CN105194688B - 预防对虾白斑综合症病毒二价dna疫苗的制作法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法及应用在引物设计时进行在上、下游引物两端分别加上两个酶切位点，使克隆得到的抗原基因VP19和VP28带有双酶切位点；在进行双酶切时，使目的基因获得粘性末端，再用DNA连接酶将抗原基因VP19和VP28串联克隆至原核表达载体，用以进行原核表达载体；在构建二价DNA疫苗时，需要进行VP19基因改造，即通过引物设计，去除VP19基因的终止密码子；由于在进行引物设计时，VP19基因下游的酶切位点和VP28上游的酶切位点是同一个，所以通过酶切技术，可以使VP19基因和VP28基因串联克隆。
Description
技术领域
本发明属DNA疫苗技术领域，具体涉及一种预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法及应用，具体说也属于生物兽药技术领域，本疫苗含有对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白VP19抗原基因和囊膜蛋白VP28抗原基因。同时本疫苗含有PVAX1.0载体。
背景技术
对虾白斑综合症(White spot syndrome)是由对虾白斑综合症病毒(White spotsyndrome Virus,WSSV)引起的对虾暴发性传染病，自20世纪90年代初在亚洲地区发生以来，至今已经席卷了各国的对虾养殖地区，造成了巨大的经济损失。WSSV是一类具囊膜的无包涵体杆状病毒，属于Nimaviridea科，是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，WSSV病毒DNA有290KD，有181个ORF，包括39个结构性蛋白和9个膜蛋白,其中主要包括VP15、VP19、VP24、VP26、VP28和VP35等蛋白。其宿主范围广，感染对虾的死亡率高达100％。
目前，虽然对白斑综合症病毒的基因组和蛋白质组有较深入的研究，但仍无有效的治疗药物和治疗方法，因此针对对虾白斑综合症疫病的主要方法还在于预防。近年的研究表明，对虾存在类免疫机制，尽管不能够产生抗体，没有免疫记忆，但先天性免疫系统同样能在被感染后产生有效而快速的免疫反应，从而有效保护它们免受微生物的侵袭。但是，目前还没有可用于对虾白斑综合症病毒增殖的细胞系，所以对于病毒的保存和增殖有很大的困难，所以在疫苗研制方面也面临非常大的挑战。
发明内容
本发明的目的提供一种预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法及应用，以克服现有技术的不足。二价DNA疫苗技术来源于普通DNA疫苗，其原理是将针对对虾白斑病毒两个重要膜蛋白功能区域蛋白基因克隆于同一真核表达载体中，从而实现针对同一个病原的两个不同抗原蛋白的表达。将这种二价DNA疫苗导入所要免疫的动物体内，免疫效果优于普通DNA疫苗及两种DNA疫苗的联合免疫，且更加安全、方便、有效。本发明将WSSV的VP28、VP19基因串联克隆为融合基因，克隆至Pvax1.0真核表达载体，制备多价基因DNA疫苗，可有效的提高DNA疫苗的保护效果，为对虾抗WSSV的DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。
为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法及应用的处理方案，具体如下：
准备实验动物：把南美白对虾喂养在100cm长、50cm高、30cm宽的水槽中，用不含有任合抗病的饲料进行饲养。虾在水槽中饲养7天以上以备用，随机挑取3条虾用PCR方法进行病毒排除检测。
准备质粒与菌株：pMD18-T载体为大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品；pET-28a(+)质粒、pVAX1.0质粒为本实验室购买；大肠杆菌BL21由本实验室保存。
准备工具酶与主要试剂：rTaq酶、DL2000Marker、限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ、T4-DNA连接酶、胶回收试剂盒均购自大连宝生物(TaKaRa)公司。
准备仪器设备：PCR扩增仪，该PCR扩增仪型号为PC48HY-8，为德国Biometra公司产品；凝胶成像仪，该凝胶成像仪型号为BAD Digital，为德国Biometra公司产品；转速≥13000rpm的高速冷冻离心机；微量可调移液器及配套带吸头；电泳仪，该电泳仪型号为DYY-8C，为北京市六一仪器厂产品；空气浴摇床，该空气浴摇床型号为THZ，为江苏太仓市实验设备厂产品。
一种预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法，步骤如下：
步骤1：设计白斑病毒VP19和VP28基因扩增引物，具体如下：
1.依据VP19基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(1-1)上游引物：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCC为BamHⅠ；
(1-2)下游引物：5-GAATTCTTACTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
2.依据VP28基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(2-1)上游引物：5-AGAGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
(2-2)下游引物：5-CACAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC-3，其中划线处的AAGCTT为XhoⅠ；
步骤2：白斑病毒总DNA的提取，具体如下：
使用DNA提取试剂盒，对病料虾组织的DNA进行提取；
步骤3：白斑病毒VP19的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(1-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(1-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25；充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃的条件下进行4min的预变性；在94℃条件下进行变性1min，并在55℃的条件下退火1min；在72℃的条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约375bp的特异性目的条带，与预计的大小一致；
如图9所示，在本步骤中进行退火的装置为中空的罩体101，该中空的罩体101的上端安装着反应物入口通道111与反应物出口通道112，于中空的罩体101中另外带有同外界相导通的引导杆102，所述的引导杆102两端带有贯通槽，而所述的引导杆102插进中空的罩体101中，所述的引导杆102的数量为两个以上，均竖直插进中空的罩体101中，而且插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，于中空的罩体101的下端带有杂质出口，在进行退火期间，所述的反应物出口通道112同吸气装置经由两端带有贯通槽的杆件相连，这样将反应管中的反应物经过反应物入口通道111送进中空的罩体101后，于吸气装置生成的反向力下，外界气流由引导杆102亦导进到中空的罩体101中，由此进入的反应物于中空的罩体101中同外界气流搅合在一起，凭借若干所述的引导杆102，因为插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，防止导进中空的罩体101的反应物阻塞引导杆102，外界气流到达中空的罩体101中的各种高度，各自对进入的反应物实现了层进式的搅合；这样被带走热量的反应物在反向力下导进吸气装置中，最后经过吸气装置返回反应管，高效实现退火，退火效果好并且结构简单；
步骤4：白斑病毒VP28的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(2-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(2-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，DNA模板的体积份数6，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25，充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃条件下进行4min预变性；在94℃条件下变性1min，在55℃条件下退火1min；在72℃条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约633bp的特异性目的条带，与预计的大小一致。
步骤5：白斑病毒VP19基因和VP28基因片段的克隆，具体如下：
1.PCR产物的回收
将体积份数为10的VP19基因和VP28基因的PCR产物经琼脂糖电泳检测，在紫外灯下切下特异性目的条带，用胶回收试剂盒进行回收和纯化；
2.回收产物与T载体的连接和转化
将纯化的VP19基因和VP28基因PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化受体菌E.coli DH5a，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基平板上，于37℃的温箱中倒置培养12～16h；
3.重组质粒的酶切鉴定
随机挑取LB平板上的白色单菌落，接种于4mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h，用质粒抽提试剂盒进行常规小量质粒的提取，对所提质粒pMD18-T-VP19基因用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ进行酶切鉴定，如图2所示，对质粒pMD18-T-VP28基因EcoR、Xho Ⅰ进行酶切鉴定，如图3所示，以确定质粒构建成功；
步骤6：VP19基因和VP28基因测序与序列分析，具体如下：
经限制性内切酶鉴定均为阳性--的克隆,进行测序，测序结果经DNA star分子生物学软件分析,分别与GenBank VP19基因和VP28基因的序列进行核苷酸序列同源性分析；
步骤7：VP19和VP28基因原核表达重组质粒的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP19和原核载体pET-28a(+),EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和原核载体pET-28a(+)，分别回收目的基因VP19和pET-28a(+)大片段，目的基因VP28和pET-28a(+)大片段构建成pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28重组表达质粒，具体质粒的提取、酶切回收、连接、转化、鉴定等步骤同步骤5，挑选单克隆菌落，于恒温摇床上37℃振荡培养，提取质粒，并用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图4所示，以确定质粒构建成功；
步骤8：重组表达质粒pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28在大肠杆菌中的表达，具体如下：
挑选经过鉴定为阳性的菌落接种于含卡钠青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养过夜，次日按照1:100比例转接于新的LB培养基中，在37℃下振荡培养至对数生长期，测定OD600在0.3～0.5时，开始用1mM IPTG进行诱导，分别收集0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的菌液各1mL，表达产物用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，结果表明包括VP19和VP28成熟蛋白基因片段表达蛋白大小分别为13.6KD和22KD，与理论推算值基本一致；
步骤9：DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD-18-T-VP19和疫苗载体pVAX1.0，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和疫苗载体pVAX1.0，分别回收目的基因VP19和pVAX1.0大片段，目的基因VP28和pVAX1.0大片段构建成pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28重组表达质粒，pVAX1.0-VP19质粒用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定，如图5所示，还有pVAX1.0-VP28质粒EcoRⅠ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图6所示，以确定质粒构建成功；
步骤10：多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建，具体如下：
1.依据克隆得到的WSSV vp19基因序列，重新设计一对引物，上游含有BamHⅠ酶切位点，下游含有EcoR Ⅰ酶切位点，去除终止密码子，所得如下：
P1：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCCAT为BamHⅠ；
P2：5-GAATTCCTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTCC为EcoR Ⅰ；
然后以pMD18-T-VP19质粒为模板，P1，P2为特异引物，PCR法扩增出VP19-2基因，回收纯化，然后将它克隆到pMD18-T克隆载体，记为pMD18-T-VP192；
2.多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建
分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pMD18-T-VP192质粒和pVAX1.0空质粒，回收PVAX1.0空质粒大片段和VP192小片段，连接构建pVAX1.0-VP192质粒，然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pVAX1.0-VP192质粒和pMD18-T-VP28质粒，连接构建pVAX1.0-VP19-VP28质粒，如图7所示，以确定质粒构建成功。
接着进行对DNA疫苗在虾体内表达情况的检测，具体如下
1.口服饲料的制备
取pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28保存的菌种分别进行培养得到菌液，将得到的菌液3L 6000g离心10min，得到菌体，称量菌体重量。将菌体收集到玻璃瓶中，放入超低温冰箱中，待其完全冻结后取出，室温使其融化，反复3次，以反复冻融法灭活菌体。将灭活菌体以1：4的比例拌入饲料中，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，为尽量避免包裹于饲料表面的灭活菌很快融入水中，将饲料包裹蛋清，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，将制得的饲料以2g/包的量分装好，备用。
2.DNA疫苗在虾体内RT-PCR检测
试验共分为4组，每组10尾虾，分别口服pVAX1.0-VP19疫苗、pVAX1.0-VP28疫苗、pVAX1.0-VP19-VP28疫苗和空白对照组，分别在免疫10d和20d取3尾虾的虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，如图8所示。结果表明，构建的pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28三组重组质粒分别免疫对虾，在免疫10d和20d取虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因。在各实验组中，分别扩增出与VP28基因和VP19基因大小相吻合的条带，非免疫组未能检测到。结果表明VP19、VP28基因重组质粒和与两个基因融合的重组质粒均能在虾鳃中转录出mRNA。
接着进行多价DNA疫苗免疫保护性实验，具体如下：
1.试验动物分组
试验共分为5组，每组20尾虾，随机分组，淘汰体重过低或过高的虾，平均体重约10±0.5g。各组分别为非感染非免疫对照组、感染非免疫对照组、pVAX1.0-VP19组、pVAX1.0-VP28组、pVAX1.0-VP19-VP28组。分别投喂制备的各组饵料，每日3次，每次4g。
2.病毒液处理
将确认感染对虾白斑病毒的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺，取头胸部组织进行口服传代感染，经传代3次，将人工接种WSSV死亡的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺,取头胸部称重,与0.01mol/L，PBS(pH7.4)1:5(g/L)稀释,玻璃匀浆器匀浆,匀浆液3000r/min离心20min,上清液依次用滤纸和0.45μm滤膜过滤除菌,-30℃冻存备用。
3.对虾攻毒及相对保护率计算
在饲料投喂20天后，每只虾分别进行WSSV攻毒(口服1ml病毒液)每天观察虾的情况。相对保护率(％)＝(1-实验组死亡率/对照组死亡率)×100％。
各实验组结果显示：非感染非免疫对照组没有死亡对虾，而感染非免疫对照组死亡率为80％，pVAX1.0-VP19组死亡率为60％，而相对保护率为25％，pVAX1.0-VP28组死亡率为55％，而相对保护率为31.25％，pVAX1.0-VP19-VP28组死亡率为45％，而相对保护率为43.75％。数据表明对虾在口服疫苗免疫后，攻毒第5天出现高死亡率，而在第8天对虾死亡趋于稳定，而免疫pVAX1.0-VP19-VP28疫苗组死亡率低于pVAX1.0-VP19组和pVAX1.0-VP28组，表明多价疫苗的抗WSSV保护性效果比单价疫苗效果好。
本发明将WSSV的VP28、VP19基因串联克隆至Pvax1.0真核表达载体，制备的DNA疫苗经对虾口服免疫10d和20d后都可以在虾鳃中检测到VP28基因和VP19基因的表达，经RT-PCR扩增显示经口服免疫20d后的表达量高于免疫10d的抗原基因表达量，说明口服免疫也可以在对虾体内进行表达，口服疫苗的时间长一点可以有效提高其免疫保护性。DNA疫苗在动物保护性实验中显示，所构建的DNA疫苗对感染WSSV的对虾具有良好的保护效果，其中pVAX1.0-VP19-VP28多价疫苗的保护性效果比单价疫苗效果好。本发明还具有如下优点：在二价DNA疫苗制备过程中，所使用方法简单，实验可操作性强，所建立的双基因融合蛋白表达，可以有效提高保护效果；同时在制备口服饲料时，操作性强，省时省力。
附图说明
图1为本发明的实施例的VP19基因、VP28基因的RT-PCR产物电泳分析结果图。
图2为本发明的实施例的PMD18-T-VP19重组质粒双酶切鉴定的结果图。图3为本发明的实施例的PMD18-T-VP28重组质粒双酶切鉴定的结果图。
图4为本发明的实施例的pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28重组质粒双酶切鉴定的结果图。
图5为本发明的实施例的PVAX1.0-VP19重组质粒双酶切鉴定的结果图。图6为本发明的实施例的PVAX1.0-VP28重组质粒双酶切鉴定的结果图。
图7为本发明的实施例的PVAX1.0-VP19-VP28重组质粒双酶切鉴定的结果图。
图8为本发明的实施例的RT-PCR法检测DNA疫苗pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28在对虾体内的表达的结果图。
图9为本发明的退火装置的结构示意图。
具体实施方式
随着分子生物学和现代生物技术的发展，DNA疫苗以其独特的优势显示其在未来动物疫病控制中的诱人前景。DNA疫苗是一种在重组疫苗后兴起的新型疫苗，其原理是将疫苗抗原基因克隆于一真核表达载体中，随后将该重组载体导入所要免疫的动物体中，疫苗抗原蛋白在动物体细胞内可以持续表达合成，从而刺激机体的免疫系统，达到免疫保护目的。对虾白斑病毒抗原基因的克隆是基因工程疫苗及核酸疫苗研究的基础。研究表明，囊膜蛋白膜蛋白在病毒的感染机制中非常重要，膜蛋白可以识别和黏附宿主细胞表面的细胞受体、在病毒组装的过程中与宿主细胞膜融合等,一部分中和抗体可以与病毒囊膜结合,从而可以阻断病毒粒子与细胞表面的附着或者病毒的脱壳作用。本发明利用分子生物学技术将膜蛋白基因串联，制备多价基因DNA疫苗，旨在增强疫苗的免疫保护效果。
目前，对于白斑综合症表面抗原基因的研究很多，Van Hulten等报道，囊膜蛋白vp28与对虾白斑综合症病毒吸附与入侵中起关键作用。Li证明将VP(19+28)的融合蛋白作为抗原，免疫兔子制备该融合蛋白的抗血清，并在螯虾体内检测抗血清对抗WSSV感染的保护能力,结果抗血清中和组在第20天仍无死亡，而WSSV粗提液感染的阳性对照组死亡率为84％，说明高效价的病毒抗血清对实验螯虾有较好的保护作用。Rajeev等指出用VP19、VP28基因进行免疫，对虾具有很好的抗WSSV保护性。但是构建多价DNA疫苗还未见报道。
同时，DNA疫苗虽然已经取得了长足的进步和发展，但是目前DNA疫苗中所应用的载体质粒只是应用于实验室研究和动物实验，pVAX1.0的出现为解决这一难题提供了可能，它是由美国食品和药品管理委员会(FDA)推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。所以，利用PVAX1.0载体构建DNA疫苗为今后的临床试验奠定基础。迄今为止，关于pVAX1.0的研究已涉及动物和临床试验。
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法，步骤如下：
步骤1：设计白斑病毒VP19和VP28基因扩增引物，具体如下：
1.依据VP19基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(1-1)上游引物：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCC为BamHⅠ；
(1-2)下游引物：5-GAATTCTTACTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
2.依据VP28基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(2-1)上游引物：5-AGAGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
(2-2)下游引物：5-CACAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC-3，其中划线处的AAGCTT为XhoⅠ；
步骤2：白斑病毒总DNA的提取，具体如下：
使用DNA提取试剂盒，对病料虾组织的DNA进行提取；
步骤3：白斑病毒VP19的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(1-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(1-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25；充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃的条件下进行4min的预变性；在94℃条件下进行变性1min，并在55℃的条件下退火1min；在72℃的条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约375bp的特异性目的条带，与预计的大小一致；
如图9所示，在本步骤中进行退火的装置为中空的罩体101，该中空的罩体101的上端安装着反应物入口通道111与反应物出口通道112，于中空的罩体101中另外带有同外界相导通的引导杆102，所述的引导杆102两端带有贯通槽，而所述的引导杆102插进中空的罩体101中，所述的引导杆102的数量为两个以上，均竖直插进中空的罩体101中，而且插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，于中空的罩体101的下端带有杂质出口，在进行退火期间，所述的反应物出口通道112同吸气装置经由两端带有贯通槽的杆件相连，这样将反应管中的反应物经过反应物入口通道111送进中空的罩体101后，于吸气装置生成的反向力下，外界气流由引导杆102亦导进到中空的罩体101中，由此进入的反应物于中空的罩体101中同外界气流搅合在一起，凭借若干所述的引导杆102，因为插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，防止导进中空的罩体101的反应物阻塞引导杆102，外界气流到达中空的罩体101中的各种高度，各自对进入的反应物实现了层进式的搅合；这样被带走热量的反应物在反向力下导进吸气装置中，最后经过吸气装置返回反应管，高效实现退火，退火效果好并且结构简单；
步骤4：白斑病毒VP28的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(2-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(2-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，DNA模板的体积份数6，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25，充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃条件下进行4min预变性；在94℃条件下变性1min，在55℃条件下退火1min；在72℃条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约633bp的特异性目的条带，与预计的大小一致。
步骤5：白斑病毒VP19基因和VP28基因片段的克隆，具体如下：
1.PCR产物的回收
将体积份数为10的VP19基因和VP28基因的PCR产物经琼脂糖电泳检测，在紫外灯下切下特异性目的条带，用胶回收试剂盒进行回收和纯化；
2.回收产物与T载体的连接和转化
将纯化的VP19基因和VP28基因PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化受体菌E.coli DH5a，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基平板上，于37℃的温箱中倒置培养12h；
3.重组质粒的酶切鉴定
随机挑取LB平板上的白色单菌落，接种于4mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h，用质粒抽提试剂盒进行常规小量质粒的提取，对所提质粒pMD18-T-VP19基因用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ进行酶切鉴定，如图2所示，对质粒pMD18-T-VP28基因EcoR、Xho Ⅰ进行酶切鉴定，如图3所示，以确定质粒构建成功；
步骤6：VP19基因和VP28基因测序与序列分析，具体如下：
经限制性内切酶鉴定均为阳性--的克隆,进行测序，测序结果经DNA star分子生物学软件分析,分别与GenBank VP19基因和VP28基因的序列进行核苷酸序列同源性分析；
步骤7：VP19和VP28基因原核表达重组质粒的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP19和原核载体pET-28a(+),EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和原核载体pET-28a(+)，分别回收目的基因VP19和pET-28a(+)大片段，目的基因VP28和pET-28a(+)大片段构建成pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28重组表达质粒，具体质粒的提取、酶切回收、连接、转化、鉴定等步骤同步骤5，挑选单克隆菌落，于恒温摇床上37℃振荡培养，提取质粒，并用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图4所示，以确定质粒构建成功；
步骤8：重组表达质粒pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28在大肠杆菌中的表达，具体如下：
挑选经过鉴定为阳性的菌落接种于含卡钠青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养过夜，次日按照1:100比例转接于新的LB培养基中，在37℃下振荡培养至对数生长期，测定OD600在0.3时，开始用1mM IPTG进行诱导，分别收集0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的菌液各1mL，表达产物用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，结果表明包括VP19和VP28成熟蛋白基因片段表达蛋白大小分别为13.6KD和22KD，与理论推算值基本一致；
步骤9：DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD-18-T-VP19和疫苗载体pVAX1.0，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和疫苗载体pVAX1.0，分别回收目的基因VP19和pVAX1.0大片段，目的基因VP28和pVAX1.0大片段构建成pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28重组表达质粒，pVAX1.0-VP19质粒用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定，如图5所示，还有pVAX1.0-VP28质粒EcoRⅠ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图6所示，以确定质粒构建成功；
步骤10：多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建，具体如下：
1.依据克隆得到的WSSV vp19基因序列，重新设计一对引物，上游含有BamHⅠ酶切位点，下游含有EcoR Ⅰ酶切位点，去除终止密码子，所得如下：
P1：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCCAT为BamHⅠ；
P2：5-GAATTCCTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTCC为EcoR Ⅰ；
然后以pMD18-T-VP19质粒为模板，P1，P2为特异引物，PCR法扩增出VP19-2基因，回收纯化，然后将它克隆到pMD18-T克隆载体，记为pMD18-T-VP192；
2.多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建
分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pMD18-T-VP192质粒和pVAX1.0空质粒，回收PVAX1.0空质粒大片段和VP192小片段，连接构建pVAX1.0-VP192质粒，然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pVAX1.0-VP192质粒和pMD18-T-VP28质粒，连接构建pVAX1.0-VP19-VP28质粒，如图7所示，以确定质粒构建成功。
接着进行对DNA疫苗在虾体内表达情况的检测，具体如下
1.口服饲料的制备
取pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28保存的菌种分别进行培养得到菌液，将得到的菌液3L 6000g离心10min，得到菌体，称量菌体重量。将菌体收集到玻璃瓶中，放入超低温冰箱中，待其完全冻结后取出，室温使其融化，反复3次，以反复冻融法灭活菌体。将灭活菌体以1：4的比例拌入饲料中，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，为尽量避免包裹于饲料表面的灭活菌很快融入水中，将饲料包裹蛋清，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，将制得的饲料以2g/包的量分装好，备用。
2.DNA疫苗在虾体内RT-PCR检测
试验共分为4组，每组10尾虾，分别口服pVAX1.0-VP19疫苗、pVAX1.0-VP28疫苗、pVAX1.0-VP19-VP28疫苗和空白对照组，分别在免疫10d和20d取3尾虾的虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，如图8所示。结果表明，构建的pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28三组重组质粒分别免疫对虾，在免疫10d和20d取虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因。在各实验组中，分别扩增出与VP28基因和VP19基因大小相吻合的条带，非免疫组未能检测到。结果表明VP19、VP28基因重组质粒和与两个基因融合的重组质粒均能在虾鳃中转录出mRNA。
接着进行多价DNA疫苗免疫保护性实验，具体如下：
1.试验动物分组
试验共分为5组，每组20尾虾，随机分组，淘汰体重过低或过高的虾，平均体重约10±0.5g。各组分别为非感染非免疫对照组、感染非免疫对照组、pVAX1.0-VP19组、pVAX1.0-VP28组、pVAX1.0-VP19-VP28组。分别投喂制备的各组饵料，每日3次，每次4g。
2.病毒液处理
将确认感染对虾白斑病毒的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺，取头胸部组织进行口服传代感染，经传代3次，将人工接种WSSV死亡的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺,取头胸部称重,与0.01mol/L，PBS(pH7.4)1:5(g/L)稀释,玻璃匀浆器匀浆,匀浆液3000r/min离心20min,上清液依次用滤纸和0.45μm滤膜过滤除菌,-30℃冻存备用。
3.对虾攻毒及相对保护率计算
在饲料投喂20天后，每只虾分别进行WSSV攻毒(口服1ml病毒液)每天观察虾的情况。相对保护率(％)＝(1-实验组死亡率/对照组死亡率)×100％。
各实验组结果显示：非感染非免疫对照组没有死亡对虾，而感染非免疫对照组死亡率为80％，pVAX1.0-VP19组死亡率为60％，而相对保护率为25％，pVAX1.0-VP28组死亡率为53％，而相对保护率为32.25％，pVAX1.0-VP19-VP28组死亡率为41％，而相对保护率为45.15％。数据表明对虾在口服疫苗免疫后，攻毒第5天出现高死亡率，而在第8天对虾死亡趋于稳定，而免疫pVAX1.0-VP19-VP28疫苗组死亡率低于pVAX1.0-VP19组和pVAX1.0-VP28组，表明多价疫苗的抗WSSV保护性效果比单价疫苗效果好。
实施例2
预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法，步骤如下：
步骤1：设计白斑病毒VP19和VP28基因扩增引物，具体如下：
1.依据VP19基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(1-1)上游引物：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCC为BamHⅠ；
(1-2)下游引物：5-GAATTCTTACTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
2.依据VP28基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(2-1)上游引物：5-AGAGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
(2-2)下游引物：5-CACAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC-3，其中划线处的AAGCTT为XhoⅠ；
步骤2：白斑病毒总DNA的提取，具体如下：
使用DNA提取试剂盒，对病料虾组织的DNA进行提取；
步骤3：白斑病毒VP19的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(1-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(1-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25；充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃的条件下进行4min的预变性；在94℃条件下进行变性1min，并在55℃的条件下退火1min；在72℃的条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约375bp的特异性目的条带，与预计的大小一致；
如图9所示，在本步骤中进行退火的装置为中空的罩体101，该中空的罩体101的上端安装着反应物入口通道111与反应物出口通道112，于中空的罩体101中另外带有同外界相导通的引导杆102，所述的引导杆102两端带有贯通槽，而所述的引导杆102插进中空的罩体101中，所述的引导杆102的数量为两个以上，均竖直插进中空的罩体101中，而且插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，于中空的罩体101的下端带有杂质出口，在进行退火期间，所述的反应物出口通道112同吸气装置经由两端带有贯通槽的杆件相连，这样将反应管中的反应物经过反应物入口通道111送进中空的罩体101后，于吸气装置生成的反向力下，外界气流由引导杆102亦导进到中空的罩体101中，由此进入的反应物于中空的罩体101中同外界气流搅合在一起，凭借若干所述的引导杆102，因为插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，防止导进中空的罩体101的反应物阻塞引导杆102，外界气流到达中空的罩体101中的各种高度，各自对进入的反应物实现了层进式的搅合；这样被带走热量的反应物在反向力下导进吸气装置中，最后经过吸气装置返回反应管，高效实现退火，退火效果好并且结构简单；
步骤4：白斑病毒VP28的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(2-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(2-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，DNA模板的体积份数6，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25，充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃条件下进行4min预变性；在94℃条件下变性1min，在55℃条件下退火1min；在72℃条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约633bp的特异性目的条带，与预计的大小一致。
步骤5：白斑病毒VP19基因和VP28基因片段的克隆，具体如下：
1.PCR产物的回收
将体积份数为10的VP19基因和VP28基因的PCR产物经琼脂糖电泳检测，在紫外灯下切下特异性目的条带，用胶回收试剂盒进行回收和纯化；
2.回收产物与T载体的连接和转化
将纯化的VP19基因和VP28基因PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化受体菌E.coli DH5a，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基平板上，于37℃的温箱中倒置培养14h；
3.重组质粒的酶切鉴定
随机挑取LB平板上的白色单菌落，接种于4mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h，用质粒抽提试剂盒进行常规小量质粒的提取，对所提质粒pMD18-T-VP19基因用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ进行酶切鉴定，如图2所示，对质粒pMD18-T-VP28基因EcoR、Xho Ⅰ进行酶切鉴定，如图3所示，以确定质粒构建成功；
步骤6：VP19基因和VP28基因测序与序列分析，具体如下：
经限制性内切酶鉴定均为阳性--的克隆,进行测序，测序结果经DNA star分子生物学软件分析,分别与GenBank VP19基因和VP28基因的序列进行核苷酸序列同源性分析；
步骤7：VP19和VP28基因原核表达重组质粒的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP19和原核载体pET-28a(+),EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和原核载体pET-28a(+)，分别回收目的基因VP19和pET-28a(+)大片段，目的基因VP28和pET-28a(+)大片段构建成pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28重组表达质粒，具体质粒的提取、酶切回收、连接、转化、鉴定等步骤同步骤5，挑选单克隆菌落，于恒温摇床上37℃振荡培养，提取质粒，并用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图4所示，以确定质粒构建成功；
步骤8：重组表达质粒pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28在大肠杆菌中的表达，具体如下：
挑选经过鉴定为阳性的菌落接种于含卡钠青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养过夜，次日按照1:100比例转接于新的LB培养基中，在37℃下振荡培养至对数生长期，测定OD600在0.4时，开始用1mM IPTG进行诱导，分别收集0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的菌液各1mL，表达产物用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，结果表明包括VP19和VP28成熟蛋白基因片段表达蛋白大小分别为13.6KD和22KD，与理论推算值基本一致；
步骤9：DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD-18-T-VP19和疫苗载体pVAX1.0，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和疫苗载体pVAX1.0，分别回收目的基因VP19和pVAX1.0大片段，目的基因VP28和pVAX1.0大片段构建成pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28重组表达质粒，pVAX1.0-VP19质粒用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定，如图5所示，还有pVAX1.0-VP28质粒EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图6所示，以确定质粒构建成功；
步骤10：多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建，具体如下：
1.依据克隆得到的WSSV vp19基因序列，重新设计一对引物，上游含有BamHⅠ酶切位点，下游含有EcoR Ⅰ酶切位点，去除终止密码子，所得如下：
P1：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCCAT为BamH Ⅰ；
P2：5-GAATTCCTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTCC为EcoR Ⅰ；
然后以pMD18-T-VP19质粒为模板，P1，P2为特异引物，PCR法扩增出VP19-2基因，回收纯化，然后将它克隆到pMD18-T克隆载体，记为pMD18-T-VP192；
2.多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建
分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pMD18-T-VP192质粒和pVAX1.0空质粒，回收PVAX1.0空质粒大片段和VP192小片段，连接构建pVAX1.0-VP192质粒，然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pVAX1.0-VP192质粒和pMD18-T-VP28质粒，连接构建pVAX1.0-VP19-VP28质粒，如图7所示，以确定质粒构建成功。
接着进行对DNA疫苗在虾体内表达情况的检测，具体如下
1.口服饲料的制备
取pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28保存的菌种分别进行培养得到菌液，将得到的菌液3L 6000g离心10min，得到菌体，称量菌体重量。将菌体收集到玻璃瓶中，放入超低温冰箱中，待其完全冻结后取出，室温使其融化，反复3次，以反复冻融法灭活菌体。将灭活菌体以1：4的比例拌入饲料中，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，为尽量避免包裹于饲料表面的灭活菌很快融入水中，将饲料包裹蛋清，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，将制得的饲料以2g/包的量分装好，备用。
2.DNA疫苗在虾体内RT-PCR检测
试验共分为4组，每组10尾虾，分别口服pVAX1.0-VP19疫苗、pVAX1.0-VP28疫苗、pVAX1.0-VP19-VP28疫苗和空白对照组，分别在免疫10d和20d取3尾虾的虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，如图8所示。结果表明，构建的pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28三组重组质粒分别免疫对虾，在免疫10d和20d取虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因。在各实验组中，分别扩增出与VP28基因和VP19基因大小相吻合的条带，非免疫组未能检测到。结果表明VP19、VP28基因重组质粒和与两个基因融合的重组质粒均能在虾鳃中转录出mRNA。
接着进行多价DNA疫苗免疫保护性实验，具体如下：
1.试验动物分组
试验共分为5组，每组20尾虾，随机分组，淘汰体重过低或过高的虾，平均体重约10±0.5g。各组分别为非感染非免疫对照组、感染非免疫对照组、pVAX1.0-VP19组、pVAX1.0-VP28组、pVAX1.0-VP19-VP28组。分别投喂制备的各组饵料，每日3次，每次4g。
2.病毒液处理
将确认感染对虾白斑病毒的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺，取头胸部组织进行口服传代感染，经传代3次，将人工接种WSSV死亡的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺,取头胸部称重,与0.01mol/L，PBS(pH7.4)1:5(g/L)稀释,玻璃匀浆器匀浆,匀浆液3000r/min离心20min,上清液依次用滤纸和0.45μm滤膜过滤除菌,-30℃冻存备用。
3.对虾攻毒及相对保护率计算
在饲料投喂20天后，每只虾分别进行WSSV攻毒(口服1ml病毒液)每天观察虾的情况。相对保护率(％)＝(1-实验组死亡率/对照组死亡率)×100％。
各实验组结果显示：非感染非免疫对照组没有死亡对虾，而感染非免疫对照组死亡率为80％，pVAX1.0-VP19组死亡率为60％，而相对保护率为25％，pVAX1.0-VP28组死亡率为55％，而相对保护率为31.25％，pVAX1.0-VP19-VP28组死亡率为45％，而相对保护率为43.75％。数据表明对虾在口服疫苗免疫后，攻毒第5天出现高死亡率，而在第8天对虾死亡趋于稳定，而免疫pVAX1.0-VP19-VP28疫苗组死亡率低于pVAX1.0-VP19组和pVAX1.0-VP28组，表明多价疫苗的抗WSSV保护性效果比单价疫苗效果好。
实施例3
预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法，步骤如下：
步骤1：设计白斑病毒VP19和VP28基因扩增引物，具体如下：
1.依据VP19基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(1-1)上游引物：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCC为BamHⅠ；
(1-2)下游引物：5-GAATTCTTACTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
2.依据VP28基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(2-1)上游引物：5-AGAGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
(2-2)下游引物：5-CACAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC-3，其中划线处的AAGCTT为XhoⅠ；
步骤2：白斑病毒总DNA的提取，具体如下：
使用DNA提取试剂盒，对病料虾组织的DNA进行提取；
步骤3：白斑病毒VP19的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(1-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(1-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25；充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃的条件下进行4min的预变性；在94℃条件下进行变性1min，并在55℃的条件下退火1min；在72℃的条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约375bp的特异性目的条带，与预计的大小一致；
如图9所示，在本步骤中进行退火的装置为中空的罩体101，该中空的罩体101的上端安装着反应物入口通道111与反应物出口通道112，于中空的罩体101中另外带有同外界相导通的引导杆102，所述的引导杆102两端带有贯通槽，而所述的引导杆102插进中空的罩体101中，所述的引导杆102的数量为两个以上，均竖直插进中空的罩体101中，而且插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，于中空的罩体101的下端带有杂质出口，在进行退火期间，所述的反应物出口通道112同吸气装置经由两端带有贯通槽的杆件相连，这样将反应管中的反应物经过反应物入口通道111送进中空的罩体101后，于吸气装置生成的反向力下，外界气流由引导杆102亦导进到中空的罩体101中，由此进入的反应物于中空的罩体101中同外界气流搅合在一起，凭借若干所述的引导杆102，因为插进中空的罩体101中的竖直方向的高度不相等，防止导进中空的罩体101的反应物阻塞引导杆102，外界气流到达中空的罩体101中的各种高度，各自对进入的反应物实现了层进式的搅合；这样被带走热量的反应物在反向力下导进吸气装置中，最后经过吸气装置返回反应管，高效实现退火，退火效果好并且结构简单；
步骤4：白斑病毒VP28的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(2-1)的上游引物(40pmol)的体积份数为1.5，(2-2)的下游引物(40pmol)的体积份数为1.5，dNTP(各10mM)的体积份数为2，DNA模板的体积份数6，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25，充分混匀，将反应管至于PCR仪器中，在94℃条件下进行4min预变性；在94℃条件下变性1min，在55℃条件下退火1min；在72℃条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min，取体积份数为10的PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如图1所示，结果显示约633bp的特异性目的条带，与预计的大小一致。
步骤5：白斑病毒VP19基因和VP28基因片段的克隆，具体如下：
1.PCR产物的回收
将体积份数为10的VP19基因和VP28基因的PCR产物经琼脂糖电泳检测，在紫外灯下切下特异性目的条带，用胶回收试剂盒进行回收和纯化；
2.回收产物与T载体的连接和转化
将纯化的VP19基因和VP28基因PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化受体菌E.coli DH5a，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基平板上，于37℃的温箱中倒置培养16h；
3.重组质粒的酶切鉴定
随机挑取LB平板上的白色单菌落，接种于4mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h，用质粒抽提试剂盒进行常规小量质粒的提取，对所提质粒pMD18-T-VP19基因用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ进行酶切鉴定，如图2所示，对质粒pMD18-T-VP28基因EcoR、Xho Ⅰ进行酶切鉴定，如图3所示，以确定质粒构建成功；
步骤6：VP19基因和VP28基因测序与序列分析，具体如下：
经限制性内切酶鉴定均为阳性--的克隆,进行测序，测序结果经DNA star分子生物学软件分析,分别与GenBank VP19基因和VP28基因的序列进行核苷酸序列同源性分析；
步骤7：VP19和VP28基因原核表达重组质粒的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP19和原核载体pET-28a(+),EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和原核载体pET-28a(+)，分别回收目的基因VP19和pET-28a(+)大片段，目的基因VP28和pET-28a(+)大片段构建成pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28重组表达质粒，具体质粒的提取、酶切回收、连接、转化、鉴定等步骤同步骤5，挑选单克隆菌落，于恒温摇床上37℃振荡培养，提取质粒，并用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图4所示，以确定质粒构建成功；
步骤8：重组表达质粒pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28在大肠杆菌中的表达，具体如下：
挑选经过鉴定为阳性的菌落接种于含卡钠青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养过夜，次日按照1:100比例转接于新的LB培养基中，在37℃下振荡培养至对数生长期，测定OD600在0.5时，开始用1mM IPTG进行诱导，分别收集0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的菌液各1mL，表达产物用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，结果表明包括VP19和VP28成熟蛋白基因片段表达蛋白大小分别为13.6KD和22KD，与理论推算值基本一致；
步骤9：DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28的构建，具体如下：
分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD-18-T-VP19和疫苗载体pVAX1.0，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和疫苗载体pVAX1.0，分别回收目的基因VP19和pVAX1.0大片段，目的基因VP28和pVAX1.0大片段构建成pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28重组表达质粒，pVAX1.0-VP19质粒用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定，如图5所示，还有pVAX1.0-VP28质粒EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，如图6所示，以确定质粒构建成功；
步骤10：多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建，具体如下：
1.依据克隆得到的WSSV vp19基因序列，重新设计一对引物，上游含有BamHⅠ酶切位点，下游含有EcoR Ⅰ酶切位点，去除终止密码子，所得如下：
P1：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCCAT为BamHⅠ；
P2：5-GAATTCCTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTCC为EcoR Ⅰ；
然后以pMD18-T-VP19质粒为模板，P1，P2为特异引物，PCR法扩增出VP19-2基因，回收纯化，然后将它克隆到pMD18-T克隆载体，记为pMD18-T-VP192；
2.多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建
分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pMD18-T-VP192质粒和pVAX1.0空质粒，回收PVAX1.0空质粒大片段和VP192小片段，连接构建pVAX1.0-VP192质粒，然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pVAX1.0-VP192质粒和pMD18-T-VP28质粒，连接构建pVAX1.0-VP19-VP28质粒，如图7所示，以确定质粒构建成功。
接着进行对DNA疫苗在虾体内表达情况的检测，具体如下
1.口服饲料的制备
取pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28保存的菌种分别进行培养得到菌液，将得到的菌液3L 6000g离心10min，得到菌体，称量菌体重量。将菌体收集到玻璃瓶中，放入超低温冰箱中，待其完全冻结后取出，室温使其融化，反复3次，以反复冻融法灭活菌体。将灭活菌体以1：4的比例拌入饲料中，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，为尽量避免包裹于饲料表面的灭活菌很快融入水中，将饲料包裹蛋清，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变。待饲料干后，将制得的饲料以2g/包的量分装好，备用。
2.DNA疫苗在虾体内RT-PCR检测
试验共分为4组，每组10尾虾，分别口服pVAX1.0-VP19疫苗、pVAX1.0-VP28疫苗、pVAX1.0-VP19-VP28疫苗和空白对照组，分别在免疫10d和20d取3尾虾的虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，如图8所示。结果表明，构建的pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28三组重组质粒分别免疫对虾，在免疫10d和20d取虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因。在各实验组中，分别扩增出与VP28基因和VP19基因大小相吻合的条带，非免疫组未能检测到。结果表明VP19、VP28基因重组质粒和与两个基因融合的重组质粒均能在虾鳃中转录出mRNA。
接着进行多价DNA疫苗免疫保护性实验，具体如下：
1.试验动物分组
试验共分为5组，每组20尾虾，随机分组，淘汰体重过低或过高的虾，平均体重约10±0.5g。各组分别为非感染非免疫对照组、感染非免疫对照组、pVAX1.0-VP19组、pVAX1.0-VP28组、pVAX1.0-VP19-VP28组。分别投喂制备的各组饵料，每日3次，每次4g。
2.病毒液处理
将确认感染对虾白斑病毒的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺，取头胸部组织进行口服传代感染，经传代3次，将人工接种WSSV死亡的对虾去除附肢、甲壳和肝胰腺,取头胸部称重,与0.01mol/L，PBS(pH7.4)1:5(g/L)稀释,玻璃匀浆器匀浆,匀浆液3000r/min离心20min,上清液依次用滤纸和0.45μm滤膜过滤除菌,-30℃冻存备用。
3.对虾攻毒及相对保护率计算
在饲料投喂20天后，每只虾分别进行WSSV攻毒(口服1ml病毒液)每天观察虾的情况。相对保护率(％)＝(1-实验组死亡率/对照组死亡率)×100％。
各实验组结果显示：非感染非免疫对照组没有死亡对虾，而感染非免疫对照组死亡率为80％，pVAX1.0-VP19组死亡率为60％，而相对保护率为25％，pVAX1.0-VP28组死亡率为56％，而相对保护率为30.15％，pVAX1.0-VP19-VP28组死亡率为41.2％，而相对保护率为47.11％。数据表明对虾在口服疫苗免疫后，攻毒第5天出现高死亡率，而在第8天对虾死亡趋于稳定，而免疫pVAX1.0-VP19-VP28疫苗组死亡率低于pVAX1.0-VP19组和pVAX1.0-VP28组，表明多价疫苗的抗WSSV保护性效果比单价疫苗效果好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法，其特征在于，步骤如下：
步骤1：设计白斑病毒VP19和VP28基因扩增引物，具体如下：
A.依据VP19基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(1-1)上游引物：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCC为BamHⅠ；
(1-2)下游引物：5-GAATTCTTACTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
B.依据VP28基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：
(2-1)上游引物：5-AGAGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC-3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；
(2-2)下游引物：5-CACAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC-3，其中划线处的AAGCTT为XhoⅠ；
步骤2：白斑病毒总DNA的提取，具体如下：
使用DNA提取试剂盒，对病料虾组织的DNA进行提取；
步骤3：白斑病毒VP19的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(1-1)的上游引物为40pmol，体积份数为1.5，(1-2)的下游引物为40pmol，体积份数为1.5，dNTP各10mM，体积份数为2，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25；充分混匀，将反应管置于PCR仪器中，在94℃的条件下进行4min的预变性；在94℃条件下进行变性1min，并在55℃的条件下退火1min；在72℃的条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min；
在本步骤中进行退火的装置为中空的罩体(101)，该中空的罩体(101)的上端安装着反应物入口通道(111)与反应物出口通道(112)，于中空的罩体(101)中另外带有同外界相导通的引导杆(102)，所述的引导杆(102)两端带有贯通槽，而所述的引导杆(102)插进中空的罩体(101)中，所述的引导杆(102)的数量为两个以上，均竖直插进中空的罩体(101)中，而且插进中空的罩体(101)中的竖直方向的高度不相等，于中空的罩体(101)的下端带有杂质出口，在进行退火期间，所述的反应物出口通道(112)同吸气装置经由两端带有贯通槽的杆件相连，这样将反应管中的反应物经过反应物入口通道(111)送进中空的罩体(101)后，于吸气装置生成的反向力下，外界气流由引导杆(102)亦导进到中空的罩体(101)中，由此进入的反应物于中空的罩体(101)中同外界气流搅合在一起，凭借若干所述的引导杆(102)，因为插进中空的罩体(101)中的竖直方向的高度不相等，防止导进中空的罩体(101)的反应物阻塞引导杆(102)，外界气流到达中空的罩体(101)中的各种高度，各自对进入的反应物实现了层进式的搅合；这样被带走热量的反应物在反向力下导进吸气装置中，最后经过吸气装置返回反应管；
步骤4：白斑病毒VP28的PCR扩增，具体如下：
反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(2-1)的上游引物为40pmol，体积份数为1.5，(2-2)的下游引物为40pmol，体积份数为1.5，dNTP各10mM，体积份数为2，DNA模板的体积份数6，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25，充分混匀，将反应管置于PCR仪器中，在94℃条件下进行4min预变性；在94℃条件下变性1min，在55℃条件下退火1min；在72℃条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min；
步骤5：白斑病毒VP19基因和VP28基因片段的克隆，具体如下：
A.PCR产物的回收
将体积份数为10的VP19基因和VP28基因的PCR产物经琼脂糖电泳检测，在紫外灯下切下特异性目的条带，用胶回收试剂盒进行回收和纯化；
B.回收产物与T载体的连接和转化
将纯化的VP19基因和VP28基因PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化受体菌E.coliDH5a，涂布于含氨苄青霉素100μg/mL的LB固体培养基平板上，于37℃的温箱中倒置培养16h；
C.重组质粒的酶切鉴定
随机挑取LB平板上的白色单菌落，接种于4mL含氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h，用质粒抽提试剂盒进行常规小量质粒的提取，对所提质粒pMD18-T-VP19基因用BamHⅠ、EcoRⅠ进行酶切鉴定，对质粒pMD18-T-VP28基因EcoR、XhoⅠ进行酶切鉴定，以确定质粒构建成功；
步骤6：VP19基因和VP28基因测序与序列分析，具体如下：
经限制性内切酶鉴定均为阳性--的克隆,进行测序，测序结果经DNA star分子生物学软件分析,分别与GenBank VP19基因和VP28基因的序列进行核苷酸序列同源性分析；
步骤7：VP19和VP28基因原核表达重组质粒的构建，具体如下：
分别用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP19和原核载体pET-28a(+),EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和原核载体pET-28a(+)，分别回收目的基因VP19和pET-28a(+)大片段，目的基因VP28和pET-28a(+)大片段构建成pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28重组表达质粒，具体质粒的提取、酶切回收、连接、转化、鉴定步骤同步骤5，挑选单克隆菌落，于恒温摇床上37℃振荡培养，提取质粒，并用BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，以确定质粒构建成功；
步骤8：重组表达质粒pET-28a(+)-VP19和pET-28a(+)-VP28在大肠杆菌中的表达，具体如下：
挑选经过鉴定为阳性的菌落接种于含卡钠青霉素100μg/ml的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养过夜，次日按照1:100比例转接于新的LB培养基中，在37℃下振荡培养至对数生长期，测定OD600在0.5时，开始用1mM IPTG进行诱导，分别收集0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的菌液各1mL，表达产物用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定，结果表明包括VP19和VP28成熟蛋白基因片段表达蛋白大小分别为13.6KD和22KD，与理论推算值基本一致；
步骤9：DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28的构建，具体如下：
分别用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切克隆质粒载体pMD-18-T-VP19和疫苗载体pVAX1.0，EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切克隆质粒载体pMD18-T-VP28和疫苗载体pVAX1.0，分别回收目的基因VP19和pVAX1.0大片段，目的基因VP28和pVAX1.0大片段构建成pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28重组表达质粒，pVAX1.0-VP19质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定，还有pVAX1.0-VP28质粒EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，以确定质粒构建成功；
步骤10：多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建，具体如下：
A.依据克隆得到的WSSV vp19基因序列，重新设计一对引物，上游含有BamHⅠ酶切位点，下游含有EcoRⅠ酶切位点，去除终止密码子，所得如下：
P1：5-GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC-3，其中划线处的GGATCCAT为BamHⅠ；
P2：5-GAATTCCTGCCTCCTCTTGGGGT-3，其中划线处的GAATTCC为EcoRⅠ；
然后以pMD18-T-VP19质粒为模板，P1，P2为特异引物，PCR法扩增出VP19-2基因，回收纯化，然后将它克隆到pMD18-T克隆载体，记为pMD18-T-VP192；
B.多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0-VP19-VP28的构建
分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD18-T-VP192质粒和pVAX1.0空质粒，回收PVAX 1.0空质粒大片段和VP192小片段，连接构建pVAX1.0-VP192质粒，然后用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pVAX1.0-VP192质粒和pMD18-T-VP28质粒，连接构建pVAX1.0-VP19-VP28质粒，以确定质粒构建成功；
接着进行对DNA疫苗在虾体内表达情况的检测，具体如下：
A.口服饲料的制备：
取pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28保存的菌种分别进行培养得到菌液，将得到的菌液3L 6000g离心10min，得到菌体，称量菌体重量，将菌体收集到玻璃瓶中，放入超低温冰箱中，待其完全冻结后取出，室温使其融化，反复3次，以反复冻融法灭活菌体；将灭活菌体以1：4的比例拌入饲料中，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变，待饲料干后，为尽量避免包裹于饲料表面的灭活菌很快融入水中，将饲料包裹蛋清，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变，待饲料干后，将制得的饲料以2g/包的量分装好，备用；
B.DNA疫苗在虾体内RT-PCR检测：
试验共分为4组，每组10尾虾，分别口服pVAX1.0-VP19疫苗、pVAX1.0-VP28疫苗、pVAX1.0-VP19-VP28疫苗和空白对照组，分别在免疫10d和20d取3尾虾的虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，结果表明，构建的pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28三组重组质粒分别免疫对虾，在免疫10d和20d取虾鳃，用RT-PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，在各实验组中，分别扩增出与VP28基因和VP19基因大小相吻合的条带，非免疫组未能检测到，结果表明VP19、VP28基因重组质粒和与两个基因融合的重组质粒均能在虾鳃中转录出mRNA。
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