CN103215298A - 用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的重组表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的重组表达载体。该重组表达载体命名为pYG-Tα1-E2，如序列表SeqNo.1所示。本发明还涉及一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，依据猪瘟病毒主要经肠道黏膜感染途径入侵机体，继而引发动物疾病，增强机体特异性黏膜免疫，是阻止病原入侵的首要防线，利用乳酸菌作为介导黏膜免疫传递疫苗抗原的安全级活菌载体，以猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，胸腺肽为免疫增强剂，构建了具有抗猪瘟病毒功能的转基因乳酸菌制剂。相比于传统猪瘟疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作的优点。

Description

用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的重组表达载体

技术领域

 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的重组表达载体。

背景技术

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起猪的一种以急性出血和发热为主要特征的烈性传染病，是危害养猪业发展的主要传染病之一。自然条件下，猪是唯一易感动物，死亡率高，给养猪业造成了巨大的经济损失。

目前CSF的主要流行区有：(1) 东南亚疫区，由于控制措施不力，疫情仍然较重；(2) 中南美洲疫情稳定区，疫病流行逐年减少；(3) 欧洲特别是西欧属疫情活跃区，虽然采取了严密的控制措施，仍经常爆发，是近年来CSF流行的中心。在我国，CSF流行呈现典型和非典型共存、持续感染和隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等，疫苗接种仍是防控CSF的主要措施。一些发达国家，如美国、加拿大及一些欧盟成员国等采取严格防疫措施和剔除CSF感染猪净化猪群的方法控制和消灭CSF，成果虽显著，但经济损失较大。

早期的CSF灭活疫苗因免疫期短、产生免疫保护力慢、生产成本高且繁殖CSF强毒潜在散毒危险等缺陷，自1982年起我国已停止该类疫苗的生产。CSF弱毒疫苗能够对CSF强毒的攻击提供保护，在CSF流行的地区，仍是控制该病的重要措施之一。尽管CSF弱毒疫苗能产生有效保护，但在长期免疫接种的胁迫下CSFV可能出现抗原变异，同时CSF细胞弱毒疫苗难以剔除牛病毒性腹泻病毒的污染，还可能与野毒重组或自然突变而造成毒力返强，并可通过胎盘感染造成胎儿死亡，先天性感染仔猪出现免疫耐受现象。此外，由于CSF弱毒疫苗干扰CSF的血清诊断，难以区分CSF野毒感染猪与免疫猪，同时疫苗保存和使用不当以及疫苗免疫不能覆盖所有易感猪群，均会导致免疫失败，而且弱毒苗在接种后至少15d内能够在淋巴器官(主要是扁桃体)内一定程度的复制，这期间利用标准的诊断方法难以将其与野毒区分开来，不利于鉴别诊断，欧盟已禁止使用CSF弱毒疫苗，而是采用扑杀感染猪和CSF血清阳性猪的措施以控制和消灭CSF。然而采用扑杀政策所需人力、物力和资金巨大，发展中国家更是难以承受，这促使人们研究和开发新型CSF疫苗来防控该病。目前利用反向遗传学技术改造缺失E2或Erns基因的突变病毒株成为可能，这种缺失突变株只能在反式提供缺失蛋白的感受态细胞系上生长，将其作为疫苗安全性好，但此类疫苗一个值得关注的焦点是突变疫苗株与野毒株之间存在发生重组的可能性。在重组病毒疫苗的研制中，利用CSFV-E2糖蛋白能够诱导机体产生中和抗体的特性，构建了重组痘苗病毒、腺病毒和伪狂犬病毒等，在临床上都能够诱导有效的免疫保护，但所用病毒载体存在生物安全隐患。为了克服CSF弱毒疫苗的固有缺陷，又研发了CSF亚单位标记疫苗，其中最有效的CSF亚单位疫苗也是基于CSFV-E2糖蛋白研制，疫苗免疫动物后仅产生抗E2蛋白抗体，而野毒感染的猪却同时能够产生抗Erns蛋白的抗体，利用现有的ELISA抗体检测方法能够加以区分，弥补了经典弱毒疫苗的不足，但是其保护效率还有待于进一步的评估。

猪瘟疫苗的设计是多样的，使我们难以确认哪一种是最好的选择。在不同的研究中，疫苗剂量、免疫次数、免疫途径、免疫攻毒之间的时间间隔均不相同，攻毒用的毒株、病毒毒力、攻毒剂量与途径以及用来评估疫苗效果的标准也不相同。结合猪瘟病毒主要经消化道黏膜系统侵入机体引起动物发病的特点，研制能有效地刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答继而诱导系统免疫应答的黏膜免疫疫苗，对疫病防治具有重要意义。

理想的黏膜疫苗可以促进抗原和免疫系统之间的有效接触，诱导体液和细胞免疫反应，产生长期的免疫保护作用，且稳定、无毒性。针对基因工程减毒病毒和细菌的应用而带来的环境和安全问题，发展了以乳酸菌为代表的非致病性活菌载体。乳酸菌作为外源基因表达宿主菌，其优越性主要表现在：                                               

 乳酸菌能在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植，对维持微生态平衡具有重要作用；

 不具有致病性，是公认的安全级微生物，易构建成食品级基因克隆及表达系统，有效提高基因工程产品的安全性；

 同肠胃外免疫途径相比，经黏膜免疫，可以诱发IgA产生；

 免疫方法简单、安全；

 具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及抗胆汁酸能力。因此，乳酸菌作为免疫接种的口服疫苗载体极具开发潜力。乳酸菌在诱导黏膜免疫应答时或经过小肠上皮的微皱褶细胞(microfold cell, M细胞)，或者通过树突状细胞(dendritic cell, DC)进入固有层，激活Th2淋巴细胞，产生白介素IL-5，激活B细胞，分泌IgA，形成黏膜表面抗体sIgA，同时可提高免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌，阻止致病微生物的吸附和入侵，而且可将特异性抗原分子携带并分泌到肠道，穿过肠壁进入黏膜下层，引起细胞免疫和体液免疫。

因此，本发明依据CSFV主要经黏膜感染为出发点，以阻止病原感染的第一道防线为指导思想，利用乳酸菌作为传递抗原的载体进行抗CSF基因工程乳酸菌免疫制剂的制备。本发明以猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，胸腺肽为免疫增强剂，构建了具有抗猪瘟病毒功能的转基因乳酸菌制剂。实验证实，本发明一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂能有效地刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而引起全身性系统免疫反应，可作为预防猪瘟的口服疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗猪瘟病毒感染的转基因乳酸菌制剂的制备方法。

本发明根据猪瘟病毒主要经肠道黏膜感染入侵机体的特点，利用常用乳酸菌——保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）作为介导黏膜免疫传递疫苗抗原的安全级活菌载体，以胸腺肽Tα1作为免疫增强剂，猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，研发了具有抗猪瘟病毒感染的转基因乳酸菌制剂，通过口服免疫，可达到预防猪瘟的目的。

本发明的目的通过下述技术方案实现:

一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌的重组表达载体pYG-Tα1-E2，如序列表Seq No.1所示。

本发明还具有如下特征：

1、一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，其特征在于，将以胸腺肽Tα1作为免疫增强剂，猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，构成的重组表达载体pYG-Tα1-E2电转化入乳酸菌中。

本发明还具有如下技术特征：

2、 一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于胸腺肽Tα1基因PCR扩增引物对，

上引物T-F：如序列表Seq No.2所示，

下引物T-R：如序列表Seq No.3所示。

3、 一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于猪瘟病毒E2蛋白基因PCR扩增引物对，

上引物E-F：如序列表Seq No.4所示，

下引物E-R：如序列表Seq No.5所示。

4、 一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，包括如下步骤： 

(1) 参照Genbank中发布的胸腺肽(Tα1)基因序列设计PCR引物对，上引物T-F：如序列表Seq No.2所示；下引物T-R：如序列表Seq No.3所示。

(2)根据猪瘟病毒E2蛋白基因设计PCR扩增引物对，上引物E-F：如序列表Seq No.4所示，下引物E-R：如序列表Seq No.5所示。

(3)进行常规链式聚合酶反应分别扩增Tα1基因及E2基因

(4)构建重组表达载体pYG-Tα1- E2。

(5)构建转基因乳酸菌

5、 一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，经口服免疫，能有效地刺激动物机体产生保护性免疫应答，可作为预防猪瘟的口服疫苗。

6、 如上所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，所述步骤（3）采用常规链式聚合酶反应扩增Tα1基因的具体步骤如下：将混合液在70℃加热5min，25 ℃退火5min，37℃延伸30min，最后70℃加热10 min。

    所述混合液组成如下：

10×PCR Buffer	5.0 μL
		dNTP (2.5mM for each)	4.0 μL
引物T-F (10μM)	3.0 μL
		引物T-R (10μM)	3.0 μL
Taq DNA Polymerase (5U/μL)	2.5 μL
		ddH2O	32.5 μL。

7、 如上所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，所述步骤（3）采用常规链式聚合酶反应扩增E2基因的具体步骤如下：采用TIANamp Virus RNA Kit提取猪瘟病毒基因组RNA，经RNA反转录试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增猪瘟病毒E2蛋白基因。将混合液在94℃45s，60.9℃退火45s，72℃延伸60s，进行35个循环；72℃终延伸10 min。

所述混合液组成如下：

10×PCR Buffer	5.0 μL
		dNTP (2.5mM for each)	4.0 μL
引物E-F (10μM)	1.0 μL
		引物E-R (10μM)	1.0 μL
Taq DNA Polymerase (5U/μL)	0.5 μL
		cDNA模板	3.5 μL
ddH2O	35.0 μL。

8、 如上所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，所述的步骤（4）重组表达载体pYG-Tα1-E2的构建方法具体步骤如下：先将PCR产物胸腺肽(Tα1)基因经BamHⅠ、KpnⅠ酶切，利用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段，将纯化后的目的基因克隆入表达载体pYG的BamHⅠ、KpnⅠ位点构建重组质粒pYG-Tα1；再将PCR产物猪瘟病毒E2蛋白基因经KpnⅠ、XhoⅠ酶切，利用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段，将纯化后的目的基因克隆入重组质粒pYG-Tα1的KpnⅠ、XhoⅠ位点。将鉴定正确的重组表达载体命名为pYG-Tα1-E2。

9、 如上所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，所述的步骤（5）构建转基因乳酸菌的乳酸菌菌株为保加利亚乳杆菌 （Lactobacillus bulgaricus），采用电转化法构建转基因乳酸菌，电转化条件为：100Ω、2.5kV、25μF。

本发明构建了抗猪瘟病毒感染的转基因乳酸菌口服免疫制剂，通过临床免疫实验获得了较好的抗猪瘟病毒免疫效果，具有潜在的疫苗应用价值，为研制新型抗猪瘟疫苗奠定了物质与技术基础。相比于传统猪瘟疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的优点。

附图说明

图1 是PCR合成胸腺肽Tα1基因结果示意图；

其中，M：DNA marker 2000；1-3：PCR合成胸腺肽Tα1基因；4：阴性对照。 

图2是重组质粒pYG-Tα1的酶切鉴定图；

其中，M：DNA Marker 15000；1：BamHⅠ酶切结果；2：KpnⅠ酶切结果；3：BamHⅠ- KpnⅠ双酶切结果。

图3 是猪瘟病毒E2蛋白基因RT-PCR扩增结果示意图；

其中，M：DNA marker 2000；1-3：猪瘟病毒E2蛋白基因RT-PCR扩增结果；4：阴性对照。

图4是重组表达载体pYG-Tα1-E2结构示意图。

图5是重组表达载体pYG-Tα1-E2的酶切鉴定图；

其中，M：DNA Marker 15000；1：BamHⅠ酶切结果；2：XhoⅠ酶切结果；3：BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切结果。

图6是转基因乳酸菌诱导上清液中目的蛋白的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。

A：目的蛋白的SDS-PAGE鉴定结果；其中，M：标准蛋白分子量；1-2：经诱导的转基因乳酸菌浓缩上清液的SDS-PAGE分析结果；3：未经诱导的转基因乳酸菌浓缩上清液的SDS-PAGE结果。

B：转基因乳酸菌表达蛋白的Western-blot鉴定结果。其中， 1：转基因乳酸菌超浓缩上清液Western blot鉴定结果；2：Western blot阴性对照。 

图7是转基因乳酸菌口服免疫仔猪诱导黏膜分泌型IgA抗体的ELISA检测结果。

图8是转基因乳酸菌口服免疫仔猪诱导机体产生血清抗体IgG的ELISA检测结果。

图9是抗体中和活性检测结果；

A：血清抗体IgG中和活性检测；其中，1：对照；2：中和活性结果；

B：黏膜抗体IgA中和活性检测；其中，1：对照；2：中和活性结果。

图10是转基因乳酸菌免疫动物促进机体淋巴细胞增殖检测结果。

图11是IFN-γ水平ELISPOT检测结果。

图12是转基因乳酸菌免疫动物促进机体IL-2分泌水平的检测结果。

图13是转基因乳酸菌免疫动物促进机体TNFα分泌水平的检测结果。

图14是攻毒保护性试验结果；

其中，A：转基因乳酸菌免疫组动物攻毒后体温变化；B：对照组动物攻毒后体温变化；C：免疫组动物与对照组动物攻毒后存活率对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1  pYG-Tα1重组质粒的构建

1、胸腺肽Tα1基因的获得：

(1)参照Genbank中发布的胸腺肽Tα1基因序列设计PCR引物，引物的核苷酸序列为：

T-F:ATTGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAGGACTTAAAGGA（下划线表示酶切位点为BamHⅠ）；

T-R:TAAGGTACCATTTTCTGCCTCTTCCACAACTTCCTTCTTCTCCTTTAAGTCCTTGGTGGTGATTTCGGAGGGTACCATT（下划线表示酶切位点为KpnⅠ）。

(2)进行常规链式聚合酶反应扩增胸腺肽Tα1基因，具体步骤如下：将混合液 70℃加热5min，25℃退火5min，37℃延伸30min，最后70℃加热10 min。

所述混合液组成如下：

10×PCR Buffer	5.0 μL
		dNTP (2.5mM for each)	4.0 μL
引物T-F (10μM)	3.0 μL
		引物T-R (10μM)	3.0 μL
Taq DNA Polymerase (5U/μL)	2.5 μL
		ddH2O	32.5 μL。

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，如图1所示。

2、pYG-Tα1重组质粒的构建：

（1）将上述步骤（2）中PCR所得产物用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切反应体系为：10× PCR Buffer 2μL；PCR产物 4μL；BamHⅠ 1μL；KpnⅠ 1μL；ddH₂O  12μL。37℃水浴4h，使用胶回收试剂盒回收纯化目的基因：

①按每100mg琼脂糖凝胶加入300μL S1液的比例加入S1液，置于50℃水浴作用10min，每2min颠倒混匀一次，致使凝胶完全溶化；

②将溶化的琼脂糖凝胶液移入吸附柱，12000r/min离心30s，倒掉管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；

③吸附柱中加入500μL W1液，12000r/min离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

④吸附柱中加入500μL W1液，室温静置1min，12000r/min离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，12000r/min离空柱1min；

⑤将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入30μL ddH₂O，55℃水浴2min后，12000r/min离心1min，回收产物-20℃保存备用。

（2）将酶切回收后的PCR产物与同样经KpnⅠ、BamHⅠ酶切的表达载体pYG的片段进行连接，反应体系为：表达载体pYG 4 μL，PCR产物9 μL，T4 DNA ligase 1 μL，10× Ligase Buffer 2 μL，40％PEG8000 2 μL，ddH₂O 2 μL。16℃水浴连接18-20h，连接产物用于转化大肠杆菌JM109感受态细胞。具体操作步骤如下：从-70℃冰箱中取出保存的大肠杆菌JM109感受态细胞，置于冰浴中融化；加入10μL连接反应产物，轻轻混合均匀，冰浴30min；42℃热激60s，立即移入冰中，冰浴2-3min；加入900μL 37℃温浴的SOC培养基，37℃ 220r/min恢复培养1h；取适量涂布于LB琼脂平板（含100μg/mL Amp），37℃培养过夜，筛选阳性克隆。

挑取单菌落，接种于5mL含100 μg/mL Amp的LB培养基中，37℃ 220r/min培养过夜。利用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，操作步骤如下：取3mL过夜培养菌液，12000r/min离心5min，弃尽上清，加入250μL Buffer P1（含RNase）充分振荡悬浮菌体；加入250μLBuffer P2，立即温和地反复颠倒离心管6-10次以混匀，室温静置4min；加入350μL Buffer P3，温和反复颠倒离心管6-10次以混匀，12000r/min离心10min；将上清移入吸附柱中，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；加入500μL B1液，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；加入500μL W1液（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；加入500μL W1液（已加无水乙醇），室温静置1min，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 12000r/min空离离心柱1min；将吸附柱置于一个干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入60μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心1min，洗脱收集质粒DNA。采用酶切、PCR和测序方法鉴定阳性质粒，重组阳性质粒命名为pYG-Tα1，酶切鉴定如图2所示。

实施例2  pYG-Tα1-E2表达载体的构建

1、猪瘟病毒E2基因的获得

（1）利用TIANamp Virus RNA Kit提取猪瘟病毒基因组RNA，具体步骤如下：

（a） 用移液器将20μL Proteinase K加入一个干净的1.5mL离心管中，向离心管中加入200 μL猪瘟病毒细胞培养物；

（b） 加入200 μL Carrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15 sec混匀（注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀）；

（c）56℃孵育15min，加入250μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀。室温（15-25℃）放置5 min；

（d）将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2（吸附柱放在收集管中），盖上管盖，8000rpm 离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

（e）小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD（已加入无水乙醇），盖上管盖，8000rpm 离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管；

（f）小心打开吸附柱盖子，加入600 μL溶液PW（已加入无水乙醇），盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

（g）重复上述步骤一次。

（h）小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液。将吸附柱放回收集管中，12000 rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。

（i）将吸附柱放入一个RNase-Free离心管中，小心打开吸附柱盖，室温放置3min，使吸附膜完全变干。向膜中央加入20-150 μl RNase-Free ddH₂O，盖上盖子，室温放置5min。12000 rpm离心1 min，收集RNA。

(2)将提取的猪瘟病毒基因组RNA经反转录试剂盒反转录为cDNA，反应体系如下所示：

Total RNA	5 μL
		5×RT MasterMix	4 μL
Oligo (dT)20 Primer	1 μL
		RNase FreeH2O	10μL

反转录条件为：30℃ 5min，42℃ 30~60min，85℃ 5min。

(3)根据猪瘟病毒E2基因的核苷酸序列设计引物：

E-F：ATTGGTACCATGCGGCTAGCCTGCAAGGAA（下划线表示酶切位点为KpnⅠ），

E-R：TACCTCGAGTTAACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTA（下划线表示酶切位点为XhoⅠ）。

（4）以步骤（2）所得cDNA为模板，步骤（3）中E-F、E-R为引物进行PCR扩增E2基因，反应体系如下所示：

10×PCR Buffer	5.0 μL
		dNTP (2.5mM for each)	4.0 μL
引物E-F (10μM)	1.0 μL
		引物E-R (10μM)	1.0 μL
Taq DNA Polymerase (5U/μL)	0.5 μL
		cDNA模板	3.5 μL
ddH2O	35.0 μL

PCR反应程序为：94℃45s，60.9℃退火45s，72℃延伸60s，进行35个循环；72℃终延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，如图3所示。

2 、pYG-Tα1-E2表达载体的构建

将猪瘟病毒E2蛋白编码基因PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，反应体系（20μL）为：10× Buffer 2μL，PCR产物4μL，KpnⅠ1μL，XhoⅠ1μL，ddH₂O 12μL。37℃水浴4h，使用胶回收试剂盒回收纯化目的基因（具体操作步骤详见实施例1）。胶回收酶切PCR产物与同样经KpnⅠ、XhoⅠ酶切的pYG-Tα1载体片段进行连接，反应体系为：重组质粒pYG-Tα1 4 μL，PCR产物9 μL，T4 DNA ligase 1 μL，10× Ligase Buffer 2 μL，40％PEG8000 2 μL，ddH₂O 2 μL。16℃水浴连接18-20h，连接产物用于转化大肠杆菌JM109感受态细胞。重组阳性质粒结构如图4所示。具体操作步骤如下：从-70℃冰箱中取出保存的大肠杆菌JM109感受态细胞，置于冰浴中融化；加入10μL连接反应产物，轻轻混合均匀，冰浴30min；42℃热激60s，立即移入冰中，冰浴2-3min；加入900μL 37℃温浴的SOC培养基，37℃ 220r/min恢复培养1h；取适量涂布于LB琼脂平板（含100μg/mL Amp），37℃培养过夜。随机挑取单菌落，接种于5mL含100 μg/mL Amp的LB培养基中，37℃ 220r/min培养过夜。利用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒（具体操作步骤详见实施例1）。采用酶切、PCR和测序方法鉴定阳性质粒，重组阳性质粒命名为pYG-Tα1-E2，酶切鉴定结果如图5所示。 

实施例3 转基因乳酸菌的构建

1、乳酸菌感受态细胞的制备 

   （1）从-80℃冰柜中取出保存的保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）菌种，划线于无抗性的MRS琼脂培养基，37℃厌氧培养使其活化；

（2）从活化平板中挑取单菌落，接种于5mL无抗性的MRS培养基中，37℃培养过夜； 

（3）取过夜培养菌液按1:50比例接种于100mL新配制的MRS培养基中，37℃厌氧培养至 OD₆₉₀＝0.6-0.8，冰浴10min，4℃、4000r/min 离心10min，收集菌体沉淀；

（4）用预冷的EPWB（含0.6mmol/L NaH₂PO₄和0.1 mmol/L MgCl₂）洗液洗涤菌体3次，4℃、4000r/min 离心10min，收集菌体沉淀；

（5） 再用预冷的EPB（EPWB+0.3mol Sucrose）洗液洗涤菌体1次，4℃、4000r/min 离心10min，收集菌体沉淀；

（6）    菌体细胞用1mL预冷的EPB悬浮，分装于EP管中，-70℃保存备用。

2、电转化重组表达载体pYG-Tα1-E2入乳酸杆菌

使用质粒DNA小量提取试剂盒提取表达质粒pYG-Tα1-E2，取5μL质粒与100μL保加利亚乳杆菌感受态细胞轻轻混匀，将混合物缓缓加入预冷的规格为2mm的电转化杯中，冰浴5min，进行电击转化，电转化条件为100Ω、2.5kV、25μF。电击结束后，从电转化杯中吸出感受态细胞，将其加入800μL MRS恢复性培养基中，冰浴10min，37℃温育2h。取适量涂布于含10μg/mL Cm 抗性的MRS琼脂培养基中，37℃厌氧培养36h。

3、阳性转基因乳酸菌的鉴定

随机挑取MRS转化平板中的若干菌落，接种于5mL含10 μg/mL Cm的MRS培养基中培养过夜，提取质粒，经酶切、PCR及测序法鉴定阳性转基因乳酸菌。

4、转基因乳酸菌的遗传稳定性和结构稳定性评价 

将活化的转基因乳酸菌按1:10的比例接种于无Cm抗性的MRS培养基中，37℃厌氧培养至OD₆₀₀=1.0，依此方法连续传70代。取定量菌液作10倍系列稀释，分别涂布于含有Cm抗性和无Cm抗性的MRS琼脂平板，37℃厌氧培养，进行平板计数，以分析转基因乳酸菌的遗传稳定性。同时，随机挑取若干菌落进行培养，提取质粒，采用PCR方法对在没有选择压力下连续传70代的转基因乳酸菌中的目的基因完整性进行鉴定。实验结果表明，构建的转基因乳酸菌具有良好的遗传稳定性和结构稳定性。

实施例4  转基因乳酸菌消化环境耐受能力与肠道定植能力 

1、胃液环境耐受性试验

胃液的配制：取浓度为1mol/L的盐酸，加去离子水稀释，使pH值分别为1.5、2.5、3.5、4.5，以每100mL液体加1g胃蛋白酶的比例进行配制，充分溶解后，过滤除菌。将活化的转基因乳酸菌按10%接种量接种于不同pH值的胃液中，混匀，37℃静置培养，分别于接种后第0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h取样，以无菌去离子水进行10倍系列稀释，采用平板计数法进行活菌计数。实验结果显示，转基因乳酸菌在pH值为2.5及3.5的胃液环境中均能保持较高的存活率，在pH值为4.5时具有明显的生长趋势。 

2、肠液环境耐受性试验

肠液的配制：取KH₂PO₄ 0.68g，加去离子水溶解，调pH值至6.8，定容至100mL，加入1g胰蛋白酶，充分溶解后，过滤除菌。将活化的转基因乳酸菌按10%接种量接种于人工肠液中，混匀，37℃静置培养，分别于接种后第0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h取样，以无菌去离子水进行10倍倍比稀释，采用平板计数法进行活菌计数。实验结果显示，转基因乳酸菌在肠液环境中培养菌体浓度呈上升趋势，说明转基因乳酸菌具有良好的肠液环境耐受性。

3、胆汁耐受力试验 

在MRS培养基中加入牛胆汁，分别配制成胆汁质量份数为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的MRS液体培养基，118℃，灭菌15min，冷却。将活化的转基因乳酸菌以10%接种量接种于不同胆汁浓度的MRS液体培养基中，37℃静置、厌氧培养8h，观察生长情况。实验结果显示，转基因乳酸菌对胆汁环境具有良好的耐受性，在0.05%、0.1%的胆汁酸盐环境中生长良好，在胆汁酸盐浓度高达0.3%时，仍能缓慢生长。  

4、耐盐试验

    配制NaCl质量份数分别为4%、5%、6%、7%、8%、9%的MRS液体培养基，加入质量浓度为1g/L的溴钾酚紫作指示剂。将活化的转基因乳酸菌以1%接种量分别接入上述培养基，放入37℃恒温培养箱中培养3d，观察颜色的变化。实验结果表明，转基因乳酸菌对高盐环境具有良好的耐受性。 

5、 肠道定植能力检测

将100μM cFDA-SE荧光染料原液用DMSO稀释至50μM的工作浓度。活化的转基因乳酸菌37℃静置培养至OD₆₀₀≈1.0；取1mL菌体培养物4000r/min离心10min，将菌体沉淀用无菌PBS缓冲液洗涤2次；菌体沉淀中按1:1的比例加入50μM cFDA-SE和无菌PBS缓冲液，调整菌体浓度为10¹⁰cfu/mL，37℃水浴作用25min；4000r/min离心10min，菌体用无菌PBS缓冲液洗涤2次，除去残留的cFDA-SE荧光标记物，PBS缓冲液重悬菌体。将1周龄仔猪分为四组，每组3头，每头仔猪口服喂给浓度为10¹⁰cfu/mL cFDA-SE标记的转基因乳酸菌，于口服后的第1d、3d、5d、6d、7d随机处死一组仔猪，分别取其十二指肠、空肠、回肠、结肠，将其纵向切开，除去肠道中的食物颗粒和粪便残渣，以1cm肠段加150μL无菌PBS的比例，反复冲洗肠道，收集洗液，加入0.75%的甲醛溶液固定后，通过流式细胞仪检测洗液中带有cFDA-SE标记的阳性菌比例。实验结果显示，仔猪口服转基因乳酸菌后的第1d在十二指肠、空肠、回肠和结肠等部位的定植率分别为74.44%、87.17%、84.54%和89.79%，相应的荧光强度分别为31.46、55.69、39.7、63.74。随着仔猪的机体代谢和消化道内环境的作用，转基因乳酸菌在仔猪体内的定植率逐渐下降，但第7d时，仍保持较高的定植率（见表1）。

表1 转基因乳酸菌消化道定植能力检测结果

实施例5目的蛋白的诱导表达与鉴定

活化转基因乳酸菌，将活化菌液按1:10比例接种于含2％乳糖 MRS液体培养基中，37℃诱导20h。以未经诱导的转基因乳酸菌及非转基因乳酸菌为对照，进行SDS-PAGE分析，具体步骤为：取上述菌样培养液各10mL，12000r/min离心5min，取上清，将上清液进行冻干浓缩；加入1×PBS和2×SDS样品缓冲液（含DTT）各100μL，充分混匀，沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清；电泳槽及玻璃板用蒸馏水洗净，干燥后进行SDS-PAGE装置的组装；配制10％SDS-PAGE分离胶，充分混匀后加入密封好的制胶板中，在上面缓缓加一层水，使分离胶面平整，室温放置30min左右，分离胶完全凝固即可；配制5%的积层胶，尽弃分离胶上覆盖的水层，注入积层胶，灌满后小心插入加样梳，室温聚合；待积层胶凝固后，取下梳子，各取10 μL 样品加入样品孔中，以蛋白质标准分子量作为参考，进行电泳，初始电压为75V，待指示剂进入分离胶时，电压提高至125V，至电泳结束；取出凝胶，经考马斯亮蓝染色、脱色后，观察目的蛋白诱导表达效果，如图6（A）所示。

表达的目的蛋白进一步用Western blot方法鉴定，具体操作步骤为：用转印缓冲液清洗半干转印仪的石墨板并擦干，SDS-PAGE电泳结束后，取出凝胶并切除多余部分；切出6张Whatman 3M滤纸和一张NC膜，其大小与凝胶完全相等或略小，在NC膜一角作标记以明确转印后NC膜与凝胶对应的方向；凝胶、滤纸和NC膜在转印缓冲液中浸泡5min，在石墨电极上依次放3层3M滤纸-硝酸纤维膜-聚丙烯酰胺凝胶-3层3M滤纸。排尽气泡，合实转印仪，接通电源，50A恒流转印90min；转印结束后，取下NC膜，用去离子水漂洗2-3次，转移至丽春红染色液中染色1min，观察转印效果，用铅笔标出蛋白Marker位置，然后用去离子水漂洗硝酸纤维膜直至丽春红颜色完全褪去；将NC膜置于含5％脱脂乳的PBS封闭液中，4℃封闭过夜，弃封闭液，用PBST 洗膜3次，每次10min；将NC膜放入PBS稀释的一抗中，37℃作用2h，取出NC膜，用PBST洗膜3次，每次10min；将NC膜转入封闭液1:1000倍稀释的HRP标记抗体中，37℃作用2h，取出NC膜，用PBST洗膜3次，每次10min；将NC膜置于新配制的4-氯-1-萘酚－H₂O₂显色液中，37℃避光显色15min，观察结果，如图6（B）所示。

实施例6 免疫效果评价

1、口服免疫制剂的制备：将活化的转基因乳酸菌培养至OD₆₀₀≈1.0左右，5000r/min离心5min收集菌体，将菌体沉淀转移至含2％乳糖 MRS培养基中，37℃诱导20h，5000r/min离心5min收集菌体，用0.01mol/L无菌PBS缓冲液洗涤菌体1次，用悬浮缓冲液（0.2mol/L NaHCO3、5％水解酪蛋白胨、0.5%葡萄糖）悬浮，调整菌体浓度为10¹²CFU/mL。

2、实验动物：断奶仔猪分成3组，每组5头。实验Ⅰ组每头仔猪口服接种5mL 制备的转基因乳酸菌；实验Ⅱ组口服同等剂量的非转基因乳酸菌作为对照；实验组Ⅲ口服PBS溶液作为对照。 

3、免疫程序：免疫3次，每次免疫时间间隔为2w，每次连续免疫3d，每天1次。

4、样品的采集与处理：分别采集不同免疫时期实验动物的新鲜粪便、血清及肠道黏液样本。粪便的处理方法：每0.1g粪便加入0.5mL提取液，振荡30min，离心，收集上清液；血清的制备方法：采集免疫动物新鲜血液，4℃静止过夜，收集血清；肠液的采集：将免疫动物处死，剖解取其十二指肠至回肠段，除去肠内异物，刮取肠黏液，加入适量PBS缓冲液，振荡后离心，收集上清。

5、 肠道黏膜淋巴细胞的分离：解剖获取免疫仔猪的肠管，纵向剪开，分离上皮层与固有层；上皮层用无Mg²⁺的PBS（含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮钠）清洗至无血液及其它杂质，剪碎并用胶原酶溶解上皮细胞；匀浆液通过200目金属网过滤，获得淋巴细胞悬液；将硅化玻璃球高压消毒、冲洗和平衡后，将淋巴细胞悬浮液过柱，加入10% FBS-RPMI细胞培养液，进行细胞计数，调整淋巴细胞浓度2×10⁷/mL。

6、外周血淋巴细胞(PBMC)的分离：取免疫猪血液，加入抗凝剂，自然沉降2h，取上层血浆；采用密度梯度离心法分离猪外周血淋巴细胞，以Hank’s液洗涤2次，2000r/min离心10min；用细胞营养液悬浮细胞，调节细胞浓度为2×10⁷/mL。

7、 黏膜抗体IgA水平测定：采用ELISA方法检测，以纯化的目的蛋白包被ELISA反应板，4℃过夜；封闭液PBS-5%脱脂乳37℃封闭2h，PBST洗板；加入粪便提取液或肠道黏液样本，37℃作用1h；加入HRP标记兔抗猪IgA抗体，37℃作用1h，PBST洗板；加TMD底物显色液，37℃避光显色10-15min，加入终止液，酶标仪在波长490nm处测定每孔的光吸收值，结果如图7所示。

8、血清抗体IgG水平测定：采用ELISA方法检测，以纯化的目的蛋白包被ELISA反应板，4℃过夜；封闭液PBS-5%脱脂乳37℃封闭2h，PBST洗板；加入待检血清，37℃作用1h，PBST洗板；加入HRP标记兔抗猪IgG抗体，37℃反应1h，PBST洗板；加TMD底物显色液，37℃避光显色10-15min，加终止液后，酶标仪在波长490nm处测定每孔的光吸收值，结果如图8所示。

9、抗体中和活性检测：采用荧光抗体染色法，调整PK-15细胞浓度为2×10⁵/mL (本实验室液氮保存)，接种到微量培养板中，5% CO2培养箱37℃培养至汇合率为70%-80%的细胞单层；将待检血清或肠液过滤除菌，56℃灭活后用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释，每个稀释度重复4孔；将稀释的待检血清或肠液与含200TCID50/0.1mL的猪瘟病毒悬液等体积混合，37℃孵育1-2h，共同接种PK细胞，5% CO2培养箱37℃培养3-5d；用80% (v/v)冷丙酮固定，每孔加入50μL稀释的FITC标记的兔抗猪IgG或IgA，37℃感作1 h，PBST洗涤3次，加入30μL 50ml/L的甘油生理盐水，在荧光显微镜下观察。每孔中出现荧光斑数目大于或等于1，判为病毒没有被完全中和；4个重复孔中均未出现荧光斑，视为病毒完全被中和，该稀释度即为血清的效价；若4个孔中有1个孔为“+”，此时的效价按1:〔(N/2)3/4+N/2)〕计算，结果如图9所示。

10、淋巴细胞增殖检测：采用MTT法检测，采集免疫动物肠黏膜淋巴细胞、脾淋巴细胞和外周血淋巴细胞，加入适量Hank's缓冲液洗涤3次，离心；调整淋巴细胞浓度为1×10⁷个/mL，加入96孔培养板中，每孔100μL，2倍系列稀释，每个浓度设6个复孔，同时设阴性对照，5% CO2培养箱中37℃培养24 h；每孔加5mg/mL MTT溶液20μL，继续培养4h；1000r/min离心10min，吸弃上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，室温10-15min，酶标仪570nm下测定各孔A值，以未免动物的淋巴细胞为对照。增殖率按公式：(实验组A值-对照组A值)/实验组A值×100%计算，结果如图10所示。

11、细胞因子检测

IFN-γ 水平测定：采用ELISPOT方法检测，首先用抗猪IFN-γ抗体包被96孔反应平板，4℃过夜，PBST洗板3次；加入200μL PBS-1% BSA，37℃封闭1h；每孔加入100μL猪PBMC，并加入3-5ng/孔纯化的目的蛋白，置于5%CO2培养箱37℃孵育24h；弃细胞液，每孔加入200μL预冷的去离子水，4℃孵育10min，PBST洗板；依次加入生物素化的检测抗体和GABA结合的抗生物素抗体，37℃孵育1 h，洗板；加入底物室温显色15~20 min，然后用蒸馏水洗板两次，干燥，通过倒置显微镜和ELISPOT读板仪计数，结果如图11所示。

IL-2水平测定：采用猪IL-2酶联检测ELISA试剂盒进行检测，具体操作详见试剂盒说明书，结果如图12所示。

TNFα水平测定：采用猪TNF-α检测ELISA试剂盒进行检测，具体操作详见试剂盒说明书，结果如图13所示。

12、攻毒保护性试验：免疫猪经胃肠途径攻猪瘟病毒自然强毒分离株，剂量为10⁵ TCID₅₀每头份，未免疫的猪作为对照，验证转基因乳酸菌的免疫保护作用，记录临床症状，主要包括体温变化和病死情况等，同时每天采集试验猪的血清样本，检测病毒的清除率，结果如图14所示。

本发明依据猪瘟病毒主要经肠道黏膜感染途径入侵机体，继而引发动物疾病，增强机体特异性黏膜免疫，是阻止病原入侵的首要防线，利用乳酸菌固有的免疫佐剂效应、黏膜粘附特性、耐胆汁酸能力、动物肠道良好的栖居与定植能力及乳酸菌的益生作用而本身低免疫原性，作为介导黏膜免疫传递疫苗抗原的安全级活菌载体，以猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，胸腺肽为免疫增强剂，构建了具有抗猪瘟病毒功能的转基因乳酸菌制剂。本发明一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂能有效地刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而引起全身性系统免疫反应，可作为预防猪瘟的口服疫苗。

Claims (10)

1.一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌的重组表达载体pYG-Tα1-E2，其特征在于，如序列表Seq No.1所示。

2.一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，其特征在于，将以胸腺肽Tα1作为免疫增强剂，猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，构成的重组表达载体pYG-Tα1-E2电转化入乳酸菌中。

3.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于胸腺肽Tα1基因PCR扩增引物对，其特征在于，

上引物T-F：如序列表Seq No.2所示，

下引物T-R：如序列表Seq No.3所示。

4.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于猪瘟病毒E2蛋白基因PCR扩增引物对，其特征在于，

上引物E-F：如序列表Seq No.4所示，

下引物E-R：如序列表Seq No.5所示。

5.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 

(1)、参照Genbank中发布的胸腺肽(Tα1)基因序列设计PCR引物对，上引物T-F：如序列表Seq No.2所示；下引物T-R：如序列表Seq No.3所示；

(2)、根据猪瘟病毒E2蛋白基因设计PCR扩增引物对，上引物E-F：如序列表Seq No.4所示，下引物E-R：如序列表Seq No.5所示；

(3)、进行常规链式聚合酶反应分别扩增Tα1基因及E2基因；

(4)、构建重组表达载体pYG-Tα1- E2；

(5)、构建转基因乳酸菌。

6.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，其特征在于，用于预防猪瘟的口服疫苗。

7.根据权利要求5所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）采用常规链式聚合酶反应扩增Tα1基因的具体步骤如下：将混合液在70℃加热5min，25℃退火5min，37℃延伸30min，最后70℃加热10 min；所述混合液组成如下：根据权利要求5所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）采用常规链式聚合酶反应扩增Tα1基因的具体步骤如下：将混合液在70℃加热5min，25℃退火5min，37℃延伸30min，最后70℃加热10 min；

    所述混合液组成如下：

10×PCR Buffer 5.0 μL dNTP (2.5mM for each) 4.0 μL 引物T-F (10μM) 3.0 μL 引物T-R (10μM) 3.0 μL Taq DNA Polymerase (5U/μL) 2.5 μL ddH2O 32.5 μL

。

8.根据权利要求5所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）采用常规链式聚合酶反应扩增E2基因的具体步骤如下：采用TIANamp Virus RNA Kit提取猪瘟病毒基因组RNA，经RNA反转录试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增猪瘟病毒E2蛋白基因，将混合液在94℃45s，60.9℃退火45s，72℃延伸60s，进行35个循环；72℃终延伸10 min，所述混合液组成如下：

10×PCR Buffer 5.0 μL dNTP (2.5mM for each) 4.0 μL 引物E-F (10μM) 1.0 μL 引物E-R (10μM) 1.0 μL Taq DNA Polymerase (5U/μL) 0.5 μL cDNA模板 3.5 μL ddH2O 35.0 μL

。

9.根据权利要求5所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）重组表达载体pYG-Tα1-E2的构建方法具体步骤如下：先将PCR产物胸腺肽(Tα1)基因经BamHⅠ、KpnⅠ酶切，利用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段，将纯化后的目的基因克隆入表达载体pYG的BamHⅠ、KpnⅠ位点，构建重组质粒pYG-Tα1；再将PCR产物猪瘟病毒E2蛋白基因经KpnⅠ、XhoⅠ酶切，利用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片段，将纯化后的目的基因克隆入重组质粒pYG-Tα1的KpnⅠ、XhoⅠ位点，将鉴定正确的重组表达载体命名为pYG-Tα1-E2。

10.根据权利要求5所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（5）构建转基因乳酸菌的乳酸菌菌株为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）；采用电转化法构建转基因乳酸菌，电转化条件为：100Ω、2.5kV、25μF。

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