CN1391954A - 增强核酸疫苗免疫的组合物及其生产方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

一种增强核酸疫苗免疫的组合物及其生产方法和使用方法，其组合物含有核酸疫苗和增强免疫的化合物，而该增强免疫的化合物为左旋咪唑或左旋咪唑的衍生物或乙醇或甘油或雌二醇或油酸或吐温80；其使用方法是：通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述增强核酸疫苗免疫的组合物进入机体或者上述增强核酸疫苗免疫的组合物是被其它物质包裹或混合后进入机体的。本发明的技术效果：利用本发明提供的组合物及生产和使用方法不仅使核酸疫苗能够有效的提高激发完全免疫反应能力保护机体抵抗病原体侵染，而且制备简单无需复杂设备和操作简单，并且易于实施，其免疫效果超过未使用本发明组合物。

Description

增强核酸疫苗免疫的组合物及其生产方法和使用方法

                        技术领域

本发明涉及激活、提高、调节机体免疫反应的组合物及其生产方法和使用方法，是一种增强核酸疫苗免疫的组合物及其生产方法和使用方法。

                        背景技术

有多种方法可以预防各种病原体感染，提高机体免疫力是最主要的手段，一般是以接种疫苗而达到的。接种疫苗是预防各种病原体感染的有效措施。常见的病原体有病毒、微生物、真核细胞、寄生虫和环境因子等有机体和分子。目前已有多种方法用来生产抗传染性病原体的疫苗，如灭活疫苗，减毒活疫苗、重组疫苗，亚单位疫苗和核酸疫苗等。它们的基本作用原理是相同的，即借助与病原体结合的靶蛋白激发免疫反应，达到免疫个体不被传染性病原体感染的目的。当个体与传染性病原体接触时，其免疫系统能够识别病原体蛋白而产生有效的保护反应抵抗传染。目前所用的许多疫苗就是由从病原体中分离出来的非传染性和低传染性的蛋白或核酸物质所组成。核酸疫苗的优点在于可以激活体液免疫反应和细胞免疫反应，而更有效地激发保护性和清除性的免疫反应，达到防治病原体感染，抗肿瘤，治疗自主免疫疾病和清除毒素引起的中毒症状等抵抗外来病源体的感染和内在病变，同时核酸疫苗制备方便，成本低廉，安全性好从而备受推崇。但是核酸疫苗的缺点是在体内激活机体产生完全免疫反应的效率较低，单独使用还不能达到保护能力或保护性不稳定。袖以激活、提高、调节核酸疫苗免疫反应的佐剂正是解决此问题的关键。

佐剂的类型多种多样，按种类分为溶性铝盐类佐剂(Glenny，J.Path.Bacteriol，34，267，1926)、油水乳剂佐剂(如弗氏佐剂)、微生物及其代谢产物佐剂(R.Germanier，ed.，Bacterial Vaccines，Academic Press Inc.New York，1984)、人工合成佐剂(Coughlin et al.，P.The Journal of Infectious Diseases，171：1049-1052，1995)、免疫刺激组合物(ISCOM)佐剂(Coughlin et al.，P.TheJournal of Infectious Diseases，171：1049-1052，1995)、细胞因子类佐剂(Trinchieri G.Immunology 13：251-276，1995)、核酸及其类似物佐剂(美国专利6,372,227；Manmohan Singh & Derek O′Hagan.Nature Biotechnology17，1075-1081，1999；Virgil EJC Schijns.Current Opinion in Immunology，12：456-463，2000)；按作用方式分为三种：第一，在接种部位形成抗原贮存库，使抗原缓慢释放，较长时间使抗原与免疫细胞接触并激发对抗原的应答；第二，辅助抗原暴露并将能刺激特异性免疫应答的抗原表位提呈给免疫细胞；第三，诱导能介导免疫应答的细胞因子释放。

但是上述佐剂各存在一些问题，如，上述佐剂大部分是针对非核酸疫苗而开发而成，不与核酸疫苗有效配伍；另外它们主要是针对提高抗体水平而设立的，从而抑制细胞免疫的效果；又由于它们主要是通过肌肉、皮下注射而达到提高抗体水平而设立的，局限性地无法有效用于粘膜免疫反应，从而使其应用在核酸疫苗实用上受到限制。

                         发明内容

针对上述存在的问题，我们有针对性的分析和筛选了可用于与核酸疫苗有效配伍并能增强其免疫效果的化合物，并得到含有该化合物和核酸疫苗的增强核酸疫苗免疫的组合物，而且提供了该增强核酸疫苗免疫的组合物的生产方法和使用方法

本发明的技术方案是通过以下措施来达到的：

一种增强核酸疫苗免疫的组合物，其含有核酸疫苗和增强免疫的化合物，而该增强免疫的化合物为左旋咪唑或左旋咪唑的衍生物或乙醇或甘油或油酸或吐温80。

上述核酸疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

上述人工合成为聚合酶链式反应(PCR)方法

上述生物体为大肠杆菌或芽孢杆菌或酵母菌或真核细胞。

上述增强核酸疫苗免疫的组合物通过以下方法得到：通过序列分析和真核细胞中瞬时表达抗原蛋白测定，将高表达水平的DNA质粒作为核酸疫苗，经大肠杆菌培养扩增后，提取重组DNA质粒，纯化后以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理盐水中或者纯化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐温80生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理盐水中，得到所需要的增强核酸疫苗免疫的组合物。

一种增强核酸疫苗免疫的组合物的生产方法，按以下步骤进行：通过序列分析和真核细胞中瞬时表达抗原蛋白测定，将高表达水平的DNA质粒作为核酸疫苗，经大肠杆菌培养扩增后，提取重组DNA质粒，纯化后以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理盐水中或者纯化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐温80生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理盐水中，得到所需要的增强核酸疫苗免疫的组合物。

在上述生产方法中，上述核酸疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的RNA或DNA。

在上述生产方法中，上述生物体为大肠杆菌或或芽孢杆菌或酵母菌或真核细胞。

上述人工合成为聚合酶链式反应(PCR)方法。

一种上述的增强核酸疫苗免疫的组合物的使用方法，该使用方法是：通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述增强核酸疫苗免疫的组合物进入机体。

一种上述的增强核酸疫苗免疫的组合物的使用方法，该使用方法是：上述增强核酸疫苗免疫的组合物是被其它物质包裹或混合后进入机体的。

本发明是利用含左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐温80和核酸疫苗结合组成组合物接种激活机体完全免疫反应，达到防治病原体感染、抗肿瘤、治疗自主免疫疾病和清除蛋白性毒素引起的中毒症状等。按照本发明含左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐温80和核酸疫苗结合组成组合物进入细胞，激活细胞内一系列信号而产生完全免疫反应。

左旋咪唑一直用于畜禽的驱虫药，由于目前有非特异性免疫调节剂作用，从而用于抗乙肝病毒等疾病辅助治疗以免疫和抗病毒疗效(9-11)。乙醇是广泛用于消毒、沉淀核酸、蛋白质等的化学试剂和抑制免疫反应的物质(12)。甘油是广泛用于润滑、缓冲、保湿、化妆品等用途。油酸广泛用于合成洗涤剂、油墨、涂料、和表面活性剂等用途，吐温80广泛用于乳化、增溶、分散、作助溶剂和防锈剂。但是关于左旋咪唑和乙醇促进和提高疫苗的特异性免疫活性未有报道，特别是对核酸疫苗特异性免疫活性的研究我们是首次发现。

本发明的另一个重要方面是提供左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐温80与核酸疫苗增强细胞免疫水平，同时可以激发足够的抗体水平。由于在左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐温80作用下，核酸疫苗可以激活更为强烈的完全免疫反应。

本发明是通过含左旋咪唑或乙醇或甘油或油酸或吐温80与核酸疫苗结合构成组成物直接导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织来激活有效的系统免疫和粘膜免疫反应抵抗外来病原体侵入。

本发明利用导入机体此组合物激活机体完全免疫反应，预防病原体传染。抗原性物质可以是病原体相关的蛋白，内源性和外源性蛋白，这里所述的发明指此组合物来达到抵御携带抗原性物质病原体的感染，而得到保护的目的。

本发明通过此组合物诱发机体的免疫发反应，识别快速增殖细胞的特异性抗原性物质，产生专一性的细胞毒性免疫反应，清除携带有抗原性物质的细胞，达到对抗细胞失调类疾病，如肿瘤、癌症的目的。

本发明通过此组合物诱发机体的免疫反应，识别参与自主免疫反应细胞上的特异性靶蛋白，产生专一性的细胞毒性免疫反应，清除携带有抗原性物质的细胞，达到治疗自主性免疫疾病的目的。

本发明通过此组合物诱发机体的免疫反应，中和具有抗原决定簇的有害蛋白，达到清除毒素作用的目的。

通过本组合物激发机体产生完全免疫反应，包括体液免疫反应和细胞免疫反应，其中细胞毒性T细胞反应起重要的作用。研究已经证实了通过此免疫方法细胞所产生的靶抗原在体内的被清除。当抗原性物质降解成小肽，被MHC-1分子结合，递呈到细胞表面，这种MHC-I抗原组合物能够有效地刺激CD⁸T细胞，产生细胞毒性T细胞反应(即杀伤T细胞反应)，该反应是机体抵御病原体和清除有害细胞的关键。此免疫方法比单独使用蛋白质抗原或蛋白质抗原加佐剂接种更能有效地产生特异性抗体，能有效地激发特异性细胞毒性T细胞反应。

因此，本组合物比灭活的或失活的病毒疫苗、蛋白疫苗、肽类亚单位疫苗和核酸疫苗等接种方法，更为安全有效的保护机体抵御病原体感染、抗肿瘤和治疗自主免疫疾病。

本组合物能够有效的激发完全免疫反应，又避免使用感染性的制剂，载体和不安全的遗传物质。其它常规免疫接种技术(除了核酸疫苗以外)，如果不使用感染性制剂就不会激活细胞毒性T细胞反应，因此灭活或失活疫苗，亚单位疫苗接种均不产生完全的免疫反应。本组合物能有效地克服常规免疫接种技术的这些不足。

本发明针对性的致病病原体有：病毒、原核细胞、真核细胞。真核细胞病原体包括单细胞致病病原体和多细胞寄生虫类。

本发明为保护机体抵抗病毒性病原体感染提供了一种有效的方法。病毒性病原体包括呼吸道病毒(流感和轮状病毒)、疮疹病毒(德国麻疹、水痘、牛痘、天花、带状疮疹等)、中枢神经系统病毒(沅病毒)、免疫系统病毒(艾滋病毒)、生殖系统病毒(尖锐湿疣)、畜牧病毒(口蹄疫病毒、猪瘟)、和一切可能的致病性病毒。

本发明的技术效果：利用本发明提供的组合物及生产和使用方法不仅使核酸疫苗能够有效的提高激发完全免疫反应能力保护机体抵抗病原体侵染，而且制备简单无需复杂设备和操作简单，并且易于实施，其免疫效果超过未使用本发明组合物。

                       附图说明

图1：口蹄疫病毒cDNA VP1的合成及PCR扩增

口蹄疫病毒RNA样品在Poly A引物及RNA反转录酶的化下VP1合成cDNA和并在Vp1 5’和3’引物存在下进行PCR扩增。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后进行观察拍照从图中可看出600bp大小VP1条带。

图2：VP1真核表达质粒构建

为鉴定所构建的真核表达质粒pcDNA-VP1是否正确，将重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切后，得到约为5.4kb和600bp的两条条带，分别是pcDNA3和VP1。说明重组质粒为已连接有VP1 cDNA片段的真核表达质粒。

图3：真核表达质粒序列分析

为确定VP1 cDNA序列，将VP1用ABI PRISM 377测序仪进行测序分析。经正反向测序，鉴定后证明其序列正确。

图4：RT-PCR鉴定真核表达质粒

为鉴定所构建的真核表达质粒是否能在真核细胞中进行表达，pcDNA-VP1经脂质体lipofactamine方法处理后转染Hela细胞。其表达的mRNA含量由VP1序列的专一性引物存在下进行RT-PCR方法扩增，将产物经琼脂糖凝胶电泳后得出600bp大小VP1条带(条带3)；而未转染的Hela细胞(条带1)和对照质粒转染的Hela细胞(条带3)均未扩增出VP1条带。

表1：比较真核表达水平

在小白鼠肌肉注射本发明提到的化合物和100微克真核表达质pCMVβ的组合物后，7天后测定其表达水平如表1：

             表1

组	表达指数
		对照	0
无佐剂	1±0.5
		5％酒精	3.5±0.5
1％左旋咪唑	1.5±0.3
		1.5％吐温80	4.5±0.5
10％甘油	4±0.7
		1％油酸	4.5±0.8
0.25％布比卡因	1.8±0.6

从表中可以看出，利用酒精、左旋咪唑、甘油、吐温80、油酸为佐剂，与无佐剂相比基因的表达水平明显提高；除左旋咪唑外，其余与0.25％布比卡因佐剂相比，表达水平明显提高。

表2：小白鼠抗VP1抗体的检测

在小白鼠肌肉注射本发明提到的化合物和100微克核酸疫苗的组合物后，在第二周再重复注射同等剂量一次，两周取血清测定其免疫反应，结果如表2。

              表2

	抗VP1抗体浓度(ng/ml)
			免疫组	IgG1	IgG2a
对照	2	4
			无佐剂	566	340
5％酒精	1016	256
			0.5％油酸	456	200
10％甘油	383	266
			1.5％吐温80	516	150
1％左旋咪唑	736	833
			0.25％布比卡因	616	233

从表中可以看出，利用酒精、左旋咪唑、甘油、吐温80、油酸为佐剂，与无佐剂相比抗体浓度明显提高，酒精、吐温80和左旋咪唑为佐剂与0.25％布比卡因佐剂相比，抗体浓度明显提高。

表3：猪抗VP1抗体的检测

在猪肌肉注射本发明提到的化合物和200微克核酸疫苗的组合物后，在第二周再重复注射同等剂量一次，两周、四周、六周、八周和十周取血清测定其抗体滴度，结果如表3。

                          表3

免疫组	抗VP1抗体滴度(稀释度)
						免疫后周数	2	4	6	8	10
对照	400	400	400	400	400
						无佐剂	400	800	800	800	800
5％酒精	1600	1600	3200	3200	3200
						1％左旋咪唑	6400	3200	6400	6400	3200

从表中可以看出，利用5％酒精、1％左旋咪唑为佐剂，与无佐剂相比，抗体滴度明显提高。

表4：抗口蹄疫O型病毒实验

在豚鼠肌肉注射本发明提到的化合物和100微克核酸疫苗的组合物后，在第二周再重复注射同等剂量一次，第四周利用20个发病量口蹄疫O型病毒攻击豚鼠并测定其发病率，结果如表4。

                    表4

组别	疫苗	攻毒20个发病量	发病率
				1	对照	+	100％
2	pcDNA-VP1	+	25％

                       具体实施方式

借助以下实施例对本发明作进一步描述：

下面这些实施例是示范性的，而不是限制性的，可根据上述本发明的技术方案和实际情况，来确定具体的实施方式。

实施例1：核酸疫苗制备

病毒RNA的提取和纯化：

异硫氰酸胍一步法提取RNA：参照RNA提取试剂盒操作程序，提取步骤如下；取病变组织破碎分离细胞，加入0.5ml异硫氰酸胍溶液，0.5ml的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液，4℃ 12000rpm离心5分钟，将上清移至一新的1.5毫升塑料离心管中，加等量的异丙醇，-20℃放置30分钟，12000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀用70％乙醇清洗，沉淀干燥后溶于30ulDEPC处理H₂O中，变性琼脂糖凝胶电泳进行检测。

引物设计：

根据目的基因核酸序列，合成5’和3’引物。在5’和3’引物的引导下通过PCR方法从病毒的核酸中扩增出目的基因并克隆至真核表达质粒中(如pcDNA3)。

病毒cDNA的合成及PCR扩增：

反转录：

取适量的病毒总RNA经煮沸变性后加入适当的引物及反转录酶合成第一链cDNA。其反应条件为：2μg FDMV RNA，50mmol/L Tris-Cl(pH8.3)，75mmol/LKCL，10mmol/L DTT，3mmol/L MgCl2，500ummol/L dNTPs，100μg随机六聚体引物，500单位MMLV-RTase，总体积为20μl，37℃保温1h。

PCR扩增：

取5μl第一链cDNA产物经过30个PCR循环，其反应条件为：第一链cDNA产物5μl，5’和3’引物各10pmole，500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH8.4)，1.5mM MgCl2，100ug/ml BSA，1mM 4dNTPs，2.5U Taq polymerase，总体积为50μl。

每一循环包括94℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃处伸1min，共30个循环。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物(图例1)并以低熔点胶回收扩增片段。

PCR产物真核表达质粒构建及序列分析：

将PCR产物用特定的限制性内切酶酶切回收PCR片断，同时用特定的限制性内切酶酶切pcDNA3质粒作为载体。将回收的PCR片断连接到pcDNA3质粒上，构建成真核表达质粒，经限制性酶切图谱分析正确无误(图例2)，并经核酸序列分析测定出其核酸序列(图例3)。

克隆片断真核表达质粒鉴定：

将构建成的真核表达质粒利用脂质体法转染Hela细胞并结合RT-PCR法测定其表达。具体如下。

1.5.1  细胞培养：

取6孔培养板或用35mm直径培养皿，向每孔中接种2ml含1-2×10⁵个细胞的培养液，37℃ CO₂温箱培养至40％-60％；

1.5.2  转染液制备：

在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μl；B液：用不含血清培养基稀释2-50μl lipofactamine，终量100μl；轻轻混合A，B二液，室温中置血清培养基稀释10分钟或者说15分钟或10至15分钟；

1.5.3  转染准备：用2ml不含血清培养液漂洗细胞两次；再加入1ml不含血清培养液；

1.5.4  转染：把A/B组合物缓缓加入培养液中，摇匀、37℃温箱置6小时或15小时或24小时或6至24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

1.5.5  收集与RT-PCR

转染后的细胞分别在培养24、48和72小时后收集细胞，并用前面提到的步骤1.3提取RNA后，进行RT-PCR检测其表达结果(图示4)。

1.6  核酸疫苗制备：

  1.6.1  通过序列分析和真核细胞中瞬时表达抗原蛋白测定，将高表

         达水平的DNA质粒作为核酸疫苗，经大肠杆菌培养扩增后，

         提取重组DNA质粒，纯化后以500微克/毫升ml或1000微

         克/毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶

         于0.1％或1.0％或2.0％或3.0％或5％的左旋咪唑生理盐水中，

         得到所需要的增强核酸疫苗免疫的组合物，用于免疫小鼠。可

         贮存于4℃待用。

  1.6.2  纯化的重组DNA质粒，以500微克/毫升ml或1000微克/

         毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于1％

         或2％或5％或8％或10％的乙醇生理盐水中，得到所需要的增强

         核酸疫苗免疫的组合物，用于免疫小鼠。可贮存于4℃待用。

  1.6.3  纯化的重组DNA质粒，以500微克/毫升ml或1000微克/

         毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于5％

         或7％或10％或12％或15％的甘油生理盐水中，得到所需要的增

         强核酸疫苗免疫的组合物，用于免疫小鼠。可贮存于4℃待用。

  1.6.4  纯化的重组DNA质粒，以500微克/毫升ml或1000微克/

         毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于

         0.2％或0.5％或0.8％或1.0％或1.5％或2.0％或3.0％或5.0％的吐

         温80生理盐水中，得到所需要的增强核酸疫苗免疫的组合物，

         用于免疫小鼠。可贮存于4℃待用。

  1.6.5  纯化的重组DNA质粒，以500微克/毫升ml或1000微克/

         毫升ml或1500微克/毫升ml或2000微克/毫升ml溶于

         0.1％或0.2％或0.3％或0.4％或0.5％或0.6％或0.8％或1.0％或

         1.5％的油酸生理盐水中，得到所需要的增强核酸疫苗免疫的

         组合物，用于免疫小鼠。可贮存于4℃待用。

实施例2  免疫动物：

在动物或人体肌肉、皮下、皮内、或静脉注射10μl或100μl或1000μl或10至1000μl含实施例1.6中浓度的左旋咪唑或乙醇和核酸疫苗结合组成组合物后两周取血测定其免疫反应，有必要时在第二周再重复注射同等剂量一次。每次注射后都在两周后采血，结果见表2和3。

实施例3  粘膜免疫动物

10μl或100μl或1000μl或10至1000μl含实施例1.6中浓度的左旋咪唑或乙醇和核酸疫苗结合组成组合物滴入动物或人体鼻腔、口腔、眼内或生殖道、排泄道等部位。每隔两周进行一次。每次实施后两周采血和粘液分泌物分析其免疫反应。

实施例4  抗体的ELISA检测

将96孔酶标板用适量抗原包被并可用已知抗体浓度设为标准浓度曲线，4℃过夜；弃去包被液PBST洗板三次；加入不低于1∶100稀释度的免疫动物血清或粘液分泌物，37℃孵育2小时；PBST洗板三次后，每孔加入适量辣根过氧化物酶标记的羊抗动物二抗(IgG1、IgG2a或IgA)100μl 37℃孵育1小时后弃去；PBST洗三次，加入底物液100μl，室温显色反应30分钟，2M硫酸中止反应，用酶标仪测定相应波长的OD值。根据标准浓度曲线求出未知抗体浓度(表2，3)。

实施例5  细胞介素水平测定

利用竞争定量PCR进行检测细胞介素mRNA的水平，其关键在于引入一个内标模板pQRS，它含有IL-2；IL-4；IL-5；IL-10；IL-12；TNF-α；TGF-β；IFN-γ；INOS；HRPT十个基因的部分序列，因此以pQRS可以检测鼠的相应细胞因子的含量。

取一只免疫后的小鼠断颈处死后取出脾脏，提取总RNA后，由RT-PCR扩增鼠脾脏总cDNA，其条件为：42℃反转录30-60分钟，99℃变性5分钟，5℃放置5分钟。PCR为：94℃，5分钟；94℃，40秒，55℃，20秒，72℃，40秒，扩增40个循环；72℃，10分钟。在1.5％琼脂糖电泳后观察结果。结果表明IL-2、IL-12和IFN-γ有所提高。

实施例6  病毒中和实验

取出组织培养感染剂量100病毒颗粒的50％与不同稀释度的抗血清混合后，加入易感细胞中，三天后观察其死亡数量结果，其中病毒颗粒与对照血清混合后细胞死亡；而病毒颗粒与不同稀释度免疫血清混合后呈现出在低稀释度时细胞死亡小，在高稀释度时细胞死亡大，确定其免疫血清有中和病毒的效果。

实施例7  抗口蹄疫O型病毒实验

经RT-PCR扩增的口蹄疫O型病毒VP1产物克隆至pcDNA3上，分离纯化后为VP1核酸疫苗，使用实施例1.6中浓度范围与本发明提及的化合物充分混合后的组合物。

1.注射免疫：

将实验鼠分成多组：第一组为对照组注射化学物与对照核酸疫苗混合物，其余组为实验组注射化学物与VP1核酸疫苗混合物。两周后重复一次。

2.粘膜免疫：

滴入动物鼻腔、口腔、眼内等部位两周取血、尿及阴道分泌物，测定其免疫反应，有必要时在第二周重复滴入同等剂量一次。每次滴入后都在两周后采血、尿及阴道分泌物。

3.检测：

用以上提到的ELISA方法检测血中抗口蹄疫O型病毒抗体水平，其中血清测定专一性IgG水平高出对照；测定尿及阴道分泌物专一性IgA水平高出对照。测定细胞介素水平，测定口蹄疫O型病毒专一性的T细胞增生。

4.攻毒

免疫两周后，将20个发病量的口蹄疫病毒分别注入二组动物中，待一周后检查动物发病情况，以衡量该疫苗抗口蹄疫O型病毒的效果(表4)。

实施例8  口蹄疫O型VP1核酸疫苗用于猪的免疫实验

注射免疫：

将实验猪分成四组：第一组为对照组；注射VP1核酸疫苗；第三组注射左旋咪唑VP1疫苗组合物；第四组注射乙醇VP1疫苗组合物。两周后重复一次。从注射第二周开始取血清，每两周一次，以上提到的ELISA方法检测血中抗口蹄疫O型病毒VP1抗体水平(表3)。

Claims (10)

1、一种增强核酸疫苗免疫的组合物，其特征在于该组合物含有核酸疫苗和增强免疫的化合物，而该增强免疫的化合物为左旋咪唑或左旋咪唑的衍生物或乙醇或甘油或油酸或吐温80。

2、如权利要求1所述的增强核酸疫苗免疫的组合物，其特征在于上述核酸疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的核糖核酸或脱氧核糖核酸。

3、如权利要求2所述的增强核酸疫苗免疫的组合物，其特征在于上述生物体为大肠杆菌或芽孢杆菌或酵母菌或真核细胞。

4、如权利要求2所述的增强核酸疫苗免疫的组合物，其特征在于上述人工合成为聚合酶链式反应方法。

5、如权利要求1或2或3或4所述的增强核酸疫苗免疫的组合物，其特征在于该组合物通过以下方法得到：通过分子克隆、序列分析和真核细胞中瞬时表达抗原蛋白测定，将高表达水平的DNA质粒作为核酸疫苗，经大肠杆菌或芽孢杆菌或酵母菌或真核细胞培养扩增后，提取重组DNA质粒，纯化后以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理盐水中或者纯化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐温80生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理盐水中，得到所需要的增强核酸疫苗免疫的组合物。

6、一种增强核酸疫苗免疫的组合物的生产方法，其特征在于该生产方法是：通过分子克隆、序列分析和真核细胞中瞬时表达抗原蛋白测定，将高表达水平的DNA质粒作为核酸疫苗，经大肠杆菌培养扩增后，提取重组DNA质粒，纯化后以500-2000微克/毫升ml溶于0.1％至5.0％的左旋咪唑生理盐水中或者纯化后以500至2000微克/毫升ml溶于1％至10％的乙醇生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于5％至15％的甘油生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.2％至5.0％的吐温80生理盐水中或以500至2000微克/毫升ml溶于0.1％至1.5％的油酸生理盐水中，得到所需要的增强核酸疫苗免疫的组合物。

7、如权利要求6所述的增强核酸疫苗免疫的组合物的生产方法，其特征在于上述核酸疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的核糖核酸或脱氧核糖核酸。

8、如权利要求7所述的增强核酸疫苗免疫的组合物的生产方法，其特征在于上述生物体为大肠杆菌或芽孢杆菌或酵母菌或真核细胞；或者，上述人工合成为聚合酶链式反应方法。

9、一种如权利要求1或2或3或4所述的增强核酸疫苗免疫的组合物的使用方法，其特征在于该使用方法是：通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述增强核酸疫苗免疫的组合物进入机体；或者是：上述增强核酸疫苗免疫的组合物是被其它物质包裹或混合后进入机体的。

10、一种如权利要求5所述的增强核酸疫苗免疫的组合物的使用方法，其特征在于该使用方法是：通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述增强核酸疫苗免疫的组合物进入机体；或者是：上述增强核酸疫苗免疫的组合物是被其它物质包裹或混合后进入机体的。

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