CN111454982A - 一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及其应用 - Google Patents

一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及其应用，涉及基因重组技术领域；利用所述重组载体可构建表达非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组乳酸杆菌，将能分别分泌蛋白p72和p54的乳酸杆菌菌液混合后，制备可用于预防非洲猪瘟病毒的口服活菌制剂。利用本发明创制的口服活菌制剂可安全、有效、快速的预防非洲猪瘟病毒对猪的感染，且不包含免疫过程。

Description

一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及 其应用
技术领域
本发明属于基因重组技术领域，具体涉及一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever virus，ASFV)是一种急性、热性、高度接触性动物传染病，其发病率和致死率可高达100％，是养猪业头号杀手，目前没有商品疫苗可用。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，病毒粒子的直径为175～215纳米，呈20面体对称，有囊膜；基因组为双股线状DNA，大小170～190kb。
非洲猪瘟(ASFV)是高度接触性的传染病，经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴液和血液侵入全身。
由于目前还没有针对ASFV的商品化疫苗上市，目前最安全、最经济、最有效的防控手段是生物安全防控，防控原则是阻断病毒与机体接触，但是现有的方法都不能保证病毒和机体不再接触。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及其应用，构建表达非洲猪瘟p72和p54蛋白的乳酸杆菌表达系统，为研制用于阻断病毒感染的黏膜感染阻断口服剂提供理论基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体，所述重组载体以乳酸杆菌表达载体pVE5523为基础载体，分别将编码非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的核苷酸序列克隆到所述基础载体的EcoRV和SalI酶切位点之间。
优选的，所述非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白包括中国吉林株非洲猪瘟p72蛋白和p54蛋白；编码所述中国吉林株非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述中国吉林株非洲猪瘟p54蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组乳酸杆菌，所述重组乳酸杆菌包含所述重组载体。
本发明还提供了所述重组乳酸杆菌的构建方法，包括以下步骤：(1)分别将编码非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列和编码非洲猪瘟p54蛋白的核苷酸序列克隆到pVE5523乳酸杆菌表达载体中，构建重组质粒pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54；
(2)分别将重组质粒pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54转化至乳酸杆菌感受态中，得到表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌。
本发明还提供了一种预防非洲猪瘟感染的口服活菌制剂，所述口服活菌制剂的有效成分包括利用所述构建方法构建得到的表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌。
优选的，所述表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌的活菌比为(0.8～1.2)×108cfu:(0.8～1.2)×108cfu。
本发明提供了一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体，利用所述重组载体可构建表达非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组乳酸杆菌，将所述表达非洲猪瘟抗原蛋白p72和p54重组乳酸杆菌混合后，制备可用于预防非洲猪瘟病毒感染的口服活菌制剂。在本发明中，猪服食所述制剂后，制剂中乳酸杆菌分泌的抗原蛋白(蛋白p72和p54混合物)黏附到机体细胞表面黏膜，并在黏膜表面形成抗原蛋白生物膜，抗原蛋白与靶细胞上的病毒结合位点结合，封闭黏膜表面的病毒受体蛋白位点，起到生态占位的作用，当环境中的活病毒入侵机体时，靶细胞上的病毒结合位点已被抗原蛋白生物膜完全封闭，病毒无法与靶细胞上的病毒结合位点结合，从而有效阻断病毒与细胞表面上的受体结合，起到预防非洲猪瘟的效果。
相较于疫苗，利用本发明创制的口服剂更加安全、有效、快速。本发明所述口服剂的安全性表现在有效成分只分泌病毒功能性蛋白，无病毒基因存在，不会导致病毒变异；有效性表现在所述口服剂的有效成分只分泌保护性抗原，作用于机体表面粘膜部位，覆盖非洲猪瘟病毒靶细胞所在的黏膜表面，病毒入侵时，其与黏膜表面细胞结合的位点被铸锻及封闭，从而阻断病毒感染路径；快速性表现在乳酸杆菌表达的分泌蛋白直接抢占了病毒与靶细胞结合的受体从而阻断病毒感染，不需要免疫应答过程。
附图说明
图1为本发明中重组载体pVE5523-ASFV-p72的质粒结构图；
图2为本发明中重组载体pVE5523-ASFV-p54的质粒结构图；
图3为本发明中验证p72表达的扩增曲线；
图4为本发明中验证p54表达的扩增曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体，所述重组载体以乳酸杆菌表达载体pVE5523为基础载体，分别将编码非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的核苷酸序列克隆到所述基础载体的EcoRV和SalI酶切位点之间。
本发明所述非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白包括中国吉林株非洲猪瘟p72蛋白和p54蛋白；编码所述中国吉林株非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述中国吉林株非洲猪瘟p54蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆到所述基础载体的EcoRV和SalI酶切位点之间，形成重组载体pVE5523-ASFV-p72，重组质粒结构如图1所示；将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到所述基础载体的EcoRV和SalI酶切位点之间，形成重组载体pVE5523-ASFV-p54，重组质粒结构如图2所示。本发明对所述重组载体的构建方法并没有特殊限定，利用常规的重组载体构建方法即可。
本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组乳酸杆菌，所述重组乳酸杆菌包含所述重组载体。
本发明还提供了所述重组乳酸杆菌的构建方法，包括以下步骤：(1)分别将编码非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列和编码非洲猪瘟p54蛋白的核苷酸序列克隆到pVE5523乳酸杆菌表达载体中，构建重组质粒pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54；
(2)分别将重组质粒pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54转化至乳酸杆菌感受态中，得到表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌。
本发明在进行克隆前，优选对GenBank中查询得到的中国吉林株非洲猪瘟p72和p54基因序列进行优化，形成如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列后再进行所述克隆。
本发明在所述克隆时，优选对所述载体pVE5523以SalI/EcoRV进行双酶切后，同时将上述如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列经过同种酶的双酶切后，将酶切片段分别连接后，形成如图1和图2所示的重组质粒pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54。
本发明优选利用电转化的方式分别将所述重组质粒转化ATCC393干酪乳酸杆菌感受态细胞，从而获得所述重组乳酸杆菌。本发明在得到所述重组乳酸杆菌后优选还包括将所述重组乳酸杆菌在MRS液体培养基中进行扩增，提取重组质粒后进行荧光定量PCR检测。本发明所述荧光定量PCR检测所使用的引物和扩增序列分别如下所示：
检测p72荧光定量PCR：
p72上游引物(SEQ ID NO.3)：AGTTCGGATGTCACAACGCTTG；
p72下游引物(SEQ ID NO.4)：TTTGCTTTGGTGCGGCTTGT；
p72扩增序列(SEQ ID NO.5)：
AGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAA；
p54荧光定量PCR：
p54上游引物(SEQ ID NO.6)：AGCCACTCCACAACCAGGTAC；
p54下游引物(SEQ ID NO.7)：GCCCTCCAGTTGCCATGATTAG；
p54扩增序列(SEQ ID NO.8)：
AGCCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCCACTACAGGCAACGTAGGCAAGCCAATTACAGACAGGCCAGTTGCCATGAATAGGCCAGTTACGAACAGCTCGGTCGCGGACAGGCCAGTTATGAACAACCCAGTTACGGACAGACTAATCATGGCAACTGGAGGGC。
本发明利用所述构建方法制备得到的重组乳酸杆菌，根据重组质粒的不同，而分别分泌重组非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白p72和p54。
本发明还提供了一种预防非洲猪瘟感染的口服活菌制剂，所述口服活菌制剂的有效成分包括利用所述构建方法构建得到的表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌。
本发明所述口服活菌制剂中能分泌重组非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白p72和p54的混合菌中，所述表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌的活菌比优选为(0.8～1.2)×108cfu:(0.8～1.2)×108cfu，更优选为1×108cfu:1×108cfu。
下面结合实施例对本发明提供的包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
非洲猪瘟p72和p54基因序列的获得
非洲猪瘟p54蛋白存在于病毒粒子内层囊膜，是ASFV的主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，参与病毒对靶细胞的吸附与进入。根据GenBank中中国吉林株非洲猪瘟p72和p54基因序列(P72：GenBank:MK189456.1；P54：GenBank:MK214679.1)，并对序列进行优化，改造后序列由南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
实施例2
重组表达载体pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54的获得
1材料与方法
1.1材料及来源
限制性内切酶SalI、EcoRV均购自NEB公司，Taq酶、dNTP、DNA Marker DL2000、DL15000、Agarose Gel DNA Purification Kit、Mini BEST Plasmid Purification Kit购自大连宝生物公司。克隆载体pVE5523由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。
1.2试验方法
克隆载体pVE5523以SalI/EcoRV双酶切后的小片段，分别与经同样双酶切的p72和p54基因片段连接、电转化后提取质粒并送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序验证。
2试验结果
重组质粒测序结果：重组质粒经基因测序后与插入的p72和p54基因片段进行序列比对，测序结果与预期相符，说明合成的p72和p54基因片段成功插入到乳酸杆菌载体pVE5523中，重组质粒构建成功，阳性质粒命名为pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54。
实施例3
表达非洲猪瘟p72和p54基因的制备及检测
1材料与方法
1.1材料及来源
红霉素(Emr)购自拜尔迪生物技术有限公司。
1.2试验方法
目的基因在乳酸杆菌ATCC393中的电转化与抗性菌株的筛选：电转化后的乳酸杆菌ATCC393涂布于含5μg/ml红霉素的MRS固体培养板上，在30℃培养箱中培养72h，将平板上的菌落挑斑后接种到含5μg/ml红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养72h；提取细菌中的质粒，采用荧光定量PCR进行鉴定，鉴定引物及扩增序列如下。
检测p72荧光定量PCR：
p72上游引物(SEQ ID NO.3)：AGTTCGGATGTCACAACGCTTG；
p72下游引物(SEQ ID NO.4)：TTTGCTTTGGTGCGGCTTGT；
p72扩增序列(SEQ ID NO.5)：
AGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAA；
p54荧光定量PCR：
p54上游引物(SEQ ID NO.6)：AGCCACTCCACAACCAGGTAC；
p54下游引物(SEQ ID NO.7)：GCCCTCCAGTTGCCATGATTAG；
p54扩增序列(SEQ ID NO.8)：
AGCCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCCACTACAGGCAACGTAGGCAAGCCAATTACAGACAGGCCAGTTGCCATGAATAGGCCAGTTACGAACAGCTCGGTCGCGGACAGGCCAGTTATGAACAACCCAGTTACGGACAGACTAATCATGGCAACTGGAGGGC。
2试验结果
采用荧光定量PCR对扩增的重组质粒进行检测，扩增曲线分别如图3～4所示，阳性重组质粒具有典型的扩增曲线，CT值19～22不等，ATCC393感受态对照没有扩增曲线。表明重组质粒pVE5523-ASFV-p54和pVE5523-ASFV-p72均已成功转化到了ATCC393感受态细胞中。
实施例4
重组乳酸杆菌表达系统的培养方法
将重组乳酸杆菌表达系统分别以1％接种量接种到乳酸杆菌MRS液体培养基，35℃，72h后收获发酵液。
重组乳酸杆菌活菌计数
用平板表面散布法：
l.编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2.稀释 用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释，其余依次类推。
3.取样 用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。
4.倒平板 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。
5.计数 培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位(cfu)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5。
实施例5
将实施例4制备的能分泌重组p72和p54蛋白的乳酸杆菌分别稀释成0.8～1.2X108cfu/ml的菌液，并按1:1的体积比混合。将混合菌液以口服液的形式对SPF新西兰兔和SD大鼠给药，同时设置阴性对照组A口服同体积的生理盐水、对照组B口服同体积的MRS培养液，每组新西兰兔子和SD大鼠各4只，观察2周，24只动物均没有出现体温异常、过敏等异常不良现象。这表明本发明制备的能分泌重组p72和p54蛋白的乳酸杆菌安全、无副作用。
实施例6
安徽省太湖县某养殖场约存有300头猪，体型20～100kg不等，分为三个区，实验开始前，养殖二区已经有部分猪群发病并陆续死亡。2020年1月23日对该养殖场开展重组乳酸杆菌制剂试验，试验周期为21天，分为3组，按5ml/头的剂量口服给药。其中对照组为养殖一区共112头猪，试验组分别为养殖二区和三区，实验开始前养殖一区和三区猪群处于健康状态下，二区在1月23日开展试验前已处于非洲猪瘟疫情爆发状态下。
试验结果如表1所示，对照组养殖一区猪数量由112到66头，死亡46头，死亡率达41.07％；养殖二区由于试验前已处在发病期，使用后数量由45减到28头，死亡17头，死亡率为37.78％；养殖三区猪群试验期间死亡1头，死亡率1.08％。整个试验阶段试验组(养殖二区和三区)共死亡18头，死亡率为13.04％。试验结果表明，重组乳酸杆菌制剂效果良好。
表1重组乳酸杆菌试验效果对比
Figure BDA0002467813870000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 长沙绿叶生物科技有限公司
<120> 一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体、重组菌及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgacatgg gtgtactgct cacacagagg acgctgctca gtctggtcct tgcactcctg 60
tttccaagca tggcgagcat gcatatgaaa gggatgcacg tggcccaacc tgcagtagtg 120
ctggccaaca gccggggtgt tgccagcttt gtgtgtgagt atgggtctgc aggcaaagct 180
gccgaggtcc gggtgacagt gctgcggcgg gccggcagcc agatgactga agtctgtgcc 240
gcgacatata ctgtggagga tgagttgacc ttccttgatg actctacatg cactggcacc 300
tccaccgaaa acaaagtgaa cctcaccatc caagggctga gagccgtgga cactgggctc 360
tacatctgca aggtggagct cctgtaccca ccaccctact atgtgggtat gggcaacggg 420
acccagattt atgtcattga tccagaacca tgcccagatt ctgatggtgg cggtggctcg 480
ggcggtggtg gatctggtgg cggcggatct acaaagacca aaccaccatc ccccatatcg 540
ccaggctccg aagtggccgg gtcctcggtc ttcatcttcc ctccaaaacc caaggacacc 600
ctcatgatct cccagacccc cgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtcag caaggagcac 660
gccgaggtcc agttctcctg gtacgtggac ggcgtagagg tgcacacggc cgagacgaga 720
ccaaaggagg agcagttcaa cagcacctac cgtgtggtca gcgtcctgcc catccagcac 780
caggactggc tgaaggggaa ggagttcaag tgcaaggtca acaacgtaga cctcccagcc 840
cccatcacga ggaccatctc caaggctata gggcagagcc gggagccgca ggtgtacacc 900
ctgcccccac ccgccgagga gctgtccagg agcaaagtca ccgtaacctg cctggtcatt 960
ggcttctacc cacctgacat ccatgttgag tggaagagca acggacagcc ggagccagag 1020
ggcaattacc gcaccacccc gccccagcag gacgtggacg ggaccttctt cctgtacagc 1080
aagctcgcgg tggacaaggc aagatgggat catggagaaa catttgagtg tgcggtgatg 1140
cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccatct ccaagactca gggtaaacct 1200
cctccatacc agcctctcgg cggcggcggc agcgaattcg gatcccatat ggacaagatt 1260
atattggccc aagacttgct gaatagcagg atctctaaca ttaaaaatgt gaacaaaagt 1320
tatgggaaac ccgatcccga acccactttg agtcaaatcg aagaaacaca tttggtgcat 1380
tttaatgcgc attttaagcc ttatgttcca gtagggtttg aatacaataa agtacgcccg 1440
catacgggta cccccacctt gggaaacaag cttacctttg gtattcccca gtacggagac 1500
tttttccatg atatggtggg ccatcatata ttgggtgcat gtcattcatc ctggcaggat 1560
gctccgattc agggcacgtc ccagatgggg gcccatgggc agcttcaaac gtttcctcgc 1620
aacggatatg actgggacaa ccaaacaccc ttagagggcg ccgtttacac gcttgtagat 1680
ccttttggaa gacccattgt acccggcaca aagaatgcgt accgaaactt ggtttactac 1740
tgcgaatacc ccggagaacg actttatgaa aacgtaagat tcgatgtaaa tggaaattcc 1800
ctagacgaat atagttcgga tgtcacaacg cttgtgcgca aattttgcat cccaggggat 1860
aaaatgactg gatataagca cttggttggc caggaggtat cggtggaggg aaccagtggc 1920
cctctcctat gcaacattca tgatttgcac aagccgcacc aaagcaaacc tattcttacc 1980
gatgaaaatg atacgcagcg aacgtgtagc cataccaacc cgaaatttct ttcacagcat 2040
tttcccgaga actctcacaa tatccaaaca gcaggtaaac aagatattac tcctatcacg 2100
gacgcaacgt atctggacat aagatatc 2128
<210> 2
<211> 574
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgacatgg attctgaatt ttttcaaccc gtttatccgc ggcattatgg cgaatgtttg 60
tcaccaacct ctacaccgag cttcttctcc acacatatgt gtactattct cgttgctatc 120
gtggtcttaa tcattattat catcgttcta atttatctgt tttcttcaag aaagaaaaaa 180
gctgctgccc ccgctattga ggaggaagat atacagttta taaatcctta tcaagatcag 240
cagtgggcag gagccactcc acaaccaggt acctctaaac cggctggagc cactacaggc 300
aacgtaggca agccaattac agacaggcca gttgccatga ataggccagt tacgaacagc 360
tcggtcgcgg acaggccagt tatgaacaac ccagttacgg acagactaat catggcaact 420
ggagggccag cggccgcaag tgctccttcg gatgagcttt atacaacagc cactactcag 480
aacactgctt cacaaacaat gccggctgtt gaagctctac ggcaaagaag cacctataca 540
cacaaagacc tggaaaactc cttgtaagat atca 574
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttcggatg tcacaacgct tg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgctttgg tgcggcttgt 20
<210> 5
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agttcggatg tcacaacgct tgtgcgcaaa ttttgcatcc caggggataa aatgactgga 60
tataagcact tggttggcca ggaggtatcg gtggagggaa ccagtggccc tctcctatgc 120
aacattcatg atttgcacaa gccgcaccaa agcaaa 156
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agccactcca caaccaggta c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccctccagt tgccatgatt ag 22
<210> 8
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agccactcca caaccaggta cctctaaacc ggctggagcc actacaggca acgtaggcaa 60
gccaattaca gacaggccag ttgccatgaa taggccagtt acgaacagct cggtcgcgga 120
caggccagtt atgaacaacc cagttacgga cagactaatc atggcaactg gagggc 176

Claims (6)

1.一种包含非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体以乳酸杆菌表达载体pVE5523为基础载体，分别将编码非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的核苷酸序列克隆到所述基础载体的EcoRV和SalI酶切位点之间。
2.根据权利要求1所述重组载体，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白包括中国吉林株非洲猪瘟p72蛋白和p54蛋白；编码所述中国吉林株非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述中国吉林株非洲猪瘟p54蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种表达非洲猪瘟病毒免疫原性蛋白的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述重组乳酸杆菌包含权利要求1或2所述重组载体。
4.权利要求3所述重组乳酸杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别将编码非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列和编码非洲猪瘟p54蛋白的核苷酸序列克隆到pVE5523乳酸杆菌表达载体中，构建重组质粒pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54；
(2)分别将重组质粒pVE5523-ASFV-p72和pVE5523-ASFV-p54转化至乳酸杆菌感受态中，得到表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌。
5.一种预防非洲猪瘟感染的口服活菌制剂，其特征在于，所述口服活菌制剂的有效成分包括利用权利要求4所述构建方法构建得到的表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌。
6.根据权利要求1所述口服活菌制剂，其特征在于，所述表达非洲猪瘟p72蛋白的重组乳酸杆菌和表达非洲猪瘟p54蛋白的重组乳酸杆菌的活菌比为(0.8～1.2)×108cfu:(0.8～1.2)×108cfu。
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