CN108794583B - 貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗 - Google Patents

Abstract

貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗，属于重组疫苗制备领域。本发明针对貉细小病毒肠炎灭活疫苗免疫效力较低，活疫苗毒力返强的问题，提供了一种貉细小病毒病毒样颗粒，是将经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV‑VP2‑OPTI与昆虫表达载体pFastBac1连接得到供体质粒，然后转化到杆状病毒DH10 Bac E.coli中经培养获得表达貉细小病毒RDPV‑VP2蛋白的重组杆状病毒，然后转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后收集细胞病毒液获得的。所述貉细小病毒病毒样颗粒与氢氧化铝胶佐剂混合后可制备获得貉细小病毒性肠炎疫苗。本发明适用于貉细小病毒性肠炎疫苗的制备。

Description

貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗 粒制备的疫苗

技术领域

本发明属于重组疫苗制备领域，具体涉及一种貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗。

背景技术

貉细小病毒性肠炎主要引起貉的肠炎，死亡率可达30％-60％，目前预防该病的主要手段是疫苗免疫，制备该疫苗目前现有的主要为全病毒灭活苗或活疫苗，主要缺点是灭活疫苗存在免疫效力较低，活疫苗存在毒力返强的风险。

发明内容

本发明针对目前貉肠炎灭活疫苗免疫效力较低，活疫苗毒力返强的问题，提供了一种貉细小病毒病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后获得。

进一步地，所述表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒是将经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI与昆虫表达载体连接得到供体质粒，然后将该供体质粒转化到杆状病毒中经培养获得的，所述经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述昆虫表达载体为pFastBac1，所述杆状病毒为DH10 Bac E.coli。

本发明还提供了一种貉细小病毒性肠炎疫苗，所述疫苗含有上述的貉细小病毒病毒样颗粒。

本发明还提供了上述貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)病毒基因组的提取：将分离的貉细小病毒RDPV-HeB17株接种于F81细胞中，培养至75％以上病变后，收集病毒液提取病毒基因组DNA，所述貉细小病毒株RDPV-HeB17保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15483。

(2)貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI供体质粒构建：以步骤(1)提取的貉细小病毒DNA为模板，PCR扩增获得RDPV-VP2基因序列，其序列如SEQ ID NO:2所示，根据昆虫细胞偏爱密码子，对RDPV-VP2基因序列进行密码子优化，所述优化后的基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQID NO:1所示，以RDPV-VP2-OPTI模板，PCR扩增获得SF-RDPV-VP2-OPT1，经酶切后连入经同样酶切的昆虫表达载体pFastBac1中，得到供体质粒pFastBacI-RDPV-VP2-OPTI。

(3)貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI重组杆状病毒的构建：将供体质粒转化杆状病毒DH10Bac E.coli感受态细胞，获得表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒。

(4)转染及收获病毒：将步骤(3)获得的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后收集细胞病毒液，获得貉细小病毒病毒样颗粒。

优选地，步骤(2)所述用于扩增RDPV-VP2基因的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；所述用于扩增RDPV-VP2-OPTI基因的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，步骤(2)所述SF-RDPV-VP2-OPT1及昆虫表达载体pFastBac1双酶切所用的内切酶为NotⅠ和HindⅢ。

优选地，步骤(1)、步骤(4)所述细胞出现病变或感染后，细胞病毒液收集的方法为：将病变或感染细胞反复冻融2次，将细胞上清液于1000rpm离心5min，然后用0.2um的滤膜过滤，获得细胞病毒液。

本发明还提供了上述貉细小病毒病毒样颗粒在制备貉细小病毒性肠炎疫苗中的应用，是将貉细小病毒病毒样颗粒与氢氧化铝胶佐剂混合后制备获得貉细小病毒性肠炎疫苗，所述氢氧化铝在疫苗中的终浓度为5％。

优选地，所述用于制备貉细小病毒性肠炎疫苗的貉细小病毒病毒样颗粒对猪红细胞的血凝效价为2^8～2¹²。

所述血凝效价的检测方法为微量血凝检测方法。

有益效果

本发明提供的貉细小病毒病毒样颗粒，是根据昆虫细胞偏爱密码子，对貉细小病毒基因RDPV-VP2进行优化，将优化后的基因RDPV-VP2-OPTI与昆虫表达载体连接，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统获得表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒，并将其转染SF21细胞来生产貉细小病毒病毒样颗粒，然后将所述的貉细小病毒病毒样颗粒与佐剂混合，即制得貉细小病毒性肠炎疫苗，本发明制备的貉细小病毒性肠炎疫苗具有产量高，生产成本低，免疫原性好，安全性高，便于大规模化生产等优点，对抵抗貉细小病毒性强毒具有良好的免疫效果和预防效果。

附图说明

图1pFastBacI-RDPV-VP2-OPT1质粒酶切鉴定，其中marker条带自下至上为：100,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,10000；1所示为酶切前的质粒，2为经BamHI和HindIII双酶切后的片段。

具体实施方式

本实施方式所用的DNA提取试剂盒购买自博日bioflux，产品型号为组织基因组提取试剂盒，BSC04S1。

基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

F81细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供、SF21细胞购买自Thermo Fisher。

Cellfectin Reagent购买自Thermo Fisher公司，产品货号10362100。

DH10Bac E.coli感受态细胞购买自Thermo Fisher。

pEASY-Blunt Simple购买自北京全式金生物技术有限公司。

质粒提取试剂盒购买自博日bioflux型号组织基因组提取试剂盒，BSC04S1。

所述的一抗为貉细小病毒抗体阳性血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的貉IgG抗体，均为实验室按常规方法自制。

限制性内切酶，连接酶购买自Thermo Fisher，其他试剂如无特殊说明，均通过商业化购买获得。

所述MEM培养基：含谷氨酰胺的基础培养基，购自CORNING公司。

其他试剂或仪器均可通过现有的商业化途径购买获得。

下面具体描述本发明所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法。

实施例1.貉细小病毒病毒样颗粒制备方法。

(1)病毒基因组的提取：

貉细小病毒RDPV-HeB17株的分离：采取患肠炎死亡貉肠道内容物，将内容物用0.2M PBS稀释10倍后，按照MOI为0.1～0.3接种至F81细胞上，细胞贴壁后换含2％新生牛血清的MEM培养基，置37℃二氧化碳培养箱中培养，每日观察病变，70％出现细胞拉网、脱落特异性病变现象时即收获冻存，-20℃冻融2次。

将分离的貉细小病毒RDPV-HeB17株同步接种于F81细胞中，37℃培养3-5天，75％以上病变后，反复冻融2次，对收获的病毒液进行DNA的提取，具体步骤见DNA提取试剂盒。

(2)貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI供体质粒构建：

a.貉细小病毒基因RDPV-VP2序列的克隆与测定：

参考Genbank M38245中公布的貉细小病毒RDPV-VP2基因序列设计PCR扩增引物：

SEQ ID NO：3：上游引物：RDPV-VP2-F2：GCCGGTGCAGGACAAGTA；

SEQ ID NO：4：下游引物：RDPV-VP2-R2：CCACCCACACCATAACAACA。

以步骤(1)提取的貉细小病毒DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，获得PCR产物RDPV-VP2，产物大小为2013bp，将RDPV-VP2连入pEASY-Blunt Simple载体中，得到质粒RDPV-VP2-pEASY。选取电泳条带大小正确的质粒送公司测序，得到精确的RDPV-VP2基因，序列如SEQ ID NO：2所示。

所述PCR扩增体系为：50μL，其组成为：10ng/μL Extacted DNA 4μL，2×EasyTaqPCR SuperMix：25μL，上下游引物各1μL，ddH₂O19μL，所述PCR扩增程序为：95℃，5min，94℃，45s，55℃，90s，72℃，2min，35个循环。

所述RDPV-VP2基因与pEASY-Blunt Simple载体的连接体系为：

RDPV-VP2基因PCR产品胶回收的DNA片段20ng/μL 4μL，加入pEASY-Blunt Simple载体1μL，离心混匀后置37℃水浴锅内边接15min。

b.貉细小病毒RDPV-VP2序列优化、分析及引物设计。

根据昆虫细胞偏爱密码子，保证编码氨基酸不变前提下，将RDPV-VP2序列进行优化，优化后的基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQ ID NO：1所示，进行基因合成。然后以RDPV-VP2-OPTI序列模板，以相应引物进行PCR扩增。

上游引物为：RDPV-VP2-OPTI-F序列如SEQ ID NO：5所示：

ATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCGCCACCATGCTGCTGGTGAACCAGTCCCACCAGGGCTTCAACAAGGAG；

下游引物序列为：RDPV-VP2-OPTI-R序列如SEQ ID NO：6所示：

TATGATCCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTACAGCTTACGAGGAGCCAGCTGGGACTTTTCGTACA。

得到PCR扩增产物SF-RDPV-VP2-OPT1，通过NotⅠ和HindⅢ限制性内切酶将SF-RDPV-VP2-OPT1连入经同样酶切的载体pFastBac1中，得到重组载体pFastBacI-RDPV-VP2-OPT1。

所述PCR扩增体系为：50μL，其组成为：10ng/μL Extacted DNA 4μL，2×EasyTaqPCR SuperMix:25μL，上下游引物各1μL，ddH₂O19μL。

所述PCR扩增程序为：95℃，5min，94℃，45s，55℃，90s，72℃，2min，35个循环。

所述SF-RDPV-VP2-OPT1及pFastBac1双酶切体系、条件分别为：

37℃水浴1h。

37℃水浴1h。

上述SF-RDPV-VP2-OPT1及pFastBac1双酶切后经纯化，然后连接：

连接体系为：

室温40min。获得供体质粒pFastBacI-RDPV-VP2-OPT1。

(3)貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI重组杆状病毒(Bacmid，杆粒)的构建：将供体质粒pFastBacI-RDPV-VP2-OPT1转化杆状病毒DH10Bac E.coli感受态细胞，获得表达貉细小病毒RDPV-VP2的重组杆状病毒；

a.杆粒菌株转化

(1)DH10Bac E.coli感受态细胞冰上解冻；

(2)将200ng的pFastBacI-RDPV-VP2-OPT1转移载体，缓慢加入感受态细胞中，轻轻混匀；

(3)冰上放置30min，然后42℃热激90s；

(4)迅速冰上静置5min；

(5)向EP管里加入900μL SOC.培养基，每100mlSOC培养基组份浓度：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.05％(W/V)氯化钠，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖；

(6)37℃，225rpm震荡摇菌4h；

(7)取100μL菌液涂于含有50ug/ml卡那霉素，7ug/ml庆大霉素，10ug/ml四环素(所述浓度为终浓度)，以及添加了10μL浓度为24mg/ml的IPTG及40μL浓度为20mg/ml x-gal的LB平板培养基，所述LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g。

(8)37℃，倒置培养48h。

b.杆状病毒重组质粒鉴定引物的设计

上游引物M13F 5’-CCCAGTCACGACGTT GTAAAACG-3’；

下游引物M13R 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’。

c.杆状病毒重组质粒的鉴定

1)挑取3个白色单克隆菌落接种分别接种于含有50ug/ml卡那霉素，7ug/ml庆大霉素，10ug/ml四环素的LB液体培养基中，摇菌4ml；

2)菌液PCR筛选片段大小为4055bp的阳性克隆菌，小量抽取质粒；

3)培养了16h的1.8ml菌液，12000rpm，4℃离心2min，倒弃上清；

4)吸取300μL溶液S1加入上述菌体中，用枪头将菌体吹散，混合均匀，室温放置5min；

5)吸取300μL溶液S2慢慢加入上述溶液中，小心颠倒5次混匀，室温下放置5min；

6)吸取300μL溶液S3，慢慢滴加至上述溶液中，颠倒混匀然后在冰上放置15min；

7)12000rpm 4℃离心15min；

8)取干净的灭菌2.0ml EP管，加入800μL异丙醇，将离心后吸出800μL上清加入到上述异丙醇中，颠倒混匀，置于－20℃冰箱30min；

9)将EP管从－20℃冰箱取出，12000rpm，4℃离心10min；

10)弃上清，加入900μL存放于-20℃冰箱的75％乙醇，洗涤沉淀；

11)12000rpm，4℃离心10min，在无菌操作台内小心的将EP管中的上清倾倒出，并用枪头将上清吸取干净；

12)加入50μL的无菌ddH₂O于EP管底部，用手轻弹管底，让DNA充分溶解，取小样用于PCR扩增跑胶和浓度检测，剩余质粒放置-20℃保存。

采用BamHI以及HindIII内切酶进行酶切鉴定。

(4)转染及收获病毒：

a.重组杆状病毒转染SF21细胞

1)在六孔板中接种9×10⁵个SF21细胞/2ml/孔，27℃培养1h，使细胞贴壁；

2)在这期间制备重组杆状病毒与Cellfectin Reagent复合物：

A.用100μL不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释1ug步骤3)获得的重组杆状病毒(约5μL)；

B.在使用前将Cellfectin Reagent倒置5～10次，使其充分混匀，取6μLCellfectin Reagent用100μL不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释；

C.将上述两种稀释液合并(总体积约210μL)，轻轻混匀，室温孵育15～45min；

3)在含有210μL的复合物的管内加入800μL的不完全Graces medium(不含双抗、FBS)，轻轻混匀，加到每个孔中；

4)将六孔板内的细胞孵育5h，27℃；

5)去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基；

6)在27℃湿度培养箱中孵育72h或者直到细胞出现病毒感染迹象；

7)沉淀需要制备样品，待后期Western Blot表达鉴定使用。

b.P1病毒液的收集：

当细胞出现感染迹象时，将细胞上清转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min以去除细胞及大的碎片，可用蛋白结合率低的0.2um的滤膜过滤，滴度损失小于10％；将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中(P1的滴度在10⁶pfu/ml左右)，将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱，可短期保存。若长期保存，进行1ml分装，避光储存于-80℃。

c.P2病毒扩增及收获：

原代病毒滴度(P1)较低，介于1×10⁶～1×10⁷，扩增后滴度为1×107～1×108。50ml摇瓶中加入适量的P1病毒。扩增病毒时可用下列公式进行计算：MOI(MμLtiplicity ofinfection)在0.01～0.1之间，接种量(mL)＝desired MOI(phf/ml)×(total number ofcells)tlter of viral inocμLum(puf/mL)，感染72h收获病毒，将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱，可短期保存。若长期保存，进行5ml分装，避光储存于-80℃。

d.细胞破碎：

(1)收集的细胞添加适量体积的裂解缓冲液将细胞完全重悬，并且添加蛋白酶抑制剂；

(2)细胞超声参数：

功率：250W；时间：超6s停3s，超声时间共计3min；

(3)12000rpm离心15min，收集上清；

(4)将Tris平衡过的GST柱加入到收集的上清中；

(5)在旋转孵育器上4℃孵育3-4h。

c.蛋白纯化：

(1)利用低压层析系统，样品与Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱孵育后的混合体缓慢加入纯化空柱中；

(2)用balane buffer(50mM Tris，300mM NaCl，PH8.0)缓冲液以0.5ml/min流速平衡Ni柱，至流出液OD₂₈₀值到达基线；

(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(30mM咪唑，50mM Tris，300mM NaCl PH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(300mM咪唑，50mM Tris，300mM NaCl PH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用50mM Tris，300mM NaCl PH8.0进行透析过夜；

(6)SDS-PAGE分析显示71kD处有明显条带，表明目的蛋白获得成功表达。

结果：

d.Western Blot检测：

(1)样品上样10μL(定体积不定量)。

(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先100V跑完积层胶，再将电压升至120V直到电泳结束。

(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h。

(4)电转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。

(5)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1h。

(6)洗膜4次，每次5分钟；用含5％(质量分数)牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。

(7)洗膜ECL显影结果显示71KD处有明显条带，表明目的蛋白有良好的反应原性。

实施例2.貉细小病毒病毒样颗粒在制备貉细小病毒性肠炎疫苗中的应用：

1.貉细小病毒病毒样颗粒的鉴定：

a.血凝试验

将实施例1中收获的重组病毒液，用猪红细胞，微量血凝检测方法检测血凝效价，结果表明，重组杆状病毒感染SF21细胞后包装形成的貉细小病毒病毒样颗粒可以成功凝集猪红细胞，其血凝价为2¹¹。

b.间接免疫荧光试验

将重组的杆状病毒P3代接种已长成的SF21细胞的96孔板内，培养48h后，采用间接荧光法检测RDPV-VP2蛋白的表达情况，可见大量绿色荧光，表明RDPV-VP2蛋白成功进行大量表达。

2.貉细小病毒性肠炎疫苗的制备：

将表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒接种SF21细胞，连续培养4-5天，观察出现病变后，收获细胞悬液，反复冻融2次，离心收获上清，离心条件如实施例1步骤(4)b所述，将收获的上清检测血凝效价，将其稀释至血凝价为2⁸后，按终浓度(质量分数)为5％比例加入氢氧化铝胶佐剂，充分混匀后即成貉细小病毒性肠炎疫苗。

3.貉细小病毒性肠炎疫苗的应用：

试验对象：2-10月龄，貉细小病毒中和抗体为阴性的貉。

接种方式：将上述制备的疫苗肌肉注射貉细小病毒抗体为阴性的貉20只，每只貉免疫5头份，每天观察接种貉的精神、食欲、体温、粪便，全身和局部有无异常，观察10天，未发现貉出现异常反应。结果表明，该疫苗对貉安全。

将制备的疫苗肌肉注射貉细小病毒抗体为阴性的貉5只，每只貉免疫1头份，于免疫后21天采血，分离血清进行血凝抑制抗体水平检测，结果为：2⁸～2¹¹。

将免疫21天的貉进行貉细小病毒强毒攻击，同时设对照组5只，攻毒后7-12天对照组相继出现典型的貉细小病毒性肠炎临床症状，主要表现为食欲减退，精神萎靡，腹泻，粪便中可检测出貉细小病毒。免疫组未出现临床症状，结果表明，该疫苗对貉细小病毒性肠炎具有良好的免疫效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> RDPV-VP2-OPTI

<400> 1

atgtccgacg gtgctgtgca gcctgacggc ggccagccag ctgtcaggaa cgaacgtgct 60

actggttccg gtaacggtac cggtggcggc ggtggtggcg gttcaggagg agtgggtatc 120

agcactggta ccttcaacaa ccagactgag ttcaagttcc tggaaaacgg ctgggtggag 180

atcaccgcta actccagccg cctggtccac ctgaacatgc ccgaatccga aaactaccgt 240

cgtgtcgtcg tgaacaacat ggacaagacc gctgtgaacg gcaacatggc cctggacgac 300

atccacgccc agatcgtgac tccctggtcc ctggtcgacg ctaacgcctg gggcgtctgg 360

ttcaaccccg gcgactggca gctgatcgtg aacaccatga gcgaactgca cctggtctcc 420

ttcgagcagg aaatcttcaa cgtggtcctg aagaccgtca gcgagagcgc tacccagccc 480

cccaccaagg tctacaacaa cgacctgact gctagcctga tggtggccct ggacagcaac 540

aacactatgc ctttcacccc cgctgccatg cgttccgaaa ccctgggctt ctacccctgg 600

aagcccacta tccctactcc ttggcgttac tacttccagt gggaccgcac cctgatcccc 660

agccacactg gcaccagcgg tacccctacc aacatctacc acggcactga ccccgacgac 720

gtgcagttct acactatcga gaactccgtc cccgtgcacc tgctgcgcac cggtgacgaa 780

ttcgctactg gtaccttttt cttcgactgc aagccctgcc gtctgaccca cacttggcag 840

actaaccgcg ctctgggcct gccccccttc ctgaacagcc tgcctcaggc tgagggtgcc 900

accaacttcg gcgacatcgg cgtccagcag gacaagcgtc gtggtgtcac ccagatgggc 960

aacaccaact acatcaccga agctactatc atgcgccctg ctgaagtggg ttactccgct 1020

ccctactact ccttcgaagc tagcactcag ggccctttca agactcccat cgccgccggc 1080

cgcggtggag ctcagactga tgagaaccag gctgccgacg gtgaccctcg ctacgccttc 1140

ggtcgtcagc acggtcagaa gactactact actggtgaga ctcctgagcg tttcacctac 1200

atcgctcacc aggacactgg ccgttaccct gaaggcgact ggattcaaaa catcaacttc 1260

aacctgcccg tcaccaacga caacgtcctg ctgcctactg accctatcgg tggtaaaacc 1320

ggtatcaact acactaacat cttcaacact tacggtcccc tgaccgccct gaacaacgtc 1380

cctcctgtct accctaacgg tcagatctgg gacaaggaat tcgacaccga cctgaagccc 1440

cgtctgcacg tcaacgctcc tttcgtgtgc cagaacaact gccctggtca gctgttcgtc 1500

aaggtggccc ccaacctgac caacgaatac gaccccgacg cttccgctaa catgtcccgc 1560

atcgtgactt actccgactt ctggtggaag ggtaaactgg tcttcaaggc caagctgcgt 1620

gcctcccaca cttggaaccc tatccagcag atgagcatca acgtcgacaa ccagttcaac 1680

tacctgcctt ccaacatcgg tggcatgaag atcgtgtacg aaaagtccca gctggctcct 1740

cgtaagctgt actaa 1755

<210> 2

<211> 1755

<212> DNA

<213> RDPV-VP2

<400> 2

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acaggatctg ggaacgggac tggaggcggg ggtggtggtg gttctggtgg tgtggggatt 120

tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180

atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240

agagtggttg taaataatat ggataaaact gcagttaatg gaaacatggc tttagatgat 300

attcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360

tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgaattgca tttagttagt 420

tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480

ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540

aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600

aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660

tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720

gttcaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780

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aaccttcctg taacaaatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320

ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380

ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440

agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500

aaagttgcgc ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560

attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620

gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatta atgtagataa ccaatttaac 1680

tatctaccaa gtaatattgg aggtatgaaa attgtatatg aaaaatctca actagcacct 1740

agaaaattat attaa 1755

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> RDPV-VP2-F2

<400> 3

gccggtgcag gacaagta 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> RDPV-VP2-R2

<400> 4

ccacccacac cataacaaca 20

<210> 5

<211> 76

<212> DNA

<213> RDPV-VP2-OPTI-F

<400> 5

ataccgtccc accatcgggc gcggatccgc caccatgctg ctggtgaacc agtcccacca 60

gggcttcaac aaggag 76

<210> 6

<211> 89

<212> DNA

<213> RDPV-VP2-OPTI-R

<400> 6

tatgatcctc tagtacttct cgacaagctt ttagtggtgg tggtggtggt ggtacagctt 60

acgaggagcc agctgggact tttcgtaca 89

Claims (9)

1.一种貉细小病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后获得；

所述表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒是将经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI与昆虫表达载体连接得到供体质粒，然后将该供体质粒转化到杆状病毒中经培养获得的，所述经过密码子优化的貉细小病毒基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQID NO:1所示。

2.根据权利要求1 所述的貉细小病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述昆虫表达载体为pFastBac1，所述杆状病毒为DH10 Bac E.coli。

3.一种貉细小病毒性肠炎疫苗，其特征在于，含有权利要求1或2所述的貉细小病毒病毒样颗粒。

4.权利要求1或2所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）病毒基因组的提取：将分离的貉细小病毒RDPV-HeB17株接种于F81细胞中，培养至75%以上病变后，收集病毒液提取病毒基因组DNA，所述貉细小病毒株RDPV-HeB17保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 15483；

（2）貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI供体质粒构建：以步骤（1）提取的貉细小病毒DNA为模板，PCR扩增获得RDPV-VP2基因序列，其序列如SEQ ID NO:2所示，根据昆虫细胞偏爱密码子，对RDPV-VP2基因序列进行密码子优化，所述优化后的基因RDPV-VP2-OPTI，序列如SEQID NO:1所示，以RDPV-VP2-OPTI模板， PCR扩增获得 SF-RDPV-VP2-OPT1，经酶切后连入经同样酶切的昆虫表达载体pFastBac1中，得到供体质粒pFastBacI-RDPV-VP2-OPT1；

（3）貉细小病毒RDPV-VP2-OPTI重组杆状病毒的构建：将供体质粒转化杆状病毒DH10Bac E.coli感受态细胞，获得表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒；

（4）转染及收获病毒：将步骤（3）获得的重组杆状病毒转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后收集细胞病毒液，获得貉细小病毒病毒样颗粒。

5.根据权利要求4所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中用于扩增RDPV-VP2基因的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；用于扩增RDPV-VP2-OPTI基因的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求4所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述SF-RDPV-VP2-OPT1及昆虫表达载体pFastBac1双酶切所用的内切酶为NotⅠ和HindⅢ。

7.根据权利要求4所述的貉细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（4）所述细胞出现病变或感染后，细胞病毒液收集的方法为：将病变或感染细胞反复冻融2次，将细胞上清液于1000 rpm离心5 min，然后用0.2 um的滤膜过滤，获得细胞病毒液。

8.权利要求1或2所述的貉细小病毒病毒样颗粒在制备貉细小病毒性肠炎疫苗中的应用，其特征在于，将貉细小病毒病毒样颗粒与氢氧化铝胶佐剂混合后制备获得貉细小病毒性肠炎疫苗，所述氢氧化铝在该疫苗中的终浓度为5%。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述用于制备貉细小病毒性肠炎疫苗的貉细小病毒病毒样颗粒对猪红细胞的血凝效价为2⁸~2¹²。

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