CN103751774A - 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗与诊断试剂中的应用。具体地，表达猪瘟病毒E2蛋白重组细胞系为BCSFV-E2，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.7719。采用本发明所述的重组细胞系制备得到的猪瘟亚单位疫苗安全性高，免疫效果好，容易大规模生产，不易受外源病毒污染或抗体影响，对猪免疫不受母源抗体影响，而且本发明的猪瘟亚单位疫苗免疫猪后能诱导产生高水平猪瘟病毒中和抗体。此外，本发明还公开了一种构建重组哺乳动物细胞系的方法及制备猪瘟亚单位疫苗的方法，以及该重组细胞系表达的抗原在制备预防猪瘟疫苗及诊断试剂中的应用。

Description

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用，具体地，本发明涉及的重组细胞系是BCSFV-E2，其保藏编号为：CGMCC No.7719。本发明还公开了制备所述重组细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防猪瘟疫苗以及在制备诊断或检测猪瘟病毒感染试剂中的应用。属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。 

背景技术

猪瘟（Classical swine fever,CSF）又称猪霍乱（Hog cholera,HC）是由猪瘟病毒（Hog Cholera virus,HCV或Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性热性致死性疾病，猪瘟具有高度接触传染性，流行广泛，发病与死亡率高，危害极大。国际兽疫局(OIE)以前将其定为A类传染病，现将期列为通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。 

猪瘟在世界范围内都有发病流行，对养猪业危害极大。目前对该病的有效预防措施为疫苗免疫。其中由中国科学家研究成功的猪瘟弱毒疫苗（C株）对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被我国等多个国家使用。而且在此弱毒疫苗株的基础上开发出了乳兔苗，免脾淋苗，原代细胞苗及传代细胞苗等多种形式的弱毒疫苗。但组织苗的生产需要大量健康动物，生产过程中人工劳动强度大，成本高，有接种副反应等等这些不利因素影响了此类疫苗的实际应用。而以培养细胞繁殖弱毒生产疫苗同样也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中BVDV及抗体会干扰病毒生长，病毒抗原滴度难以提高，弱毒疫苗需要全程冷链保藏等等均导致弱毒疫苗的最终使用效果受到影响。而且所有弱毒疫苗在实际合用过程中均易受母源抗体影响，这也是导致免疫失败的因素之一。 

CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个大的多聚蛋白含3898个氨基酸残基，分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译 后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白有C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白为CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白可诱导产生病毒的中和抗体，是猪瘟病毒主要的免疫保护性抗原。也是研究猪瘟基因工程疫苗是重要靶蛋白。鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷与不足，以及随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗，大肠杆菌表达蛋白的亚单位疫苗，昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单疫苗。其中至目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。如Hulst[Hulst,et al.Cytotechnology,20(1-3):271-277]用20μg昆虫细胞表达的E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100LD50CSFV Brescia毒株强毒的攻击。该疫苗已于上世纪九十年代在欧洲批准上市，在欧洲国家的猪瘟根除计划中发挥了重要作用。但该疫苗是通过昆虫杆状病毒表达系统表达的，该表达系统相对原核表达系统而言，蛋白表达后可以在一定程度上进行翻译后加工与修饰。但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统。而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度。 

本研究组在本发明中探索了不同表达细胞系表达猪瘟病毒E2蛋白，并最终找到合适表达细胞系，克服了表达猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白对细胞毒性作用，以及建立了大规模筛选等技术。结果成功制备了表达猪瘟病毒结构蛋白E2蛋白细胞系。该细胞系表达E2蛋白表达量高，易于纯化,培养细胞表达抗原蛋白可以连续收获，易于生产。表达的E2蛋白抗原能对免疫猪诱导产生良好的免疫反应。该细胞系表达抗原所制备的疫苗可为猪瘟的预防提供新型、高效的预防制剂。对我国乃至世界范围内猪瘟的预防控制可以发挥重要作用。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种安全，高效的猪瘟亚单位疫苗。 

本发明的目的之二是提供一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。 

本发明的目的之三是提供一种构建上述稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞 系的方法。 

本发明的目的之四是将所述的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系应用于制备疫苗以预防猪瘟，或者将其用于制备成诊断或检测猪瘟病毒感染的试剂。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

本发明的一种猪瘟亚单位疫苗，其特征在于含有经稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白及佐剂。 

在本发明中，优选的，所述的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系是由以下方法构建得到： 

（1）构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中插入编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列； 

（2）将所述真核表达质粒转染BHK-21细胞； 

（3）经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养； 

（4）将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系。 

其中，更优选的，所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列如SEQ ID No．2所示。 

按照上述方法，本发明得到了一株能够稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系，命名为BCSFV-E2，分类命名为幼仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.7719，保藏时间为2013年6月18日。 

进一步的，本发明还提供了所述的重组哺乳动物细胞系或其培养物在制备预防猪瘟病毒病疫苗药物中的应用。及 

所述的重组哺乳动物细胞系或其培养物在制备诊断或检测猪瘟病毒感染试剂中的应用。 

更进一步的，本发明还提供了一种制备猪瘟亚单位疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤： 

（1）将本发明所述的重组哺乳动物细胞系BCSFV-E2正常传代后长至90%满时，换血清含量为1～2%的低血清培养基继续培养4-6d； 

（2）收获细胞培养上清液存于4℃，细胞上清液经截留分子量为50kD超滤浓 缩至E2抗原ELISA效价为1：160至1：320后，加入终浓度为0.02%硫柳汞，得到疫苗抗原液； 

（3）疫苗抗原液与佐剂按重量比为1：1进行混合并充分乳化，制备水包油包水型疫苗。 

在本发明中，优选的，所述的佐剂为MONTANIDE ISA206VG。 

本发明制备的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系，容易培养，增殖快速，可无限扩大，性质稳定，蛋白表达量高，表达蛋白与佐剂制备成疫苗后免疫猪能诱导动物机体产生高效价猪瘟病毒中和抗体，可抵抗猪瘟病毒感染。 

本发明的有益效果如下： 

1．将本发明的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞培养物制备疫苗可以诱导动物机体产生针对CSFV的高效价中和抗体，并能够在体内或体外中和CSFV，阻止病毒感染动物机体。 

2.本发明所选用的表达系统为BHK-21细胞，得到的重组细胞系BCSFV-E2具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；重组细胞系抗原表位量高，表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；重组细胞可以悬浮培养，高密度发酵培养，易于大量生产。 

3.本发明的重组表达细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低抗原或疫苗生产成本。 

4.本发明对抗原蛋白基因进行了基因密码子优化，有利于提高抗原表达量。 

5.利用本发明的重组表达细胞系细胞培养物制备的油佐剂疫苗能诱导动物机体产生高效价的病毒中和抗体，抗体持续时间长，能对免疫动物提供长久的有效的免疫保护。 

6.利用本发明重组细胞系表达抗原制备的疫苗免疫动物不产生猪瘟病毒E0蛋白抗体以及非结构蛋白抗体，可以利用检测猪瘟病毒E0蛋白抗体或非结构蛋白抗体来对疫苗免疫与病毒感染动物进行鉴别。 

7.本发明所制备的猪瘟疫苗不含病毒核酸，不能复制，无致病性，具有极高的生物安全性，疫苗免疫不受母源抗体或已经存在抗体干扰与影响。 

附图说明

图1为重组真核细胞表达质粒构建示意图； 

图2为转染后不同克隆细胞表达E2蛋白ELISA检测； 

图3为筛选克隆细胞系不同代次细胞表达E2蛋白ELISA检测； 

图4为重组细胞系表达CSFV E2蛋白IFA检测； 

A，克隆细胞第5代；B，克隆细胞第25代；C，正常BHK-21细胞对照； 

图5为免疫猪血清猪瘟病毒ELISA抗体检测； 

图6为重组细胞系表达E2蛋白为抗原间接ELISA检测猪血清中猪瘟病毒抗体结果。 

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。 

实施例1稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的构建及检测 

1材料与方法 

1.1质粒，菌株与细胞 

真核表达载体质粒pCAG-neo、DH5α感受态细胞和BHK-21细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存，质粒提取试剂盒和RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品，DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司，G418购自Gibco公司，胰酶购自Hyclone公司，Reverse Transcriptase M-MLV﹑PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase﹑Sal I﹑Xho I﹑BamH I﹑T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，抗CSFV E2蛋白单克隆抗体由本研究组制备，猪瘟病毒抗原ELISA检测试剂盒为Median Diagnostics公司产品，猪瘟病毒E2蛋白抗体ELISA检测试剂盒为IDEXX公司产品，FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥生物公司，HD Transfection Reagent转染试剂盒购于Roche公司。 

1.2重组表达质粒的构建 

opti-CSFV-E2基因为经真核细胞偏嗜性密码子优化的编码CSFV E2蛋白的基因。CSFV E2蛋白的氨基酸序列参考CSFV Shimen株（石门株）的蛋白序列(GenBank:AAC68902.2)，将该蛋白序列中E2蛋白第258位氨基酸V修改为氨基酸I，并且去除C端跨膜序列，得到的E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在设计该基因时，在起始密码子前加有Kozak序列与Sac I酶切位点与保护性碱基；在E2蛋白基因编码 末端加有终止子与Xho I酶切位点与保护性碱基。opti-CSFV-E2基因以及该基因特异性扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因opti-CSFV-E2大小为1089bp，两端含有Sac I﹑Xho I酶切位点，合成基因克隆在pUC57质粒中，序列如SEQ ID NO.2所示。真核表达载体pCAG-neo用Sac I﹑Xho I双酶切处理，然后与经Sac I与Xho I双切回收的opti-CSFV-E2基因在T4DNA连接酶作用下连接，转化DH5α感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用Sac I﹑Xho I双酶切对其进行鉴定；酶切鉴定阳性质粒命名为pCAGneo-opti-CSFV-E2，同时送生物公司进行测序验证。质粒构建示意图见图1。 

1.3细胞转染与筛选 

选生长状态良好的BHK-21细胞消化传代至24孔板中，待BHK-21细胞长至90%满时，按照

HD Transfection Reagent转染试剂盒操作说明用重组质粒pCAGneo-opti-CSFV-E2转染细胞。转染48h后加入含G418(1000μg/m L)选择性培养基进行加压培养，4d后将细胞用胰酶消化，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，5d后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目。挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔相继在24孔板、6孔板、细胞培养瓶中扩大培养，同时对各细胞进行IFA鉴定以及对表达蛋白进行ELISA检测。筛选IFA信号较强及表达抗原量高的细胞克隆。 

1.4克隆细胞表达E2蛋白的ELISA检测 

克隆细胞在24孔板中培养48h后，收集上清液，以未转染BHK-21细胞的培养上清液为对照，用CSFV抗原检测试剂盒检测克隆细胞上清培养液中E2蛋白，ELISA检测按试剂盒说明进行，测定OD450值，对各细胞克隆表达抗原进行相对定量比较筛选。 

1.5间接免疫荧光试验检测目的蛋白在转染细胞中的表达 

将克隆细胞接种至24孔或12孔板中，24h后去除培养液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，用含0.1%Triton X100的PBS作用细胞10min，PBS洗3次，用含4%BSA的PBS封闭2h，PBS洗1次，加入1:500稀释的抗E2蛋白单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入按1:200稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育2h，PBS洗3次，在荧光显微镜下观察结果。 

1.6克隆细胞的RT-PCR鉴定 

用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取10μL进行反转录,加入Oligo dT 1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV5×Buffer5μL，M-MLV转录酶1μL，dNTP（10m M）2.5μL，补加双蒸水至25μL，混合，42℃加热60min，95℃5min终止反应。然后利用opti-CSFV-E2基因特异性引物，PCR扩增目的基因。 

1.7重组细胞系表达稳定性检测 

为了检测重组细胞系的遗传稳定性与表达抗原的稳定性。将经比较筛选出的细胞克隆进行传代培养，取不同代次细胞进行表达E2蛋白的ELISA检测。同时对第5代与第25代细胞进行E2蛋白特异性单克隆抗体免疫荧光染色，辅以细胞核染色，荧光显微镜下观察阳性性细胞的比例。 

2结果 

2.1重组表达质粒的构建 

构建的重组表达质粒pCAGneo-opti-CSFV-E2的结构图见图1。提取的重组质粒经XhoΙ﹑SacΙ双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致，同时测序结果表明重组质粒中SacΙ﹑XhoΙ酶切位点间的序列和设计的编码E2蛋白的基因完全一致。 

2.2E2基因稳定表达细胞系的建立 

2.2.1转染细胞株的筛选 

细胞转染48h后，加入G418选择培养基,以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，7d后在倒置显微镜下挑选出含单个细胞集落的克隆并经IFA鉴定，筛选出5个阳性细胞克隆。 

2.2.2克隆细胞的RT-PCR鉴定 

利用RT-PCR对IFA鉴定阳性细胞克隆进行目的基因的扩增后，结果表明，对所筛选出的细胞克隆的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一致的目的条带。表明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。 

2.3.3表达细胞系的ELISA检测筛选 

根据免疫荧光检测的信号强弱以及细胞培养上清中表达E2抗原的ELISA检测结果，初步选出15个克隆细胞进行进一步比较培养上清液中CSFV E2蛋白抗原ELISA检测，结果表明经IFA筛选出的15个克隆中12号克隆所测得的OD值最高(图2)，选取12号细胞克隆进行传代培养与进一步特性分析。12号克隆细胞经过不同代次传代后对培养上清液进行CSFV E2蛋白ELISA检测，结果表明筛选出的克隆细胞系在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平(图3)。结果表明构建的重组细胞系能稳定表达目的基因。 

将得到的能够稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的12号克隆，命名为BCSFV-E2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.7719，保藏时间为2012年6月18日。 

2.3.4间接免疫荧光试验检测E2蛋白在转染细胞中的表达 

间接免疫荧光试验显示，细胞克隆在克隆后第一代即能呈现较强的黄绿色荧光信号，而对照细胞不呈现荧光信号。且该细胞克隆经传代至第25代时，仍能稳定表达目的蛋白(图4)。如图4所示，第5代细胞以及第25代细胞经IFA检测后，在可见视野范围内阳性细胞率为100%，表明所构建筛选出的细胞系遗传稳定。 

实施例2细胞系表达重组蛋白对猪的免疫保护试验 

疫苗制备：将实施例1所构建筛选的重组哺乳动物细胞系BCSFV-E2细胞（CGMCC No.7719）正常传代后长至90%满时，换低血清培养基（血清含量为1～2%）继续培养4-6d，收获细胞培养上清液存于4℃，细胞上清液经截留分子量为50kD超滤浓缩至E2抗原ELISA效价为1：160至1：320后加入终浓度为0.02%硫柳汞后为疫苗抗原液。疫苗抗原液与MONTANIDE ISA206VG佐剂按重量比为1：1进行混合并充分乳化，制备水包油包水型疫苗。对照组弱毒疫苗为市场销售的猪瘟细胞苗（牛睾丸原代细胞源）产品。 

动物分组与免疫：实验用猪在免疫前均进行采血分离血清进行CSFV抗体检测为阴性。选取日龄相近断奶长白仔猪15头，随机分为3组：第一组猪5只为弱毒疫苗免疫对照组，免疫CSFV弱毒苗5头份/猪，只免疫一次（弱毒疫苗组）；第二组猪5只为重组哺乳动物细胞系BCSFV-E2（CGMCC No.7719）表达E2抗原制备的疫苗组，免疫疫苗2ml，第一次免疫四周后进行加强免疫一次（重组亚单位疫苗组）；第三组猪5只为空白对照组，进行PBS注射对照（PBS对照组）。 

血清中和抗体检测：实验猪在免疫前采血一次，经ELISA检测所有猪血清为CSFV抗体阴性。在一免后四周油苗免疫组进行加强免疫一次。在第一次免疫后2周和4周分别采血分离血清。在二次免疫后第2、4、8、12、16、20、24、28周采血分离血清。实验动物猪血清均进行CSFV病毒中和抗体检测，检测中和抗体方法为OIE手册推荐的NPLA法。具体方法为：各组猪血清56℃灭活30min后，在96孔细胞板中开始用DMEM进行10倍稀释，以后再依次进行2倍稀释。将稀释好的血清50μL与等体积CSFV病毒(Shimen株，200TCID₅₀/0.1ml)混合。37℃孵育1h，然后加100μL PK-15细胞，37℃培养3d后将细胞用20%丙酮PBS固定。以抗CSFV E2蛋白单克隆抗体为一抗，HRP标记羊抗鼠酶标记抗体为二抗，用ACE进行显色。每个血清样品进行3次重复。同时设立空白对照。细胞板经显色后于光镜下观察判定结果。以减少50%以上感染的最大血清稀释倍数为血清的中和效价。 

血清ELISA抗体检测：免疫前后所采集猪血清以IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒进行检测，检测方法按试剂盒说明进行。分别按说明书方法计算抗体阻断率。将血清进行倍比稀释后检测血清抗体效价（抗体阻断率大于40%的血清最高稀释倍数）。 

免疫保护实验：于疫苗免疫32周后对实验猪进行病毒攻击保护试验。实验方法为对所有三组实验猪在相同条件下分别在颈部皮下注射猪瘟石门株血毒1mL(10⁶TCID50)，接毒后每日观察试验猪的精神状态，食欲与体温等指标。持续观察14天。 

结果：血清中和抗体检测结果表明，本发明所构建制备的表达猪瘟病毒E2蛋白重组BHK细胞系BCSFV-E2所表达的抗原制备的疫苗免疫猪后能诱导猪产生CSFV病毒中和抗体。二免后二周(初免后6周)中和抗体最高能达20480，达到中和抗体峰值，其值明显高于弱毒疫苗免疫组中和抗体水平。二免后四周(初免后8周)重组亚单位疫苗能诱导中和抗体效价为10240。以后中和抗体呈缓慢下降趋势，但依然保持高水平中和抗体。至免疫后7个月（28周），本发明制备的疫苗免疫组病毒中和抗体水平仍达640，远远高于能对猪提供免疫保护所需的病毒中和抗体水平（40～50）。而实验中未免疫对照猪在整个实验期间其病毒中和抗体水平都为小于10。具体实验数据如表1所示。 

阻断ELISA检测抗体结果显示，采用本发明的重组亚单位疫苗免疫猪后2周可诱导产生猪瘟特异性抗体（抗体阻断率大于40%），随后抗体水平逐渐升高，在免疫后第6-8周达峰值。在抗体持续期间，重组亚单位疫苗免疫组抗体水平均高于弱毒疫苗组抗体水平。这种高水平抗体在免疫后观察32周期始终存在（图5）。 

猪的病毒攻击免疫保护实验结果表明，采用本发明的重组亚单位疫苗与弱毒疫苗免疫组猪在接毒后在整个观察期内精神状态正常，食欲良好，体温正常（无超过41.0℃），实验猪无发病，全部存活。而未免疫对照组猪在接毒后约3天开始出现精神萎靡，嗜睡，食欲减退等症状。体温升高（全部出现高于41.0℃）。于接毒后第9-11天未免疫组猪全部死亡。对死亡猪进行剖检，在脾脏，肾脏，膀胱及扁桃体等器官均出现了典型的猪瘟病理变化。而重组亚单位苗组与弱毒疫苗免疫组猪剖检后于相就器官均未发现病变。 

表1重组亚单位疫苗免疫猪血清病毒中和抗体检测结果 

^a重组抗原疫苗组于初次免疫后4周进行加强免疫一次。 

实施例3用重组细胞系表达抗原间接ELISA法检测猪瘟病毒抗体 

将BCSFV-E2细胞扩大培养，收获细胞培养上清液。细胞上清液经低速离心去除细胞碎片等杂质后再经0.45μm滤膜过滤澄清。澄清的上清液再经截留分子量为50kD的滤膜超滤浓缩。经约40倍体积浓缩后，再经12000rpm离心，去除不溶杂质。上清液经浓缩后经pH8.0的Tris-HCl缓冲液透析后，结合于DEAE阴离子树脂层析柱，经洗涤后用pH8.0的Tris-HCl，250mM NaCl缓冲液itd洗脱，收集活性峰蛋白。再经超滤浓缩后用分子筛层析柱层析，收集活性峰蛋白后测定蛋白浓度后于-70℃保存备用。用纯化CSFV-E2蛋白为包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶标板。用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度为2μg/ml，按100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。然后用PBST（PBS＋0.05%Tween）洗涤酶标板3次；含1%BSA的PBST封闭酶标板，37℃封闭2h，封闭后用洗液PBST洗板3次，立即用于检测或－20℃存放备用。 

抗体检测操作程序：加入待检测猪血清（定性检测血清100倍稀释，抗体效价检测血清进行倍比稀释，同时设立阳性血清对照与阴性血清对照以及不加血清的空白对照），37℃孵育1h，PBST洗液洗涤3次，每次3分钟；加入辣根过氧化物酶 标记羊抗猪IgG（Goat-anti-pig IgG-HRP），37℃孵育1h，PBST洗液洗涤4次，每次3分钟；加入HRP显色底物（TMB显色剂），室温孵育5-15分钟观察显色反应；充分显色后，加入2M硫酸终止显色反应；用酶标仪测量450nm波长的吸光值；判定结果。 

判定结果时：空白对照及阴性血清孔吸光值小于或等于0.3，阳性血清对照孔吸光值大于0.4时结果有效；计算P/N值＝(检测孔OD值－空白对照孔OD值)/(阴性血清OD值－空白对照孔OD值)，P/N值等于或大于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。 

选取已知的猪瘟病毒抗体阳性猪血清以及阴性猪血清各20份，分别以纯化CSFV-E2蛋白为包被抗原进行间接ELISA检测，以检测抗原的检测效果。检测结果如图6所示，所有阳性血清OD450值均大于0.5，所有阴性血清OD450值均小于0.3。表明本抗原具有很好的特异性与敏感性。 

序列表

 

Claims (10)

1.一种猪瘟亚单位疫苗，其特征在于含有经稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白及佐剂。

2.根据权利要求1所述的猪瘟亚单位疫苗，其特征在于所述的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系是由以下方法构建得到：

（1）构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中插入编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列；

（2）将所述真核表达质粒转染BHK-21细胞；

（3）经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养；

（4）将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系。

3.根据权利要求2所述的猪瘟亚单位疫苗，其特征在于所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求2所述的猪瘟亚单位疫苗，其特征在于所述编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列如SEQ ID No．2所示。

5.根据权利要求1-4中任何一项的猪瘟亚单位疫苗，其特征在于稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系为BCSFV-E2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.7719。

6.稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组哺乳动物细胞系，命名为BCSFV-E2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.7719。

7.权利要求6所述的重组哺乳动物细胞系或其培养物在制备预防猪瘟病毒病疫苗药物中的应用。

8.权利要求6所述的重组哺乳动物细胞系或其培养物在制备诊断或检测猪瘟病毒感染试剂中的应用。

9.一种制备猪瘟亚单位疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）权利要求6所述的重组哺乳动物细胞系BCSFV-E2正常传代后长至90%满时，换血清含量为1～2%的低血清培养基继续培养4-6d；

（2）收获细胞培养上清液存于4℃，细胞上清液经截留分子量为50kD超滤浓缩至E2抗原ELISA效价为1：160至1：320后，加入终浓度为0.02%硫柳汞，得到疫苗抗原液；

（3）疫苗抗原液与佐剂按重量比为1：1进行混合并充分乳化，制备水包油包水型疫苗。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的佐剂为MONTANIDE ISA206VG。

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