CN106086045A - 一种猪瘟病毒e2基因重组乳酸菌的构建、表达方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组乳酸菌的方法，包括：1、猪瘟病毒F114毒株E2基因的克隆与序列分析；2、猪瘟病毒重组表达载体PNZ44‑E2的构建；3、重组质粒PNZ44‑E2在干酪乳酸杆菌中的电转化及表达；4、重组乳酸菌免疫原性分析。其有益效果是：重组乳酸菌具有益生菌的优良特性及表达外源蛋白的双重特性，动物口服活菌后，可以发挥乳酸菌作为益生菌的保健作用及在肠道表达猪瘟E2蛋白并具有免疫作用的特性，提高机体特异性体液免疫和细胞免疫能力，通过肠道粘膜免疫增强机体对猪瘟病毒的抵抗力。利用这一平台可为益生菌工程菌株的改造及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组乳酸菌作为口服疫苗防治猪瘟奠定科学基础。

Description

一种猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌的构建、表达方法
技术领域
本发明提供猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌的构建及免疫原性分析,属于生物技术领域。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病，基于CSF对于养猪业的巨大经济影响，国际兽疫局将其列于A类16种法定传染病之一，我国亦将其列为一类动物传染病，作为严密检测和检疫的主要传染病之一。CSFV主要通过易感猪消化道如吞入污染物时，经由口腔咽部或肠道粘膜组织侵入宿主体内；猪一旦感染CSFV，就会出现扁桃体、粘膜、免疫系统损伤,引起持续高热，导致急性死亡；消化道内的粘膜淋巴组织损伤坏死时常伴有继发性细菌感染，在肠壁形成圆形隆起的纽扣样肿大，形成慢性猪瘟。猪瘟几乎遍及世界所有养猪国家，受到国内外学者的高度重视，在我国的流行和分布也非常广泛，给养猪业造成了严重的经济损失。
目前对控制CSFV等病毒性传染病感染尚无特效药物，在生产中应用的有灭活疫苗和弱毒疫苗，但弱毒疫苗存在安全隐患，而灭活疫苗虽然安全性较高，但免疫效果远远不如弱毒疫苗，因此，研究新型疫苗控制CSFV已刻不容缓。
猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属，其基因组长约12.3kb，含有唯一的开放读码框架(ORF)，E2基因编码的E2囊膜糖蛋白是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要蛋白,E2蛋白具有种属特异性，是研究CSFV抗原变异、疫病监测、诊断技术及基因工程疫苗的主要对象，是研制CSFV新型疫苗的首选靶蛋白。
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类能在人和动物的胃肠道和雌性生殖道的存活的有益共生菌。大多乳酸菌能够发酵碳水化合物产生大量有机酸、抗生素及其他产物，提高机体免疫力，增强机体抗病毒、抗细菌能力,促进人和动物的健康。因此，乳酸菌广泛用于乳酸生产、医药卫生和饲料生产等方面。
随着乳酸菌表达系统的开发利用，重组乳酸菌口服粘膜免疫制剂成为新的研发热点。利用乳酸菌表达猪瘟病毒E2蛋白，作为口服免疫制剂有更明显的优越性，乳酸菌安全、没有内毒素、表达的外源蛋白质不需要经过纯化可以直接连同菌体一起服用；口服乳酸菌后,乳酸菌表达的用于治疗或免疫作用的蛋白就可以源源不断在肠道中产生并起到相应的作用。通过转化获得的重组乳酸菌的特征是：即具备自身的优良特性又被赋予质粒所编码的特殊功能，从而在科研、生产和医药等领域中具有较强的应用潜力和巨大经济价值。
然而，猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是：构建猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌，为益生菌株的改造及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组乳酸菌作为口服疫苗防治猪瘟奠定科学的基础。
本发明的技术方案包括：猪瘟病毒F114毒株E2基因的克隆与序列分析；猪瘟病毒重组表达载体PNZ44-E2的构建；重组乳酸菌的构建表达；重组乳酸菌的免疫原性分析等四部分实验内容。
猪瘟病毒E2基因的克隆及序列分析包括:病毒的培养，猪瘟病毒总RNA的提取，mRNA纯化，mRNA反转录，设计引物，利用PCR方法扩增目的基因。基因测序结果表明克隆表达的猪瘟病毒E2基因为963个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：
一段用于猪瘟病毒重组乳酸菌表达的基因，该基因段为猪瘟病毒基因组中的E2基因。
一对用于猪瘟病毒E2基因扩增的引物，该引物对为，pMTE2f:5’cggatcccgcttagcctgcaag-3’；pMTE2r：5’gctcgagctcgcccttgagcatat-3’。
上述该引物对的酶切位点为BamH I、Xho I。
一对用于猪瘟病毒E2基因克隆的引物，该引物对为，pNZE2f：5'-CATGCCATGGTGCGCTTAGCCTGCAAG-3'；pNZE2r5'-CCCAAGCTTGGGCTGCAGAATTCCTAGTCAAACC-3'。上述的一对用于猪瘟病毒E2基因克隆的带酶切位点引物，该引物对的酶切位点为NcoI、Hind III。
一种猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌的构建、表达方法，包括以下步骤：
a.猪瘟病毒F114毒株E2基因的克隆与序列分析
根据Genbank中猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，分别设计出带有BamH I和Xho I酶切位点的一对引物，应用RT-PCR方法扩增E2基因，并将其克隆至PMD-18-T载体中，进行核苷酸序列分析；
b.猪瘟病毒重组表达载体PNZ44-E2的构建
Nco I和Hind III双酶切重组质粒PMD18-T-E2,将纯化的E2基因克隆至带有氯霉素抗性基因筛选标记的表达载体PNZ44中，构建出在干酪乳酸杆菌增殖的原核表达质粒PNZ44-E2；将PNZ44-E2电转化至干酪乳杆菌LV中，经过生长筛选阳性克隆，制备提取重组质粒，PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析；
c.重组质粒PNZ0844-E2在乳酸菌中的表达及免疫原性
应用电转化技术将已构建的猪瘟病毒重组质粒PN44-E2转化至干酪乳杆菌LV中；筛选阳性克隆，经培养诱导表达，超声波裂解，SDS－PAGE检测到E2蛋白目的条带，表明成功获得重组乳酸菌。
本发明构建的重组乳酸菌具有乳酸菌自身的优良特性及表达猪瘟病毒E2蛋白的双重特性。通过口服动物后，能在动物肠内定植存活，起到维护肠道菌群平衡、提高免疫力及促动物生长的益生作用；同时重组乳酸菌在动物肠内长期存活，可以源源不断表达产生猪瘟E2蛋白，刺激肠道粘膜免疫，产生抗猪瘟病毒的分泌型抗体和血清抗体，起到保护动物免受猪瘟传染的作用。可为益生菌株的改造及表达猪瘟E2蛋白的重组乳酸菌作为口服疫苗的防治奠定科学的基础。
附图说明
图1.猪瘟病毒E2基因的PCR扩增结果，其中：M为Marker 2000；E为猪瘟病毒E2基因的PCR产物；
图2.PMD-18T-E2质粒的双酶切后回收结果：M:Marker 2000；E：双酶切的E2PCR产物；P：双酶切的PMD-18-T；
图3.重组质粒的PCR鉴定:M:Marker 2000；P：重组质粒PCR产物；
图4.重组质粒的酶切鉴定:M:Marker 15000；Ep：双酶切的重组质粒；
图5.E2基因PCR扩增:M：Marker DL2000；1,2：扩增的E2基因；
图6.载体和PCR产物的酶切：M：Marker DL15000；1：载体酶切；2：载体；3：E2基因PCR产物酶切；
图7.重组表达载体pNZ0844-E2的PCR鉴定：M：Marker DL2000；1～10：不同克隆菌株；
图8.重组表达载体pNZ0844-E2的酶切鉴定：M：Marker DL15000；1,3,5：重组质粒；2,4,6：双酶切重组质粒；
图9.不同培养时间菌体表达产物的SDS-PAGE：M:Protein Ladder；1,2,3,4,5,6：分别为12h、24h、36h、48h、60h和72h菌株；
图10.Western Blotting鉴定：1：Prestained Protein Ladder；2：目的蛋白；
图11.乳酸菌的荧光抗体染色结果：A：转化乳酸菌的猪瘟荧光抗体染色；B：未转化乳酸菌的猪瘟荧光抗体染色。
具体实施方式
一段用于猪瘟病毒重组乳酸菌表达的基因，该基因段为猪瘟病毒基因组中的E2基因。
一对用于猪瘟病毒E2基因扩增的引物，该引物对为，pMTE2f:5’cggatcccgcttagcctgcaag-3’；pMTE2r：5’gctcgagctcgcccttgagcatat-3’。
上述该引物对的酶切位点为BamH I、Xho I。
一对用于猪瘟病毒E2基因克隆的引物，该引物对为，pNZE2f：5'-CATGCCATGGTGCGCTTAGCCTGCAAG-3'；pNZE2r5'-CCCAAGCTTGGGCTGCAGAATTCCTAGTCAAACC-3'。上述的一对用于猪瘟病毒E2基因克隆的带酶切位点引物，该引物对的酶切位点为NcoI、Hind III。
一种猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌的构建、表达方法，包括以下步骤：
a.猪瘟病毒F114毒株E2基因的克隆与序列分析
根据Genbank中猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，分别设计出带有BamH I和Xho I酶切位点的一对引物，应用RT-PCR方法扩增E2基因，并将其克隆至PMD-18-T载体中，进行核苷酸序列分析；
b.猪瘟病毒重组表达载体PNZ44-E2的构建
Nco I和Hind III双酶切重组质粒PMD18-T-E2,将纯化的E2基因克隆至带有氯霉素抗性基因筛选标记的表达载体PNZ44中，构建出在干酪乳酸杆菌增殖的原核表达质粒PNZ44-E2；将PNZ44-E2电转化至干酪乳杆菌LV中，经过生长筛选阳性克隆，制备提取重组质粒，PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析；
c.重组质粒PNZ0844-E2在乳酸菌中的表达及免疫原性
应用电转化技术将已构建的猪瘟病毒重组质粒PN44-E2转化至干酪乳杆菌LV中；筛选阳性克隆，经培养诱导表达，超声波裂解，SDS－PAGE检测到E2蛋白目的条带，表明成功获得pNZ44-E2/LV重组乳酸菌。
实施例一：猪瘟病毒F114株E2基因的克隆与序列分析
1.1病毒的培养
1.1.1PK-15细胞的复苏和培养
将冻存于-80℃的PK-15细胞取出，立即于37℃水浴中解冻，用10mlDMEM完全培养基悬浮细胞，1000rpm离心5min，弃上清，再用10mlDMEM完全培养基重悬浮细胞，移动至细胞培养瓶内，置37℃5％CO2培养箱内培养。传代培养3代后，细胞稳定生长，可进行扩大培养。1.1.2接毒
取培养24h、生长良好的80％单层PK-15细胞，吸出旧培养液，用Hank's液洗涤两次，取冻存的CSFV F114毒株血毒，用DMEM不完全培养基按0.1MOI(感染比)稀释后接种于细胞，加入量刚好盖过瓶底为止，盖好盖子，置于37℃二氧化碳培养箱中感作1h，吸出病毒感染液，同时换上DMEM完全培养基，置37℃5％CO2培养箱继续培养。
1.1.3传代
待接猪瘟F114毒株的细胞长满后，经RT-PCR方法和ELISA方法检测为CSFV阳性者，进行传代培养，传至10代，每一代都收集细胞和培养液作为检测样品，用猪瘟抗原检测试剂盒测定其毒价，确定毒价最高的一代，大量培养作为抗原。
1.1.4收毒
将1至10代的每一代细胞反复冻融3次，收集，-80℃保存。
1.1.5病毒的粗提初步纯化
同上述方法，接猪瘟F114毒后进行传代培养，第5代时大量培养。将所有第5代的细胞和培养液反复冻融3次,收集后，10000rpm离心30min，弃沉淀，上清中加入聚乙二醇(mw6000)和NaCl至终浓度9％(W/V)和0.3M，于4℃搅拌过夜，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用PH7.5TEN缓冲液充分溶解，再以5000rpm离心20min，收集上清，用PEG20000适当浓缩，透析。用一次性细菌过滤器过滤病毒液，收集，-80℃保存。
1.2.引物的设计与合成
根据猪瘟病毒E2蛋白的基因序列，参考质粒PMD-18-T的多克隆位点，设计合成扩增E2基因的2条引物，并在分别在基因的上游引入BamH I酶切位点，下游引入Xho I酶切位点。引物由大连宝生物(Takara)公司合成，用超纯水稀释至10pmol/μL工作浓度。设计合成的引物序列及名称如下所示：
pMTE2f:5’cggatcccgcttagcctgcaag-3’(5’端引物，含BamH I酶切位点ggatcc)
pMTE2r：5’gctcgagctcgcccttgagcatat-3’(3’端引物,含Xho I酶切位点ctcgag)
1.3、E2基因的扩增、回收与克隆
1.3.1猪瘟病毒总RNA的提取
用Trizol法提取猪瘟病毒总RNA，再经过琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.2 cDNA第一链合成(反转录)
采用TaKaRa公司2步法试剂盒，反转录获得cDNA第一链，反转录反应在50μl体系中进行。
1.3.3 PCR扩增目的基因片段
PCR扩增体系按TaKaRa二步法试剂盒使用说明组成，反应在50μl体系中进行。扩增结束后取5μlPCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统拍照检验。得到与预期结果相符的目的基因片段，结果如图1。
1.3.4目的基因PCR产物片段的回收
RT-PCR的双酶切产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下目的基因片段，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收；凝胶成像系统拍照后，-20℃保存备用，电泳结果如图2所示。
1.3.5重组克隆质粒的构建
1.3.5.1感受态细胞的制备:参照J.萨姆布鲁克主编的《分子克隆实验指南》的方法制备感受态细胞。
1.3.5.2克隆载体与目的片段的连接:
分别取PMD-18-T液0.5μl，DNA片段液3μl，Solution I液5μl，dH2O 1.5μl，共计总量为10μl；于Eppendorf离心管中，16℃连接过夜。
1.3.5.3重组质粒的转化
1)取上述10μl连接产物加入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30min。
2)将装有混合物的离心管移入预加温至42℃的循环水浴中，热击90s，不摇动Eppendorf离心管。
3)将离心管快速转移到冰浴中，冰浴3min。
4)在超净台里，将离心管中的混合物加入到890μl预加温至37℃的SOC培养基中。
5)轻轻颠倒混匀，将混合物于37℃振荡培养60min。
6)将培养的菌液以4000rpm离心5min，在超净工作台里弃掉部分上清，留约200μl上清，用移液枪重悬菌体沉淀。
7)菌液涂于含IPTG、X-gal的青霉素平板(100μg/ml)上，正面放置平板10～20min，待液体吸收完后倒置平板，在37℃温箱中培养过夜。
1.3.6阳性克隆的鉴定
1.3.6.1阳性质粒的小量制备
用镊子夹取10μl白色吸头，将在氨苄青霉素固体培养基上长出来的单个白色菌落沾取少许分别接种于3～5mL于含氨苄青霉素LB液体培养基中，在37℃恒温摇床250rpm/min振荡培养，培养过夜；第二天将收集的菌液，按照质粒DNA小提试剂盒说明书进行质粒提取；并经琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.6.2重组质粒的PCR鉴定
(1)PCR扩增反应体系为：TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，pMTE2f(10pmo1/μL)1.5μL，pMTE2r(10pmo1/μL)1.5μL，重组质粒0.5μL，纯净化水37μL，总量为50μL体系，于Eppendorf离心管中。
(2)PCR反应循环参数为:
95℃3min,1×(94℃30s,65℃→56℃30s,72℃50s),35×(94℃30s,56℃30s,72℃50s),72℃8min
(3)PCR反应产物检测：反应结束后取5μL PCR扩增产物，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统拍照检验，得到预期大小的目的片段，结果如图3所示。
1.3.6.3重组质粒的双酶切鉴定
为进一步确定外源基因的存在，用XhoI酶和BamHI酶对重组质粒进行双酶切鉴定。
酶切反应体系(其它重组质粒酶切反应体系相同)为：重组PMD-18-E23.0μL，10×Kbuffer 2.0μL，Xho I酶1.0μL，BamH I酶1.0μL，dH2013μL，总量为20μL体系，于Eppendof离心管中。
37℃水浴5～8h，取5μL酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统拍照检验，结果如图4。
1.3.6.4重组质粒的序列测定分析
将经PCR及双酶切鉴定正确的阳性重组质粒，纯化后送上海生物工程公司进行序列测定。测序结果与已知序列进行核苷酸同源性符合，说明克隆基因正确。
实施例二：重组质粒PNZ44-E2的构建
2.1.PMD-18-E2的E2基因PCR扩增
2.1.1引物设计
根据猪瘟病毒E2蛋白的基因序列，参考质粒pNZ44的多克隆位点，设计合成克隆E2基因的2条引物，并在分别在基因的上游引入Nco I酶切位点，下游引入Hind III酶切位点。引物由大连宝生物(Takara)公司合成，用超纯水稀释至10pmol/μL。
设计的引物序列及名称如下所示：
pNZE2f：5'-CATGCCATGGTGCGCTTAGCCTGCAAG-3'(5’端引物，含Nco I酶切位点CCATGG)pNZE2r：5'-CCCAAGCTTGGGCTGCAGAATTCCTAGTCAAACC-3'(3’端引物，含HindIII酶切位点AAGCTT)
2.1.2PCR反应体系及反应条件
PCR反应体系为：10×Buffer 5μL(Mg2+plus)5.0μL，2.5mmol/L dNTP Mixture4.0μL，pNZE2f Primer1.5μL，pNZE2r Primer1.5μL，PMD-18-E2DNA模板1.0μL，Taq DNAPolymerase0.5μL，ddH2O 36.5μL，总量50.0μL体系，于PCR反应管中。PCR反应条件为：94℃2min，94℃30s、56℃30s、72℃50s、30个循环，72℃10min,4℃保存。
2.2.3.PCR产物检测及产物纯化
反应完成后产物取3μL进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的片段。电泳结果显示得到960bp的基因片断，与理论值相符，结果如图5。
确定为目的基因片段后，使用“UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒”进行PCR产物纯化。
2.3.重组表达质粒pNZ44-E2的构建
2.3.1载体和PCR产物的双酶切
酶切反应体系为：载体pNZ44或PCR纯化产物10.0μL,10×BufferM 2.0μL,0.1％BSA 2.0μL,Nco I酶1.0μL,Hind III酶1.0μL,ddH2O 4.0μL,总体积为20.0μL；在PCR薄壁管中按顺序加入以上试剂后，混匀；37℃水浴4h。各取3μl电泳检测酶消化结果，酶切电泳检测与预期结果相符，结果如图6。
2.3.2酶切片段的琼脂糖凝胶回收
将剩余的所有酶切产物上样，琼脂糖凝胶进行电泳，使用“UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒”纯化回收，取3μl回收样品做电泳检测。
2.3.3酶切片段的连接
将回收的pNZ44酶切片段和PCR产物酶切片段，按摩尔比1:1的比例混合进行连接。连接体系为：Insert E2DNA 8.5μL，Vector pNZ44DNA 8.5μL，T4DNA Ligase 1.0μL,10×T4Ligation Buffer 2.0μL,Total 20.0μL体系。将反应体系置于16℃水浴中连接16h或4℃连接过夜。
实施例三：重组质粒pNZ0844-E2电转化乳酸菌及其表达
3.1.干酪乳酸杆菌电转化感受态细胞的制备
干酪乳酸杆菌LV甘油菌在无抗生素的MRS琼脂平板上划线，37℃厌氧培养24小时。在3mL MRS培养基中接种单菌落，37℃静置培养过夜；次日，按1:50转接过夜培养物到50mLMRS培养基中，37℃静置培养,待培养物生长到对效生长期时(OD600＝0.6～0.8),离心(2500rpm.4℃,10min)收集菌体，用预冷的电转洗液(Electroporation wash buffer，EPWB)洗细胞3次(1mL/次)，用预冷的电转液(Electroporation buffer,EPB)洗细胞1次，用1mL预冷30％PEG(聚已二醇)1500+100％EPWB洗细胞一次，在500μL 30％PEG1500+10％EPWB液中重悬细胞,分装100μL冰浴待用。
3.2.质粒pNZ44-E2电转化干酪乳酸杆菌LV，方法如下：
1).取100μL感受态细胞与不超过10μL的质粒(约1μg，用纯水溶解)混匀，冰浴5min；
2).将混合物转到2mm预冷电转杯中，电转化条件:200Ω，2kV，25μF，时间常数为4.2V/cm；
3).立即加入900μL MRS培养基并转移至离心管，37℃保温1小时；
4).将转化子涂布在MRSC+(氯霉素5μg/mL)培养基平板上，用封口膜封闭培养皿，放置于37℃培养36小时至培养皿长出菌落。
3.3.重组转化子的鉴定
随机挑取10个阳性克隆，使用引物pNZE2f和pNZE2r，按实验步骤2.1.2所提供的条件，进行菌落PCR鉴定，结果如图7。
3.4.重组质粒的酶切鉴定
提取的重组质粒，进行双酶切鉴定，其反应体系为：质粒4.0μL,10×BufferM 1.0μL,0.1％BSA 1.0μL,Nco I酶0.5μL,HindIII酶0.5μL,ddH2O 3.0μL,总体积为10.0μL。将反应体系置于37℃反应2h，反应完成后全部上样进行电泳检测。结果可见重组质粒的双酶切后的条带大小与预期相符，初步判定为已成功构建猪瘟病毒E2重组表达载体pNZ44-E2。酶切鉴定结果如图8所示。
3.5.E2蛋白的诱导表达及鉴定
3.5.1.SDS-PAGE鉴定
挑取PCR鉴定后的阳性单克隆菌落,接种于5mL含2％葡萄糖的MRS(5μg/mL氯霉素)液体培养基中，37℃静置24小时，1:50转接于含有2％半乳糖的MRS(5μg/mL氯霉素)培养基液中，37℃静置培养表达。分别取12h,24h,36h,48h,60h,72h的重组乳酸菌菌液，用SDS-PAGE检测确定E2蛋白是否表达或其表达效果，结果见重组菌培养生长到48h时，E2蛋白的表达量最高，实验结果如图9表明。
3.5.2 Western Blotting检测
3.5.2.1.蛋白质电转移
打开转移盒，依次放入用转移缓冲液润湿的3MM Whatman滤纸3张、PVDF膜1张、塑料膜(中央有比NC膜略小的方型孔)1张、凝胶、3MM Whatman滤纸3张，用小试管轻轻滚过凝胶-膜“三明治”以赶走所有气泡。
盖好电转移盒，连接好电极(下为正极，上为负极)，根据膜的大小，按0.8mA/cm2计算电流，功率5W，转移40min。
3.5.2.2.蛋白质杂交
1)膜的封闭：将转移好的膜放在封闭液中，轻轻摇动封闭约1hr。
2)一抗孵育：加入以含有1％BSA的TBST 10ml稀释的羊抗Decorin(多抗1:4000稀释)，4℃孵育过夜。
3)洗膜：弃去一抗溶液，用TBST洗膜四次，每次15min。
4)二抗孵育：弃去TBST，加入以含有1％BSA的TBST 10ml稀释的羊抗鼠(二抗1:10000稀释)，25℃孵育2hr。
5)洗膜：弃去二抗溶液，用TBST洗膜4次，每次15min。
6)显色：弃去TBST，将显色试剂滴加到膜上，静置1min，于暗合中X光片曝光(约1～10min)，将X光片取出，显影4min，定影直至条带清晰。结果如图10所示。
3.5.3猪瘟荧光抗体染色检测
1).转化的重组乳酸菌(用未转化的菌做为阴性对照)培养后，9000rpm离心30s，弃上清，取菌体沉淀涂布于玻片上，自然干燥后，在室温下用丙酮(丙酮和H2O的体积比为9：1)固定15分钟。
2).将20倍稀释的猪瘟单克隆荧光抗体加于固定的样品上，室温孵育1小时。
3).用PBS PH7.2液充分冲洗。
4).自然干燥后加上封固液(9体积甘油，1体积PBS PH7.2)，并加盖玻片后于荧光显微镜下镜检。
结果能在重组乳杆菌菌体内见到特异性免疫荧光，而非重组菌菌体内没有荧光；说明猪瘟E2蛋白能在乳酸菌表达并具有良好的生物学活性，如图11所示。
实施例四：重组乳酸菌口服免疫实验动物及其免疫学特性评价
4.1.重组乳酸菌口服菌液的制备及免疫动物分组
4.1.1重组乳酸菌口服菌液的制备：
重组乳杆菌pNZ44-E2/LV培养至OD600＝0.6左右，按1：50的比例转接至MRS液体培养基中，37℃静置培养24h,5000g离心5min收集菌体，用上清液调整菌体浓度为1010CFU/ml。含空质粒的乳杆菌pNZ44/LV按同样方法处理后作为对照。
4.1.2动物分组及口服免疫方法：
2月龄大耳白兔子随机分为三组，每组10只。第一组为饲喂重组工程菌组，每只兔子每天口服接种2ml浓度为1010CFU/ml的pNZ44-E2/LV重组乳酸菌。第二组为空质粒重组菌组，每只兔子每天口服接种2ml浓度为1010CFU/ml的pNZ44/LV重组乳酸菌。第三组为空白对照组：每只兔子每天口服2mlMRS培养液。口服免疫方法为共口服三次，每次连续口服4天，间隔时间为10天后进行第二次口服免疫。
4.1.3免疫动物血液采取及血清制备
由于机体产生抗体需要一段时间，所以将检测血清抗体的时间适当延长，采集免疫前、一免后第7d、二免后7d、三免后7d兔子血液，37℃促凝2h，4℃静止过夜，4000r/min离心5min，收集血清，用于抗体检测。
4.2、口服免疫动物猪瘟抗体ELISA检测
4.2.1猪瘟抗体ELISA检测方法
将四次采血分离的血清按1:200稀释，用北京爱德士元亨生物科技公司提供的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒检测，其操作步骤如下：
(1)抗原包被：用0.05％mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液对纯化E2蛋白抗原进行稀释滴加于96孔酶标板，每孔加入100μl(含1.0μg纯化E2蛋白抗原)，4℃包被过夜；
(2)洗涤：PBST 300μl/孔洗涤3次，每次5min；
(3)封闭：用1％BSA-PBS-T封闭，每孔100μl，湿盒37℃1h；
(4)洗涤同上；
(5)加稀释好的待检血清：100μl/孔，设对照孔，37℃温育2h；
(6)洗涤同上；
(7)加二抗：滴加1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒的酶标抗体，100μl/孔，湿盒37℃作用60min；
(8)洗涤同上；超纯水再洗涤三次；
(9)加底物：每孔加入100μl底物显色液，室温避光反应至有明显的颜色变化时；
(10)终止反应：50μl/孔(2M H2SO4)；
(11)用自动酶标分析仪测定OD450值，分析结果。
4.2.2猪瘟抗体ELISA检测结果判定方法
猪瘟阻断ELISA检测抗体水平结果判定方法为：只有阴性对照的平均OD450大于0.50，阳性对照的阻断率大于50％，该检测结果才能有效。
计算方法：阻断率＝(阴性对照平均值OD450—样本OD450)÷阴性对照平均值OD450。
结果判定：如果被检样本的阻断率大于等于40％，该样本就可以被判为阳性(有SCFV抗体存在)；如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本就可以被判为阴性(无SCFV抗体存在)；如果被检样本的阻断率在30％-40％之间，就应在数日后再对该动物进行重测。
4.2.3猪瘟抗体ELISA检测结果
第一组为饲喂重组乳酸菌工程菌组，二组为转化空质粒乳酸菌组，第三组为空白对照组。结果表明：实验1组(口服PNZ0844-E2/LV重组乳酸菌)的兔子血清样品的阻断率均高于40％，结果判定为阳性。实验2组(口服空质粒转化重组乳酸菌)和实验3组(口服MRS培养液对照组)兔子血清样品的阻断率均低于30％，结果判定为阴性。说明口服重组乳酸菌后，体液中有猪瘟病毒抗体存在，口服免疫结果引发了机体的体液免疫。本发明的重组乳酸菌在曲靖市千村农牧科技有限公司、云南农业职业技术学院生猪综合试验示范场等一些养殖单位进行了赠送推广，效果十分显著。检测结果见表1:
表1:兔子血清抗体用阻断ELISA实验检测结果
Tab1:Serum antibody detection results ofrabbit by Blocking ELISAexperiment
4.3、淋巴细胞转化实验
4.3.1淋巴细胞转化实验方法
4.3.1.1.外周血淋巴细胞的分离
分别在口服免疫后的第25天、第35天以及第45天采取兔子的肝素抗凝血2ml，加Hank’s液1ml，混匀，轻轻加在1ml淋巴细胞分层液面上。2000g离心15分钟，小心收集中间淋巴细胞，以Hank’s液离心洗涤细胞沉淀2次，再以RPMI1640培养基(含青霉100U/ml，链霉素100μg/mL，小牛血清10％)，将细胞稀释成1×106个/ml，制成单细胞悬液。
4.3.1.2.淋巴细胞的诱导培养
稀释好的细胞悬液加入96孔板，每孔100μl，每只兔子淋巴细胞做20个孔，培养的细胞共分5组:
空白对照组:仅加入培养液RPMI1640
阳性对照组:仅加入ConA刺激(ConA终浓度为5μg/ml，0.1mg/mlConA加入10μl，孔内液体总体积为200μl)
实验组:终浓度为5ug/ml(100μg/ml的CSFV纯化抗原加入10μl)；
ConA阳性对照、抗原和空白各4孔，置于5％CO237℃培养箱中培养。培养66h后，孔内加入MTT(5mg/ml)10μl继续培养4h，培养板细胞离心，小心吸去各孔上清，加入30％二甲基亚砜150μL(或酸化异丙醇(含0.04mol/LHCL))，振荡10min，溶解的甲赞，酶标仪490nm处测吸光度(A)值，将所得数据进行统计学处理，计算其平均值并以此计算淋巴细胞的增殖能力。
4.3.2淋巴细胞转化实验结果
4.3.2.1免疫兔子外周血淋巴细胞对ConA的反应性
淋巴细胞培养66h后经过MTT法检测：空白对照组的OD值明显低于实验组OD值，并随免疫时间的增加形成一定梯度，说明在ConA的刺激作用下，口服E2重组乳酸菌的兔子的淋巴细胞的增殖能力增强。结果如表2：
表2：免疫兔子外周血淋巴细胞对ConA的反应性(MTT 490nm)
Tab2:Reaction of ConA in peripheral blood lymphocytes of rabbit(MTT490nm)
4.3.2.2免疫兔子外周血淋巴细胞对猪瘟病毒纯化抗原的反应性
淋巴细胞培养66h后经过MTT法检测：空白对照组的OD值明显低于实验组OD值，并随免疫时间的增加形成一定梯度，说明在猪瘟病毒纯化抗原的刺激作用下，口服E2重组乳酸菌的兔子的淋巴细胞的增殖能力增强。并且对猪瘟病毒抗原的反应性明显强于对ConA的反应性，说明口服E2重组乳酸菌能引发动物机体的特异性细胞免疫。结果如表3：
表3:免疫兔子外周血淋巴细胞对猪瘟病毒纯化抗原的反应性(MTT 490nm)
Tab3：Reaction of the purified antigen of classical swine fever virusinperipheral blood lymphocytes of rabbit(MTT 490nm)

Claims (6)

1.一段用于猪瘟病毒重组乳酸菌表达的基因，其特征在于，该基因段为猪瘟病毒基因组中的E2基因。
2.一对用于猪瘟病毒E2基因扩增的引物，其特征在于，该引物对为，pMTE2f:5’cggatcccgcttagcctgcaag-3’；pMTE2r：5’gctcgagctcgcccttgagcatat-3’。
3.根据权利要求2所述的一对用于猪瘟病毒E2基因扩增的带酶切位点引物，其特征在于，该引物对的酶切位点为BamH I、Xho I。
4.一对用于猪瘟病毒E2基因克隆的引物，其特征在于，该引物对为，pNZE2f：
5'-CATGCCATGGTGCGCTTAGCCTGCAAG-3'；
pNZE2r5'-CCCAAGCTTGGGCTGCAGAATTCCTAGTCAAACC-3'。
5.根据权利要求4所述的一对用于猪瘟病毒E2基因克隆的带酶切位点引物，其特征在于，该引物对的酶切位点为Nco I、Hind III。
6.一种猪瘟病毒E2基因重组乳酸菌的构建、表达方法，其特征是：包括以下步骤：
a.猪瘟病毒F114毒株E2基因的克隆与序列分析：
根据Genbank中猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，分别设计出带有BamH I和Xho I酶切位点的一对引物，应用RT-PCR方法扩增E2基因，并将其克隆至PMD-18-T载体中，进行核苷酸序列分析；
b.猪瘟病毒重组表达载体PNZ44-E2的构建：
Nco I和Hind III双酶切重组质粒PMD18-T-E2,将纯化的E2基因克隆至带有氯霉素抗性基因筛选标记的表达载体PNZ44中，构建出在干酪乳酸杆菌增殖的原核表达质粒PNZ44-E2；将PNZ44-E2电转化至干酪乳杆菌LV中，经过生长筛选阳性克隆，制备提取重组质粒，PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析；
c.重组质粒PNZ0844-E2在乳酸菌中的表达及免疫原性：
应用电转化技术将已构建的猪瘟病毒重组质粒PN44-E2转化至干酪乳杆菌LV中；筛选阳性克隆，经培养诱导表达，超声波裂解，SDS－PAGE检测到E2蛋白目的条带，表明成功获得重组乳酸菌。
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