CN106350491A - 番鸭细小病毒病毒样颗粒的制备方法 - Google Patents

番鸭细小病毒病毒样颗粒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种番鸭细小病毒病毒样颗粒的制备方法。该方法将番鸭细小病毒VP3基因克隆入杆状病毒转移载体获得重组转移载体pFastBac1‑VP3；将pFastBac1‑VP3重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，涂板培养，直至蓝白斑出现；挑取白色单菌落，以碱裂法提取重组Bacmid DNA，将重组Bacmid DNA转染生长昆虫细胞Sf9制得重组杆状病毒；SDS‑PAGE、Western blot、IFA结果均显示重组蛋白VP3在昆虫细胞中成功表达；以P3代病毒感染昆虫细胞，收集细胞裂解液上清，经蔗糖密度梯度离心纯化后，可见直径约20～25nm的球形病毒样颗粒，与DPV天然病毒高度相似。

Description

番鸭细小病毒病毒样颗粒的制备方法
技术领域
本发明涉及番鸭细小病毒病毒样颗粒的制备。
背景技术
番鸭细小病毒病是严重危害鸭品种保存的疫病之一。该病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，DPV)引起的一种急性、败血性传染病，其特点是高度传染性和死亡率。该病主要发生于3周龄以内的雏番鸭(俗称雏番鸭三周病)，发病率和死亡率可达40％～50％以上，该病在我国大部分地区均有流行，严重影响我国养鸭业的发展。
番鸭细小病毒粒子呈球形或六角形，无囊膜，正二十面体对称，直径为20～40nm，核酸为单链DNA，有空心和实心两种病毒粒子形态。番鸭细小病毒的基因组为单链线性DNA，基因组全长5136nt。MDPV含有两个主要的开放阅读框架(ORF)，且两个ORF位于同一读码框内，两个ORF间隔仅18nt。左侧ORF编码非结构蛋白NS1和NS2，右侧ORF编码病毒的三种结构蛋白VP1、VP2和VP3，它们的起始位置也不同，但是终止密码子仍然相同，VP1含有组成VP2、VP3的全部氨基酸序列。VP3是病毒的主要衣壳蛋白，约占总蛋白含量的80％，是MDPV的免疫保护性抗原。
目前我国DPV的预防主要靠鸡胚弱毒疫苗，弱毒疫苗的免疫多在雏番鸭1日龄时进行，受母源抗体水平的影响和干扰，致使弱毒苗不能给雏番鸭提供完全保护，加之弱毒疫苗普遍存在的安全性问题，以致近年来国内外常有番鸭细小病毒病发生的报道，给生产造成严重经济损失。
病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，相比单独的多肽或蛋白，VLPs具有与天然病毒更为相近的构象表位，能更有效地刺激机体的细胞免疫和体液免疫，且VLPs无复制和感染能力，是很有发展前景的新型疫苗。
迄今为止，国内外学者针对30多种感染人和动物的病毒已经研制出相应的VLPs，大多数基于VLPs平台的疫苗正在进行临床前试验研究，少数已经进入临床试验阶段，许多VLPs疫苗经临床试验表现出很好的效果，如人乙肝病毒VLPs-、人乳头瘤病毒VLPs-、肠道病毒71型VLPs-和流感VLPs疫苗。目前关于细小病毒样颗粒疫苗的报道也有，Feng等利用杆状病毒表达系统表达犬细小病毒VP2蛋白，并检测到VLPs的生产，结果显示犬细小病毒单一的结构蛋白VP2可形成病毒样颗粒。Ju等研究发现鹅细小病毒VP2蛋白形成的VLPs能够诱导产生较高水平的抗体，并且能在体外中和不同株鹅细小病毒。在我国，还没有关于番鸭细小病毒病毒样颗粒的研制的相关报道。番鸭细小病毒衣壳由三种结构蛋白VP1、VP2和VP3构成，但VP3是其主要免疫保护性抗原，所以本发明利用杆状病毒系统表达番鸭细小病毒的主要保护性结构蛋白VP3，并在昆虫细胞中包装成病毒样颗粒。
发明内容
本发明将番鸭细小病毒VP3基因在杆状病毒表达系统，制备并鉴定了番鸭细小病毒病毒样颗粒，为番鸭细小病毒新型疫苗的研制奠定了基础。
番鸭细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1.转移载体pFastBac1-VP3的构建与鉴定
2.pFastBac1-VP3重组质粒的转座
3.重组Bacmid DNA的获得与鉴定
4.重组杆状病毒的制备
5.病毒样颗粒的制备。
其中，(1)所述中重组质粒载体的构建用到的载体为Invitrogen公司Bac-to-Bac系统中的杆状病毒转移载体pFastBac1。(2)(3)(4)所述中质粒的重组、重组Bacmid DNA的获得与鉴定、重组杆状病毒的制备及扩增均参照Invitrogen公司Bac-to-Bac说明书进行。(4)所述中重组杆状病毒制备用昆虫细胞Sf9为Invitrogen公司产品。
本发明中步骤(2)是：将pFastBac1-VP3重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，涂板培养，直至蓝白斑出现。
步骤(3)：挑取白色单菌落，以碱裂法提取重组Bacmid DNA，并进行PCR鉴定。
步骤(4)：将重组Bacmid DNA转染生长良好的昆虫细胞Sf9，待细胞出现明显病变时收集上清，即为P1代重组杆状病毒。以P1代病毒进行扩增得到P2代，P2代扩增得到P3代病毒。
步骤(5)：将P3代重组杆状病毒以MOI为5感染生长密度为2×106cells/ml的悬浮培养的昆虫细胞Sf9，72h后收集细胞沉淀，反复冻融3-5次，离心收集上清，以蔗糖密度梯度(20％-60％)100000g离心2h，收集乳白色条带，即为纯化的病毒样颗粒。
经过步骤(5)中所得到的病毒样颗粒可采用蔗糖密度梯度离心法纯化。
本发明首先扩增出番鸭细小病毒VP3基因，克隆入杆状病毒转移载体获得重组转移载体pFastBac1-VP3；将pFastBac1-VP3重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，涂板培养，直至蓝白斑出现；挑取蓝白斑中的白色单菌落，以改进后的碱裂法提取重组Bacmid DNA，并以M13引物对其进行PCR鉴定；将重组Bacmid DNA转染生长昆虫细胞Sf9，待细胞出现明显病变时收集上清，即为重组杆状病毒；SDS-PAGE、Western blot、IFA结果均显示重组蛋白VP3在昆虫细胞中成功表达；以P3代病毒(MOI＝5)感染昆虫细胞，收集细胞裂解液上清，经蔗糖密度梯度离心纯化后，磷钨酸负染电镜观察，可见直径约20～25nm的球形病毒样颗粒，与DPV天然病毒高度相似。本发明方法操作简便，易于扩大生产，为今后番鸭细小病毒新型疫苗的研制奠定基础。
附图说明
图1实施例3中重组Bacmid PCR鉴定，M：DL5000DNA Marker；1：重组Bacmid DNA以VP3为引物的PCR产物；2：重组Bacmid DNA以M13为引物的PCR产物；3：Bacmid以M13为引物的PCR产物。
图2实施例5中重组蛋白的SDS-PAGE分析。其中，M：蛋白Marker；
1：被野生型杆状病毒感染的Sf9细胞；2：被rBac-VP3感染的Sf9细胞。
图3实施例5中重组蛋白的Western blot检测。M：蛋白Marker；1：被rBacmid-VP3感染的Sf9细胞；2：被rBacmid感染的Sf9细胞。
图4实施例5中重组蛋白的IFA检测。A：被rBac-VP3感染的Sf9细胞；B：正常的Sf9细胞。
图5实施例6中DPV VLPs透射电镜图(195000×)。
具体实施方式
实施例1转移载体pFastBac1-VP3的构建与鉴定
根据已发表的番鸭细小病毒VP3基因的序列(GeneBank登录号：FJ480824)，设计一对引物，VP3-F/R，
VP3-F:5′-TAAGCGGCCGCCATGGCAGAGGGAGGAAGC-′3(SEQ ID No.1)
VP3-R:5′-GGACTCGAGTTACAGATTCTGAGTCAAAT-′3(SEQ ID No.2)
以提取的番鸭细小病毒-FJ株DNA为模板，用PCR方法进行目的片段VP3基因的扩增。目的片段回收后酶切，与经同样酶切的载体pFastBac1连接，并通过酶切和测序进行鉴定，获得转移载体pFastBac1-VP3。
实施例2pFastBac1-VP3重组质粒的转座
将pFastBac1-VP3重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，涂板培养，直至蓝白斑出现。
实施例3重组Bacmid DNA的获得与鉴定
挑取蓝白斑中的白色单菌落，以碱裂法提取重组Bacmid DNA，并分别以VP3和M13(M13引物是公知序列，见Invitrogen公司Bac-to-Bac说明书)引物对其进行PCR鉴定，结果如图1所示，可见特异性的扩增条带，大小与预期相符，说明目的基因同源重组成功，获得的重组杆粒正确。
实施例4重组杆状病毒的制备
将重组Bacmid DNA转染生长良好的昆虫细胞Sf9，待细胞出现明显病变时收集上清，即为P1代重组杆状病毒。以P1代病毒进行扩增得到P2代，P2代扩增得到P3代病毒。空斑实验测得P3代重组杆状病毒的滴度为2.0×108pfu/ml。
实施例5重组蛋白在昆虫细胞Sf9中的表达及鉴定
以P3代病毒感染细胞，待细胞出现明显病变时收集细胞，PBS溶解后与5×SDSLoading buffer混匀，煮沸10min，12000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE，结果如图2所示，在大约58kDa处有目的条带，大小正确。以制备的番鸭细小病毒VP3多抗为一抗对重组蛋白进行Western blot和间接免疫荧光鉴定，Western blot结果显示，被P3代病毒感染的Sf9在58kDa处出现特异性条带(图3)；IFA结果显示，被P3代病毒感染的Sf9中出现较强的荧光(图4)。以上结果表明VP3基因在昆虫细胞中得到正确表达。
实施例6病毒样颗粒的分离、纯化与鉴定
将Sf9细胞在摇瓶中大量培养，以P3代病毒(MOI＝5)感染昆虫细胞，待细胞出现明显病变时收集细胞沉淀，PBS溶解。超声波裂解后，收集裂解液上清。以蔗糖密度梯度(20％-60％)100000g离心2h，收集乳白色条带，磷钨酸负染后，电镜观察，结果如图5所示，电镜视野下可看到直径约20～25nm的空心病毒样颗粒，与DPV天然病毒的大小和形态高度相似，说明成功构建了制备番鸭细小病毒样颗粒的杆状病毒/昆虫细胞系统，可以用于番鸭细小病毒病新型疫苗的进一步开发应用。

Claims (6)

1.一种番鸭细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将番鸭细小病毒VP3基因克隆到载体pFastBac1中，构建转移载体pFastBac1-VP3；
(2)pFastBac1-VP3重组质粒的转座
(3)重组Bacmid DNA的获得
(4)重组杆状病毒的制备
(5)病毒样颗粒的制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中番鸭细小病毒结构蛋白基因VP3的扩增引物为：
VP3-F/R:′-TAAGCGGCCGCCATGGCAGAGGGAGGAAGC-′3/5′-GGACTCGAGTTACAGATTCTGAGTCAAAT-′3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)是：将pFastBac1-VP3重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，涂板培养，直至蓝白斑出现。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)是：挑取白色单菌落，以碱裂法提取重组Bacmid DNA，并进行PCR鉴定。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)是：将重组Bacmid DNA转染生长良好的昆虫细胞Sf9，待细胞出现明显病变时收集上清，即为P1代重组杆状病毒。以P1代病毒进行扩增得到P2代，P2代扩增得到P3代病毒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)是：将P3代重组杆状病毒以MOI为5感染生长密度为2×106cells/ml的悬浮培养的昆虫细胞Sf9，72h后收集细胞沉淀，反复冻融3-5次，离心收集上清，以蔗糖密度梯度(20％-60％)100000g离心2h，收集乳白色条带，即为纯化的病毒样颗粒。
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