验均保持阴性。第二次实验中，在5次和更多的照射循环后安全性检验和病毒滴定保持阴性。第一次实验中，所有的照射剂量对11的HA-滴定度和1∶320的EIA-滴定度无影响。第二次实验中，所有的HA-滴定度和EIA-滴定度分别为10和1∶320，除了6次照射循环的EIA-滴定度结果为1∶640。
用福尔马林和5次或更多次300l/h流速的紫外线照射循环双重灭活RRV发酵罐收获物是足够完全破坏传染性而不破坏抗原性。
表10
RRV1200升发酵罐收获物的紫外线灭活
样品   HA滴定度   AG-EIA滴定度   TCID50(经过C6-36后) 安全性最终读出/CPE
  RRV F07-31收获物+甲醛初始材料   11   1∶320   6.13   ++++
  RRV F07-31超滤   4   1∶80   7.04   +---
  RRV F07-31diafiltrate初始材料   11   1∶320   5.95   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林1×UV300l/h   11   1∶320   6.29   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林2×UV300l/h   11   1∶320   5.71   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林3×UV300l/h   11   1∶320   6.31   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林1×UV150l/h   11   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林2×UV150l/h   11   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林3×UV150l/h   11   1∶320   6.70   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林1×UV75l/h   11   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林2×UV75l/h   11   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林3×UV75l/h   11   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated1×UV300l/h   10   1∶320   6.71   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated2×UV300l/h   10   1∶320   6.71   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated3×UV300l/h   10   1∶320   6.82   ++++
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated4×UV300l/h   10   1∶320   2.82   +---
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated5×UV300l/h   10   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated6×UV300l/h   10   1∶640   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated7×UV300l/h   10   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated8×UV300l/h   10   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated9×UV300l/h   10   1∶320   0.21   ----
  RRV F07-31收获物+福尔马林diafiltrated10×UV300l/h   10   1∶320   0.21   ----
(E)双重灭活的RRV候选疫苗制剂的功效
免疫鼠的有效剂量(ED50)，保护剂量(PD50)和ELISA滴定度
福尔马林灭活和双重灭活(福尔马林+紫外线照射)的RRV候选疫苗调整至每剂10μg，然后被稀释4倍。每份稀释液给10个一组的鼠注射。3周后，鼠用相应量的疫苗激发。第3周在激发前和第6周即激发后3周取血液样品。通过RRV抗体ELISA分析血清。然后算出有效剂量50(ED50)，即足以在50％免疫鼠上引起血清转化的抗原剂量。
第3周，激发前，福尔马林灭活组的ED50是635ng，福尔马林和紫外线双重灭活组的ED50是202ng。激发后，ED50值分别为33ng和10ng。但是，ELISA滴定度的分析证实双重灭活组有更高的抗体滴定度，例如第3周，福尔马林组9只鼠ELISA滴定度1000相对双重灭活组16只鼠ELISA滴定度1000，福尔马林组没有鼠ELISA滴定度10,000相对双重灭活组中4只鼠ELISA滴定度10,000。激发后，双重灭活组的滴定度再次更高：福尔马林8只鼠滴定度100,000相对双重灭活组11只鼠滴定度100,000，双重灭活组另外4只鼠ELISA滴定度1百万(表11)。
第6周，激发后3周，鼠用106TCID50/ml(组织培养感染剂量50)活性罗斯河病毒(菌株T48)静脉感染。第1，2，3和4天，取p.i.血液样品，随后测血清TCID50。算出保护剂量(PD50)，即50％感染鼠显示无病毒血的抗原剂量。两种抗原制剂，福尔马林灭活及双重灭活(福尔马林+紫外线照射)的抗原，PD50同为78ng。
表11
免疫鼠中有效剂量(ED50)，保护剂量(PD50)和ELISA滴定度。
 ED50   PD50
 灭活   第3周  第6周(激发)   第6周
 福尔马林   635ng  33ng   78ng
 福尔马林+紫外线   202ng  10ng   78ng
ELISA-滴定度
  周   灭活   ＜101   101   102   103   104   105   106   107   108   N
  3   福尔马林   35   8   8   9   0   0   0   0   0   60
  福尔马林+紫外线   27   7   6   16   4   0   0   0   0   60
  6   福尔马林   14   7   5   15   11   8   0   0   0   60
  福尔马林+紫外线   8   7   9   7   14   11   4   0   0   60
福尔马林单独处理后，主要在非常灵敏的C6-36细胞系上发现的残存感染性，极有可能是由感染的RRV RNA引起的。另加的第二个病毒灭活步骤(紫外线照射)的介入，在福尔马林处理后影响病毒的基因组，导致完全失活及安全的RRV候选疫苗制剂而不影响鼠模型上的免疫原性和功效。

Claims (18)

1.一种灭活样品中所含病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用有效浓度的福尔马林处理样品，和(ii)在流经设备中使样品接受有效剂量的紫外线，其中步骤(i)在步骤(ii)之前进行或反之亦然，其中样品通过设备的流速为约50升/小时至约1000升/小时。
2.一种灭活样品所含包膜病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用有效浓度的福尔马林处理样品，和(ii)在流经设备中使样品接受有效剂量的紫外线，其中步骤(i)在步骤(ii)之前进行或反之亦然，其中包膜病毒是完全灭活的。
3.一种灭活样品所含包膜RNA病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用有效浓度的福尔马林处理样品，和(ii)在流经设备中使样品接受有效剂量的紫外线，其中步骤(i)在步骤(ii)之前进行或反之亦然，其中包膜病毒是完全灭活的。
4.一种灭活样品所含病毒的方法，所述方法包括步骤(i)用有效浓度的福尔马林处理样品，和(ii)在含紫外灯和薄层室的流经设备中使样品接受有效剂量的紫外线，设备基本上垂直于紫外灯的直径，其中步骤(i)在步骤(ii)之前进行或反之亦然，其中样品在步骤(ii)中经过设备中的薄层室。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中由于样品中病毒失活引起的病毒滴定度降低为至少约1×105，或至少约1×107，或至少约1×1010，或至少约1×1014。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中用有效浓度的福尔马林处理样品的步骤进行约至12至约96小时。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中福尔马林的有效浓度为约0.01至约0.1％。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中紫外线是约100至约280nm波长的UVC。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中紫外线剂量是约5至约200mJ/cm2。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中紫外线接触样品的时间为约1至约20秒。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中在流经设备中的流速为约50至约1000升/小时。
12.权利要求1至11任一项的方法，其中流经设备含有薄层室。
13.权利要求1至12任一项的方法，其中样品经过薄层室的流动是混浊的。
14.权利要求12或13的方法，其中薄层室的薄层厚度约为1mm。
15.权利要求1至14任一项的方法，其中在流经设备中使样品接受有效剂量紫外线的步骤重复约2至约10次。
16.权利要求1至15任一项的方法，其中样品选自源自用于制备生物产品、医学产品或药品的细胞培养过程的生物流体或溶液。
17.权利要求1至16任一项的方法，所述方法还包括将样品接受纯化步骤以除去样品中残留的福尔马林。
18.权利要求1至17任一项的方法，所述方法还包括将样品中失活的病毒纯化至药物纯度，并将纯化的失活病毒配制成用作疫苗的药物组合物。
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