CN113384691B

CN113384691B - 以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒e2蛋白重组亚单位疫苗及其制备方法

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Publication number: CN113384691B
Application number: CN202110655536.7A
Authority: CN
Inventors: 余兴龙; 丁彦彬; 赵墩; 喻晓航; 罗烨; 罗灵芝; 郑金; 刘江鹰
Original assignee: Hunan Wubang Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Wubang Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113384691A

Abstract

一种以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗，其包括猪瘟病毒E2蛋白和具有佐剂效应的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellum的融合蛋白，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，该融合蛋白制得的疫苗经肌肉注射和滴鼻免疫动物后，发现本疫苗不仅能产生特异性的细胞免疫和体液免疫，同时又能够在血清和黏膜分泌物中分别产生高水平的抗原特异性IgG和sIgA，能用于体内CSFV的清除及口鼻引起的黏膜接触传播。本疫苗既能产生针对CSFV的细胞和体液的免疫保护，同时又能产生黏膜免疫保护，可用于CSFV的净化，具有广阔的应用前景。

Description

以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用疫苗和兽用生物制品领域，涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellum)为分子佐剂的猪瘟病毒E2 蛋白重组亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种以发热拉稀，肠道发炎为主要症状的急性接触性传染疾病，具有高度传染性和致死性。目前流行地区或国家仍然采用接种弱毒疫苗的方法作为预防猪瘟的主要手段，猪瘟弱毒疫苗免疫的猪群无法与自然感染的猪瘟野毒从免疫学上区分开来，传统的 C株CSFV活疫苗，尽管效果稳定，但已经不能满足中国的猪瘟根除净化计划的需求，开发针出对CSFV的亚单位疫苗用于CSFV免疫净化具有重要意义。猪瘟病毒(CSFV)的囊膜糖蛋白E2，被认为是最具开发成CSFV 亚单位疫苗的结构蛋白，该蛋白参与病毒的感染过程并能够诱导机体产生保护性中和抗体，保护机体对抗CSFV的野毒感染，所以E2糖蛋白是CSFV 亚单位疫苗开发的首选蛋白。

CSFV的自然传播主要是主要通过被污染的饲料、饮水及器具，经口吃进后经扁桃体、口腔黏膜和呼吸道黏膜感染，病毒首先在扁桃体和淋巴结组织中繁殖，然后遍及全身，呈败血症过程。开发出能够产生针对阻断 CSFV口鼻、呼吸道等黏膜感染的特异性IgA的新型CSFV重组亚单位疫苗后，对CSFV防控和净化具有重要意义。然而，目前市面上的杆状病毒表达的E2重组亚单位疫苗均不能产生针对CSFV黏膜免疫保护的IgA抗体。

天然免疫通过特殊的模式识别受体(PRRS)检测病原体相关分子模式 (PAMPs)来识别病原体的入侵，TOLL样受体(TLRs)样受体在天然免疫的激活和病原体的识别中起着重要的作用，其中TLR5受体与其配体细菌鞭毛蛋白Flagellum相结合，可以激活适应性免疫应答。呼吸道、胃肠道疾病和生殖道等的上皮细胞分布有大量的TLR5，当鞭毛蛋白与抗原混合后经鼻内给药，在黏膜分泌物和血清中产生高水平的抗原特异性sIgA。此外，TLR5与鞭毛蛋白的结合通过刺激淋巴结巨噬细胞产生浆细胞生长因子而直接促进浆细胞分化，诱导Th2应答提高体液免疫应答和特异性 IgG抗体水平。所以，鞭毛蛋白可作为一种有效的粘膜佐剂，主要通过与抗原直接混合或与抗原融合表达的方式用于增强抗原免疫力，鞭毛蛋白是疫苗配方中一种很好的佐剂，已经被广泛使用。

发明内容

本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种以沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellum)为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗及其制备方法，该疫苗既能产生CSFV细胞和体液免疫保护，同时又能产生黏膜免疫保护。

为达上述目的，本发明采用的技术方案是：一种以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗，其包括融合蛋白，该融合蛋白包括猪瘟病毒E2蛋白和具有佐剂效应的沙门氏菌鞭毛蛋白 Flagellum，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共 2373bp。

上述疫苗还包括GEL01佐剂，该GEL01佐剂与融合蛋白的体积比为 1:4。

本发明同时提供上述以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2 蛋白重组亚单位疫苗的制备方法，该方法步骤如下：

(1)以CSFV 2.1c株的E2蛋白基因及肠炎鼠伤寒杆菌菌株(Enterica serovarTyphimurium strain)的鞭毛蛋白Flagellum基因为基础，合成E2 与Flagellum蛋白的融合表达基因片段E2-Flagellum，该E2-Flagellum基因片段序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)通过基因克隆将E2-Flagellum基因克隆至哺乳动物细胞表达载体 pKS001的HindⅢ和EcoRⅠ中，构建重组表达载体pKS001-E2-Flagellum；

具体地，重组表达载体pKS001-E2-Flagellum的构建过程为：以合成的E2-Flagellum基因片段为模板进行PCR扩增，扩增引物为E2-Flagellum-F： 5'-AAGCTTGCCACCATGGTGCTGAGGGGCCAGGTGGTG-3'(SEQ ID NO.2)， E2-Flagellum-RP：5'-GAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCTCA-3'(SEQ ID NO.3)；使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对扩增片段进行酶切，回收目的片段；使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对pKS001质粒进行酶切；将目的片段(E2-Flagellum基因片段)与酶切后的pKS001质粒进行连接；

(3)将重组表达载体pKS001-E2-Flagellum转化表达细胞株，获得 E2-Flagellum蛋白；其中，该表达细胞株为哺乳动物细胞株CHO-K1Q；

(4)将E2-Flagellum蛋白与GEL01佐剂按体积比4:1混匀。

哺乳动物表达系统相较杆状病毒表达系统，具有更加完善的翻译后糖基化、乙酰化、磷酸化等修饰系统，可以表达结构更加复杂的结构蛋白，其表达的抗原通常具有更好的免疫效果。本发明以CSFV的E2蛋白和沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellum为基础，使用哺乳动物细胞CHO表达出E2和 Flagellum的融合蛋白E2-Flagellum，配合商品化佐剂进行乳化，经过肌肉注射和滴鼻免疫动物后，发现该疫苗不仅可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫，同时又能够在血清和黏膜分泌物中产生高水平的抗原特异性IgA，本E2-Flagellum疫苗为一种既能产生针对CSFV的细胞和体液免疫保护，同时又能产生黏膜免疫保护的E2重组亚单位疫苗，可用于CSFV的净化，具有良好的应用前景。

本发明的有益效果如下：

1.借助真核表达系统，以融合表达的形式表达出E2-Flagellum蛋白，属于首次发明。

2.动物免疫及攻毒保护实验说明，本发明的E2-Flagellum疫苗不仅可以产生细胞免疫、体液免疫，同时可以产生黏膜免疫用于阻断CSFV的口鼻接触传播。

3.本发明的联合疫苗E2-Flagellum疫苗经过肌肉注射免疫接种后，相比单独的E2疫苗，可以产生更高水平的特异性的IgG保护抗体，属于 Flagellum的免疫调节增强现象，Flagellum能用于E2蛋白的免疫增强。

附图说明

图1是本发明重组表达载体pKS001-E2-Flagellum的构建示意图。

图2是本发明重组蛋白E2-Flagellum基因片段的PCR扩增结果，

其中，M:DNA分子mark；泳道1，2，3：E2-Flagellum PCR扩增产物。

图3是本发明E2-Flagellum基因克隆转化子鉴定结果，

其中，M:DNA分子mark；泳道1，2，3，4：pKS001-E2-Flagellum转化子。

图4是本发明稳定细胞株表达上清中E2-Flagellum蛋白的WB鉴定结果，

其中，泳道1：正常CHO-K1Q细胞的表达上清；泳道2：纯化的 CHO-K1Q-E2-Flagellum细胞株(6H2单克隆细胞株)表达上清；M:彩虹 180蛋白mark。

图5是本发明CHO-K1Q-E2-Flagellum细胞株(6H2单克隆细胞株) 表达上清纯化结果，

其中，泳道1，2，3：6H2单克隆细胞株表达上清纯化的E2-Flagellum 蛋白；M:彩虹180蛋白mark。

图6是本发明血清中E2抗体阻断率水平检测结果图。

图7是本发明肺脏及气管灌洗液的sIgA抗体水平的检测结果图。

图8是本发明外周血中CD3⁺/CD4⁺及CD3⁺/CD8⁺T细胞检测结果图。

图9是本发明外周血中IL-4及IFN-γ的表达水平检测结果图。

图10是本发明使用C株进行攻毒后兔子发热情况。

具体实施方式

实施例1表达载体构建及蛋白制备

本发明以CSFV 2.1株(GenBank accession:JX262391)的E2蛋白基因及肠炎鼠伤寒杆菌菌株(Enterica serovar Typhimurium strain)(GenBank accession:CP007581.1)的鞭毛蛋白Flagellum基因为基础，设计E2与 Flagellum蛋白的融合表达序列E2-Flagellum(序列如SEQ ID NO.1所示，共2373bp)，其中E2去掉了C端的跨膜区域，Flagellum蛋白的D3区以破伤风毒素的(P2)T细胞表位QYIKANSKFIGITEL进行替换，E2与 Flagellum之间使用刚性Linker(EAAAK)连接，融合蛋白的尾端添加6×HIS 标签，最终的基因序列送南京金斯瑞生物公司进行密码子优化合成。

设计PCR扩增引物，以合成的E2-Flagellum基因片段作为模板，扩增出E2-Flagellum重组基因，通过基因克隆将E2-Flagellum基因克隆至哺乳动物细胞表达载体pKS001的HindⅢ和EcoRⅠ中，构建出重组表达载体 pKS001-E2-Flagellum，具体构建示意图见图1，提取无内毒素的重组表达载体pKS001-E2-Flagellum，借助电穿孔转染设备，将pKS001-E2-Flagellum 质粒转染至哺乳动物细胞CHO-K1Q(

CHO-K1Q)中，构建稳定表达E2-Flagellum蛋白的CHO-K1Q稳定细胞株，发酵所构建的CHO-K1Q 细胞株，表达纯化获得E2-Flagellum蛋白，用于后期疫苗的制备和使用。

1.重组表达载体pKS001-E2-Flagellum的构建

1.1 PCR扩增及基因片段的酶切

设计引物E2-Flagellum-FP： 5'-AAGCTTGCCACCATGGTGCTGAGGGGCCAGGTGGTG-3'(SEQ ID NO.2)和E2-Flagellum-RP： 5'-GAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCTCA-3'(SEQ IDNO.3)，以上述合成的E2-Flagellum基因(SEQ ID NO.1)作为模板进行PCR扩增，扩增出E2-Flagellum重组基因，扩增的基因片段长度为2373bp，结果见图 2，回收PCR扩增片段。

使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对回收的E2-Flagellum基因片段于37℃酶切3h，酶切体系(240μL)：E2-Flagellum基因片段120μL、 HindⅢ6μL、EcoRⅠ6μL、10×Kbuffer24μL，水补充至240μL。酶切后回收目的片段。

1.2重组质粒的克隆转化

1)复苏培养转化有pKS001质粒的DH5α重组克隆菌，使用LB培养基培养100mL菌液，37℃180rpm条件下培养12h后使用质粒提取试剂盒提取pKS001。

2)使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对提取的pKS001质粒于37℃酶切3h，酶切体系(120μL)：pKS001质粒60μL、HindⅢ3μL、EcoRⅠ3μL、 10×Kbuffer12μL、水42μL。将酶切前、酶切后的pKS001分别进行核酸电泳，确定pKS001被切开，回收酶切后载体片段。

3)使用DNAT4连接酶将E2-Flagellum基因片段与酶切后的pKS001 载体于22℃连接30min，连接体系为：pKS001载体2μL、E2-Flagellum的 PCR片段6μL、T4连接酶10μL、Ligase buffer2μL。

4)取E2-Flagellum与pKS001的连接产物10μL，轻轻加入放置在冰盒上的100μLTOP10感受态中，轻轻吹打混匀，将该混合物置于冰上30min。 42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3～5min。

5)加入500μL不含抗生素的LB培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养 1h。

6)将菌液5000rpm离心1min以沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余约50-100μL的培养液，重悬菌体，然后全部均匀涂布到含氨苄抗生素的 LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。

1.3阳性转化子的PCR鉴定

挑取pKS001-E2-Flagellum转化平板上的克隆菌落作为模板，以 E2-Flagellum-FP和E2-Flagellum-RP为鉴定引物，进行PCR扩增，将PCR 产物进行核酸电泳，具体如图3所示，条带大小与预期相符合，初步鉴定 pKS001-E2-Flagellum克隆菌克隆成功。

1.4重组质粒的抽提

1)使用LB培养基，接种pKS001-E2-Flagellum重组克隆菌200mL，培养37℃，180rpm，培养12h后，5000rpm 5min离心收集细菌，使用北京天根生物无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)进行质粒的抽提。

2)向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

3)取200mL过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3min 收集细菌，尽量吸除上清。尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。向留有菌体沉淀的离心管中加入8mL 溶液P1(已加入RNase A)，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

4)向离心管中加入8mL溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。

5)向离心管中加入8mL溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm 离心10min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL的管中。

6)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)。

7)室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6 重新放回收集管中。

8)向吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，8000 rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9)重复操作步骤8。

10)向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液。

11)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

12)将吸附柱CP6置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2mL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8000rpm 离心2min。将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃保存。

1.5对构建质粒进行基因测序

使用NdeI对抽提的重组质粒进行单酶切，使用切胶回收试剂盒，并切胶回收较小片段。以pKS001-fp:5'-AGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTT-3' (SEQ ID NO.4)和pKS001-rp: 5'-GCCGCCAGACATGATAAGATACATTG-3'(SEQ ID NO.5)为测序引物，将回收的基因片段，寄送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，验证克隆序列正确性。测序报告结果显示，所构建的pKS001-E2-Flagellum基因正确无误，基因克隆成功。

2.重组蛋白表达鉴定及蛋白的CHO稳定细胞系构建与筛选

所用试剂和仪器：CHO-K1Q细胞，MSX(24mM)，

CD04培养基，200mM(L-谷胺酰胺)，BTX-ECM830电转仪，标准4mm电转杯， QuaMono^TM CHO cloning培养基A，QuaMono^TMCHO cloning培养基 B,

CHO Feed02 Supplement补料，50mL康宁离心管，96孔细胞培养板(康宁)，24孔细胞培养板(康宁)，T25细胞培养瓶(康宁)，125mL 细胞摇瓶(康宁)，离心机，细胞计数板，pKS001-E2-Flagellum质粒，细胞培养箱(37℃，5％CO₂)，CO₂细胞培养摇床(37℃，5％CO₂)。

2.1细胞复苏及传代

使用预热的CD04培养基(添加4mM的L-谷胺酰胺)复苏1支 CHO-K1Q细胞，细胞复苏至125mL细胞摇瓶，培养体积为25mL，50mm 振幅CO₂摇床，37℃，5％CO₂，100rpm条件下进行培养。待培养至2-5 天，选择处于对数生长中期时(细胞密度约为2～3×10⁶cells/mL)CHO-K1Q 细胞进行传代，传代密度为5×10⁵cells/mL，放置50mm振幅CO₂摇床，37℃， 5％CO₂，100rpm条件下继续进行培养。开展电转实验前，按照以上方法对细胞进行连续3次传代。

2.2细胞转染

选择对数生长期CHO-K1Q细胞，密度达到2～3×10⁶cells/mL时， 180g/min离心5min收集细胞。使用新鲜的CD04培养基(添加4mM的 L-谷胺酰胺)重悬CHO-K1Q细胞，调整细胞密度为5×10⁶cells/mL。取50μg DNA的pKS001-E2-Flagellum质粒到4mm电转杯中，然后加入800μL密度为5×10⁶cells/mL的CHO-K1Q细胞。使用4mm电转杯，按照表1的电转参数进行电转实验。电转后静置电转杯5min，然后将细胞转移至T25 细胞培养瓶之中，并添加5mL的CD04培养基(添加4mM的L-谷胺酰胺)，轻轻吹打混匀，置入恒温箱中培养。

表1电转仪电转参数

项目	参数
		电压(U)	280V
脉冲次数(N)	1次
		脉冲时长(T)	3ms
脉冲间隔时长(interveral T)	5s

2.3初步MSX加压及筛选

静置培养以上转染细胞24h后，将T25细胞培养瓶之中的细胞转移至 50mL离心管，180g/min，5min离心收集细胞，弃掉上清，使用CD04培养基(含有25μM，MSX)重选细胞，按照1～2×10⁴cells/孔，200μL/孔体积，进行96孔板铺板。待细胞长至每孔的四分之一时，使用ELISA方法检测表达量，挑选高表达孔内细胞，转移富集到新的96孔板上继续培养。挑选高表达细胞池，进行放大培养(从24孔板至摇瓶逐步放大)。通过比较细胞生长，表达水平，倍增时间，情况筛选得到最优细胞池。

2.4单克隆挑选及增殖

1)使用CD04培养基(含有25μM，MSX)对筛选的最优表达细胞池进行传代和培养，培养细胞池密度至2～3×10⁶cells/mL，且细胞活率大于 95％。

2)将适量的细胞培养物置于24孔板中，使用CD04培养基，将细胞密度进行倍比稀释至200cells/mL。

3)使用QuaMono^TM CHO cloning培养基(按照CHO cloning Medium A: CHOcloning Medium B＝100：1比例进行配制)，倍比稀释至4cells/mL，视铺板效率决定细胞悬液总体积，用移液器吸取上述细胞液，按照120μL/ 孔，0.5个细胞/孔的标准进行铺板，每个克隆铺板不少于20块；

4)使用96孔扫描显微镜，对所有的克隆孔，进行逐一扫描拍照，筛选单克隆孔并进行标记。

5)置入恒温培养箱静置培养，第0天、第1天、第2天、第3天、第7天对单克隆细胞孔，进行扫描观察，拍照记录细胞生长情况。

6)第7天时，按照100μL/孔标准，添加CHO cloning Medium C(2 周后，单克隆细胞的汇合度可以达到1/2-1/3)。

7)一般为铺板后的14-15天后，待细胞长至每孔的四分之一(1/4) 时，挑选细胞生长状态良好、生长旺盛的细胞孔，转移到新的96孔板。

8)3天后，使用ELISA方法检测表达上清，根据检测结果，挑选适量高表达的细胞池，进行悬浮培养放大，冻存后作为构建的稳定转染细胞种子，其中单克隆、3C5株、7E7株、6H2株表达水平较高，且6H2株的表达量最高。

3.使用摇瓶进行稳定细胞株Fed-batch发酵表达

使用125mL的细胞摇瓶接种构建的CHO-K1Q稳定细胞株6H2，逐渐放大至500mL的摇瓶中进行培养，培养基选择CD04培养基。使用

CHO Feed02 Supplement补料进行补加营养，进行发酵培养，同时按照6g/L的标准补充葡萄糖。第0天开始取样，绘制细胞生长曲线，第3 天开始留样，进行后续统一产量检测，第14天时，细胞活率低于60％时收获。

4.表达上清的Western-boling鉴定

细胞株6H2悬浮发酵第4天，收集了1mL上清液，同时以正常培养的CHO-K1Q细胞培养上清CD04培养基液作为对照。取上清样品，各加入20μL的loadingbuffer和60μL的转染上清，煮沸5min，在提前制备12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶内上样，彩虹蛋白mark加入5μL，转染上清样品每孔加入10μL，120v电泳80min。将 MilliporePVDF(0.45μm)膜进行用甲醇浸泡1.5min预处理，后放置到转膜液浸泡5min。按照电压600v，电流300mA，时间为60min的条件转膜。使用1％明胶含量的PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)在4℃静止封闭过夜。使用封闭液稀释His-tag单克隆抗体(MAb)至终浓度0.1μg/mL，将PVDF膜，置于使用封闭液稀释好的一抗中，在37℃摇床上孵育1.5h，转速60rpm。使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)洗涤PVDF膜3次，每次洗涤10min。封闭液稀释HRP羊抗鼠二抗IgG至0.05μg/mL，将PVDF膜置于使用封闭液稀释的二抗中，37℃孵育1h。使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)洗涤 PVDF膜3次，每次洗涤10min。使用ECL溶液(Millipore)并将曝光液均匀滴加在PVDF膜上，借助成像系统(Bio-Rad)收集信号，并使用Image Lab软件4.0.1分析Western-boling结果，具体结果见图4，被曝光的 E2-Flagellum蛋白条带，与预期的106kDa大小完全相符合。

5.表达上清的纯化

收集细胞株6H2的培养混合物上清，低温高速离心8000rpm，5min，弃掉沉淀中的细胞，以11000rpm 4℃再次离心10min后收集上清。将以上收集上清培养物，使用0.45μm的滤膜过滤以后，使用5mL的TED-6FF-Ni 纯化柱进行纯化，流速为3mL/min。使用Tris缓冲液(pH8.0,50mM Tris-HCl， 0.2M Nacl)进行洗涤，每个样品按照3mL/min流速，洗涤10min，待基线拉平以后，使用500mM咪唑溶液(pH8.0,50mM Tris-HCl，0.2M Nacl， 500mMImidazole)进行梯度洗脱，待OD280出峰以后，按照0.8mL/管的标准收集纯化样品。对洗脱的样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果显示能够纯化获得纯度较高的E2-Flagellum蛋白，与预期的106kDa大小完全相符合，结合参见图5。

实施例2疫苗制备

将E2-Flagellum蛋白使用0.22μm滤膜进行除菌过滤，使用无菌PBS 缓冲液稀释至100μg/mL的浓度，使用无菌PBS缓冲液稀释GEL01佐剂 (Seppic)至40％浓度，使用搅拌子磁力搅拌佐剂相，不断边搅拌边滴等体积的抗原相，最终以佐剂与抗原按照1:4体积比混合搅拌均匀，制备的 E2-Flagellum亚单位疫苗(50μg/mL)，进行分装并4℃冷藏备用。

实施例3疫苗免疫实验

将购买的21只均重为2kg的新西兰雌性兔子，随机分为3组(A、B、 C组)。对A组兔子进行后腿肌肉注射1mL的本发明的E2-Flagellum亚单位疫苗，作为E2-Flagellum亚单元疫苗免疫组(简称E2-Flagellum组)，对B组兔子进行后腿肌肉注射1mL的E2亚单位疫苗(市购疫苗，浓度为 50μg/mL)，作为E2亚单元疫苗免疫组(简称E2组)，同时使用本 E2-Flagellum亚单位疫苗、E2亚单位疫苗分别对A组和B组兔子进行 500μL的滴鼻免疫，C组兔子进行后腿肌肉注射和鼻腔滴鼻1mL的PBS 作为免疫对照组(简称PBS组)。每间隔3周进行一次免疫(肌肉注射、滴鼻同时进行)，免疫2次，免疫后第0天、14天、21天、35天、42天，对所有兔子进行耳缘静脉采血，离心收集血清。

免疫后的第42天，对每个组中的3只兔子进行外周血采集，并进行抗凝血处理，便于后续流式细胞仪检测CD3⁺/CD4⁺、CD3⁺/CD8⁺T淋巴细胞以及血浆中IL-4及IFN-γ表达水平的检测，然后将该各组的3只兔子进行安乐死，解剖收集肺脏，使用10mL的PBS对肺脏进行灌洗，收集灌洗液，用于呼吸道黏膜sIgA的检测。

3.1免疫后特异性IgG和sIgA抗体的检测

3.1.1免疫后特异性IgG检测

免疫后第0天、14天、21天、35天、42天，对所有兔子进行耳缘静脉采血，220×g离心5min，离心收集血清。按照IDEXX的猪瘟抗ELISA 体检测试剂盒说明书，检测免疫后第0天、14天、21天、35天、42天的猪瘟E2 IgG抗体的阻断率，统计E2-Flagellum组、E2组及PBS组的抗体情况。结果表明，对照PBS组兔子的E2抗体为阴性，E2-Flagellum组和 E2组的抗体阻断逐渐上升，平均阻断率可以达到85％，具体见图6，通过肌肉注射接种途径，相比单独的E2疫苗，本E2-Flagellum疫苗能产生更高水平的IgG抗体。

3.1.2免疫后特异性sIgA检测

在免疫后的42天，解剖安乐死兔子肺脏，收集肺脏，使用10mL的PBS 对肺脏及气管进行灌洗，收集灌洗液，使用10kda超滤管，5000×g离心10 min，浓缩气管肺泡灌洗液至1mL。使用碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)将纯化的E2-Flagellum蛋白稀释至3μg/mL，按照每个孔中添加100μL的标准在96 孔酶标板中(Corning Costar)，4℃下包被24h。使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20，1％BSA)封闭包被板，37℃封闭60min，封闭后拍干备用。向每个孔中添加100μL浓缩后肺泡灌洗液，并抗原板在37℃下，孵育30min。使用 PBST(pH7.4，0.1％Tween20)洗涤4次后，加入HRP偶联的山羊抗猪IgA (1：20,000)并在37℃下孵育30min。使用PBST(pH7.4，0.1％Tween 20) 洗涤4次后，将50μL TMB底物,37℃下孵育15min。每孔添加到50μL终止溶液中，测定OD450，当OD450值大于0.2判定为抗体阳性，当OD450值小于或等于0.2判定为抗体阴性。具体结果见图7，结果表明，本E2-Flagellum疫苗滴鼻免疫后42天，呼吸道黏膜中，能够产生较高水平特异性sIgA抗体，而单独的E2组和PBS组均没有产生相应的特异性sIgA抗体，说明通过滴鼻免疫，本E2-Flagellum疫苗能产生高水平的sIgA抗体，该疫苗具有良好的黏膜免疫效果。

3.2免疫后CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺T细胞的检测

为了确定免疫后CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞的比率，免疫后的第42天，对前述的每个组的3只兔子进行外周血采集，并进行抗凝血处理，并使用小鼠淋巴细胞分离培养基分离淋巴细胞分离外周血淋巴细胞。将淋巴细胞悬浮液用Zombie NIR^TM荧光染料，PE抗兔CD8a，PerCP/ Cyanine5.5抗兔CD4⁺(BioLegend)PE抗兔CD3(BioLegend)，进行染色孵育。孵育后，使用BD FACSCalibur荧光激活细胞分选仪(BD Biosciences， San Jose，CA，USA)分析结果。分析结果如图8所示，相比PBS组， E2-Flagellum组、E2组均能够产生显著的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞水平，且E2-Flagellum免疫组产生的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞水平更高，CD3⁺CD4⁺的水平明显高于CD3⁺CD8⁺T细胞的水平，说明本发明的 E2-Flagellum疫苗能产生显著的细胞免疫应答。

3.3免疫后IL-4及IFN-γ表达水平的检测

为了确定免疫后外周血中IL-4及IFN-γ表达水平，免疫后的第42天，对前述的每个组的3只兔子进行外周血采集，并进行抗凝血处理，220g/min，离心5min，收集血浆上清。使用双抗体夹心原理的商品化ELISA试剂盒检测血浆中的IL-4及IFN-γ表达水平的检测。统计检测结果，具体如图9 所示，相比PBS组，E2-Flagellum组和E2组均能够产生明显的IL-4(Th2 细胞分泌，刺激产生体液免疫)及IFN-γ(Th1细胞分泌，刺激产生细胞免疫)，而相比E2组，E2-Flagellum组产生更高水平的IL-4及IFN-γ，说明本发明的E2-Flagellum疫苗能同时产生更强的细胞免疫和体液免疫。

3.4 E2-Flagellum疫苗的免疫保护实验

第一次免疫后42天，除安乐死的兔子外，对剩余的所有免疫组兔子耳缘静脉注射100RID50的C株CSFV商品化疫苗，攻毒前和攻毒后每天两次对兔的体温进行直肠监测，从攻毒后每12小时测量一次体温，体温升高1℃持续至少18h被视为典型发热，判定为不能抵抗CSFV病毒攻击，统计E2-Flagellum组、E2组、PBS组兔子的发热情况，评估本E2-Flagellum疫苗的免疫保护效果。攻毒结果见图10，E2-Flagellum组和E2组的4只兔子体温均不出现典型发生，攻毒后全部保护，但是E2-Flagellum组的攻毒后平均体温更低，而PBS组的4只兔子体温均出现典型发热，预示本发明的E2-Flagellum疫苗具有更好的免疫保护效果。

以上实验结果表明，本发明的以鞭毛蛋白Flagellum为分子佐剂的 E2-Flagellum疫苗，能同时产生细胞免疫、体液免疫、黏膜免疫， E2-Flagellum疫苗比单独的E2疫苗能产生更高水平的血清IgG抗体水平，而且刺激黏膜产生特异性sIgA，以兔子接种C株发热模型评估，本 E2-Flagellum疫苗能提供完全保护，且比单独的E2疫苗有更好的保护效果。

序列表

<110> 湖南兀邦生物科技有限公司

湖南农业大学

<120> 以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗及其制备方法

<130> 0007

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2373

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 1

atggtgctga ggggccaggt ggtgcagggc gtgatctggc tgctgctggt gaccggcgcc 60

cagggcaggc tgagctgcaa ggaggactac aggtacgcca tcagcagcac caacgagatc 120

ggccctctgg gcgccgaggg cctgaccacc acctggaagg agtacaacca cggcctgcag 180

ctggacgacg gcaccgtgag ggccatctgc accgccggca gcttcaaggt gaccgccctg 240

aacgtggtga gcaggaggta cctggccagc ctgcacaaga gggccctgcc taccagcgtg 300

accttcgagc tgctgttcga cggcaccacc cctgtggtgg aggagatggg cgacgacttc 360

ggcttcggcc tgtgcccttt cgacaccacc cctgtggtga agggcaagta caacaccacc 420

ctgctgaacg gcagcgcctt ctacctggtg tgccctatcg gctggaccgg cgtgatcgag 480

tgcaccgccg tgagccctac caccctgagg accgaggtgg tgaagacctt caagagggag 540

aagcctttcc ctcacagggt ggactgcgtg accaccatcg tggagaagga ggacctgttc 600

tactgcaagc tgggcggcaa ctggacctgc gtgaagggca accctgtggc ctacaccggc 660

ggccaggtga agcagtgcag gtggtgcggc ttcgacttca aggagcctga cggcctgcct 720

cactacccta tcggcaagtg catcctggcc aacgagaccg gctacagggt ggtggacagc 780

accgactgca acagggacgg cgtggtgatc agcaccgagg gcgagcacga gtgcctgatc 840

ggcaacacca ccgtgaaggt gcacgccctg gacggcaggc tggcccctat gccttgcagg 900

cctaaggaga tcgtgagcag cgccggccct gtgaggaaga ccagctgcac cttcaactac 960

accaagaccc tgaggaacaa gtactacgag cctagggaca gctacttcca gcagtacatg 1020

ctgaagggcg agtaccagta ctggttcgac gaggccgccg ccaaggccca ggtgatcaac 1080

accaacagcc tgagcctgct gacccagaac aacctgaaca agagccagag cgccctgggc 1140

accgccatcg agaggctgag cagcggcctg aggatcaaca gcgccaagga cgacgccgcc 1200

ggccaggcca tcgccaacag gttcaccgcc aacatcaagg gcctgaccca ggccagcagg 1260

aacgccaacg acggcatcag catcgcccag accaccgagg gcgccctgaa cgagatcaac 1320

aacaacctgc agagggtgag ggagctggcc gtgcagagcg ccaacagcac caacagccag 1380

agcgacctgg acagcatcca ggccgagatc acccagaggc tgaacgagat cgacagggtg 1440

agcggccaga cccagttcaa cggcgtgaag gtgctggccc aggacaacac cctgaccatc 1500

caggtgggcg ccaacgacgg cgagaccatc gacatcgacc tgaagcagat caacagccag 1560

accctgggcc tggacaccct gaacgtgcag cagaagtaca aggtgagcga caccgccgcc 1620

accgtgaccg gccagtacat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagctgctg 1680

cctgccaccg ccaccgagga cgtgaagaac gtgcaggtgg ccaacgccga cctgaccgag 1740

gccaaggccg ccctgaccgc cgccggcgtg accggcaccg ccagcgtggt gaagatgagc 1800

tacaccgaca acaacggcaa gaccatcgac ggcggcctgg ccgtgaaggt gggcgacgac 1860

tactacagcg ccacccagaa caaggacggc agcatcagca tcaacaccac caagtacacc 1920

gccgacgacg gcaccagcaa gaccgccctg aacaagctgg gcggcgccga cggcaagacc 1980

gaggtggtga gcatcggcgg caagacctac gccgccagca aggccgaggg ccacaacttc 2040

aaggcccagc ctgacctggc cgaggccgcc gccaccacca ccgagaaccc tctgcagaag 2100

atcgacgccg ccctggccca ggtggacacc ctgaggagcg acctgggcgc cgtgcagaac 2160

aggttcaaca gcgccatcac caacctgggc aacaccgtga acaacctgac cagcgccagg 2220

agcaggatcg aggacagcga ctacgccacc gaggtgagca acatgagcag ggcccagatc 2280

ctgcagcagg ccggcaccag cgtgctggcc caggccaacc aggtgcctca gaacgtgctg 2340

agcctgctga ggcaccacca ccaccaccac taa 2373

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 2

aagcttgcca ccatggtgct gaggggccag gtggtg 36

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 3

gaattcttag tggtggtggt ggtggtgcct ca 32

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 4

agactgttcc tttccatggg tctt 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 5

gccgccagac atgataagat acattg 26

Claims

1.一种以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗，其特征在于，其包括融合蛋白，该融合蛋白包括猪瘟病毒E2蛋白和具有佐剂效应的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellum，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括GEL01佐剂。

3.如权利要求2所述的以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中GEL01佐剂与融合蛋白的体积比为1:4。

4.一种以沙门氏菌鞭毛蛋白为分子佐剂的猪瘟病毒E2蛋白重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，该方法步骤如下：

(1)以CSFV 2.1株的E2蛋白基因及肠炎鼠伤寒杆菌菌株(Enterica serovarTyphimurium strain)的鞭毛蛋白Flagellum基因为基础，合成E2与Flagellum蛋白的融合表达基因片段E2-Flagellum，该E2-Flagellum基因片段序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)通过基因克隆将E2-Flagellum基因克隆至哺乳动物细胞表达载体pKS001的HindⅢ和EcoRⅠ中，构建重组表达载体pKS001-E2-Flagellum；

(3)将重组表达载体pKS001-E2-Flagellum转化表达细胞株，获得E2-Flagellum蛋白；

(4)将E2-Flagellum蛋白与GEL01佐剂按体积比1:4混匀。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中构建重组表达载体的步骤如下：

A.以合成的E2-Flagellum基因片段为模板进行PCR扩增；

B.使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对扩增片段进行酶切，回收E2-Flagellum基因片段；

C.使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对pKS001质粒进行酶切；

D.将E2-Flagellum基因片段与酶切后的pKS001质粒进行连接。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中扩增时的引物为：

E2-Flagellum-FP：5'-AAGCTTGCCACCATGGTGCTGAGGGGCCAGGTGGTG-3'，

E2-Flagellum-RP：5'-GAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCTCA-3'。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B中酶切体系包括E2-Flagellum基因片段120μL、HindⅢ6μL、EcoRⅠ6μL、10×Kbuffer24μL，水补充至240μL。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C中酶切体系包括pKS001质粒60μL、HindⅢ3μL、EcoRⅠ3μL、10×Kbuffer12μL及水42μL。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤D中连接体系包括pKS001载体2μL、E2-Flagellum的PCR片段6μL、T4连接酶10μL、Ligase buffer2μL。

10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的表达细胞株为哺乳动物细胞株CHO-K1Q。