CN104403006A - 水貂细小病毒病毒样颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的水貂细小病毒病毒样颗粒，其是根据昆虫细胞偏爱密码子，对水貂细小病毒VP2基因进行优化，将优化后VP2基因的5′端直接与编码部分多角体蛋白的核苷酸序列相连，然后克隆至转移载体中，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产水貂细小病毒病毒样颗粒。利用该表达系统可安全、高效、大规模的生产水貂细小病毒病毒样颗粒，且所得病毒样颗粒滴度高、免疫原性好，肌肉免疫和口服免疫均可诱导水貂机体产生高水平的特异性抗体，并可抵抗强毒的攻击，对水貂提供很好的保护作用，为制备水貂病毒性肠炎疫苗奠定基础。

Description

水貂细小病毒病毒样颗粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及水貂细小病毒病毒样颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis viurs,MEV)引起的一种烈性传染病，又称传染性肠炎或称为泛白细胞减少症，猫科、鼬科、貂科和犬科动物均易感，是对水貂饲养业危害较大的三大病毒性传染病之一。该病最早由Schofield于1949年发现于加拿大威廉堡某水貂养殖场，1952年，Will提取了病原，命名为MEV。随后，此病迅速蔓延至美国、丹麦、挪威、瑞典、苏联、日本等许多国家。我国于1974年首次发现该病，此后蔓延至全国，给水貂养殖业带来巨大经济损失。

MEV属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parovirus)，是目前发现的动物病毒中形态最小、结构最简单的一类单链线状病毒之一。病毒粒子有呈二十面体对称结构的核衣壳，无囊膜，直径大小为20-25nm。基因结构为单链DNA，含有两个主要的开放阅读框(OpenReading Frames,ORFs)，5′端ORFs编码非结构蛋白NS1和NS2，3′端ORFs编码结构蛋白VP1和VP2，VP2是构成病毒衣壳的主要蛋白。

水貂病毒性肠炎传染性强，病情恶化迅速，主要表现为呕吐、腹泻下痢、精神沉郁、胃肠粘膜出血等病症。断奶仔貂、3-6月龄幼貂最易感染，死亡率高达60％-90％。不论品种和年龄的水貂，均对MEV易感，只是发病率不同。成年貂对此病的抵抗能力较强，不表现出特别强烈的临床症状，一般为隐形感染或是慢性经过，发病率较低，一旦确诊，致死率也会达到80％。发病的水貂作为主要的病毒传染源向外辐射，进而感染缺乏抵抗力的其他水貂。

对于此类疾病来说，防大于治。预防MEV最有效的手段是定时接种疫苗。目前国内外使用较多的是灭活苗和弱毒苗，预防效果较好，如MEV组织培养福尔马林灭活疫苗，MEV同源组织灭活苗，MEV同源组织灭活苗与肉毒梭菌类毒素二联苗，犬瘟热、病毒性肠炎、肉毒梭菌类毒素、假单胞菌四联苗等。缺点是灭活疫苗的免疫效力相对较低，弱毒疫苗存在毒力返祖的潜在危险性，还有不稳定、不易于保存和运输等缺点。随着分子生物学技术的不断进步，多种基因工程疫苗已被研发，如亚单位疫苗、表位疫苗及合成肽疫苗等，相对于传统疫苗具有安全、稳定的特点。Langeveld J D等研制的合成肽疫苗和表位疫苗具有很好的保护水貂抵抗MEV感染的效果。Dalsgaard K等应用豇豆花叶病毒-植物细胞表达系统成功表达了MEV VP2蛋白。

多角体蛋白(Polyhedrin，polh)基因由245个氨基酸组成，是多角体的主要结构成分。多角体保护包埋其中的病毒粒子，使其免受物理和生化降解，保持病毒粒子在自然环境中的感染能力。多角体蛋白在病毒感染细胞后极晚期才高效表达，当其它病毒基因和宿主基因关闭后，在病毒感染的极晚期，此基因能持续高水平表达，多角体蛋白在细胞内的产量可达细胞蛋白质总量的25％-50％。丁鑫鑫将家蚕杆状病毒的polh融合于破骨细胞形成抑制因子(Osteoprotegerin，OPG)中，分别在大肠杆菌和家蚕细胞BmN内表达。结果表明，融合蛋白Polh-OPG在大肠杆菌中表达量明显提高，但融合蛋白在家蚕细胞中的表达差异不明显。郭爱芹构建了一系列带有多角体启动子和不同长度polh基因片段的新型供体质粒，并以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，发现在BmN细胞中，多角体蛋白融合表达策略可显著提高外源蛋白的表达水平。而将多角体蛋白的4个氨基酸序列融合表达于水貂细小病毒VP2中，在草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf9细胞)中能否高水平表达外源蛋白，外源蛋白可否正确包装成病毒样颗粒，且其免疫原性和反应原性的高低等，目前尚无文献支持。

发明内容

本发明的目的是提供水貂细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合蛋白，由部分多角体蛋白序列融合表达于水貂细小病毒VP2蛋白N端组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供编码上述融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID No.2所示，该基因中编码水貂细小病毒VP2蛋白的基因序列按照昆虫细胞偏爱密码子优化。

本发明还提供含有上述基因的载体、宿主细胞和工程菌。

本发明还提供水貂细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将如SEQ ID No.2所示的基因克隆入转移载体pFastBac Dual中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态进行重组，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid；(2)水貂细小病毒病毒样颗粒的制备：用重组杆状病毒Bacmid转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒，将重组杆状病毒接种昆虫细胞后即可获得水貂细小病毒病毒样颗粒。

本发明中使用的昆虫细胞为草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf9细胞)等。

本发明还提供由上述方法制备的水貂细小病毒病毒样颗粒。

本发明还提供所述水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎抗体中的应用。

本发明还提供了所述水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎诊断用抗原试剂中的应用。

本发明还提供所述水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎疫苗中的应用。

本发明还提供一种水貂病毒性肠炎疫苗，其是将所述的水貂细小病毒病毒样颗粒不辅以佐剂或任选辅以佐剂制备而成。

本发明中使用的佐剂为氢氧化铝，终浓度为5％。

本发明提供的水貂病毒性肠炎疫苗为口服疫苗或肌肉注射疫苗。

本发明提供的水貂细小病毒病毒样颗粒，其是根据昆虫细胞偏爱密码子，对水貂细小病毒VP2基因进行优化，将优化后VP2基因的5′端直接与编码部分多角体蛋白的核苷酸序列相连，然后克隆至转移载体中，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产水貂细小病毒病毒样颗粒。利用该表达系统可安全、高效、大规模的生产水貂细小病毒病毒样颗粒，且所得病毒样颗粒滴度高、免疫原性好，肌肉免疫和口服免疫均可诱导水貂机体产生高水平的特异性抗体，并可抵抗强毒的攻击，对水貂提供很好的保护作用，为制备水貂病毒性肠炎疫苗奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中P1代重组杆状病毒接种Sf9细胞图片；其中，A为正常Sf9贴壁细胞对照，B为P1代重组杆状病毒接种Sf9细胞后细胞病变情况。

图2为本发明实施例2中血凝检测结果。

图3为本发明实施例2中间接免疫荧光检测结果；其中，A为重组杆状病毒感染的阳性孔，B为阴性细胞对照孔。

图4为本发明实施例2中Western blot结果；其中，泳道1为P3代样品，泳道2为Marker。

图5为本发明实施例2中电镜负染结果。

图6为本发明实施例2中水貂肌肉免疫结果；其中，A为血凝抑制抗体滴度，B为强毒攻击后水貂存活率。

图7为本发明实施例2中水貂口服免疫结果；其中，A为血凝抑制抗体滴度，B为强毒攻击后水貂存活率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 水貂细小病毒病毒样颗粒及其制备方法

1材料

水貂细小病毒、菌种E.coli DH10Bac、Sf9细胞、胎牛血清由长春西诺生物科技有限公司提供，pEASY-Blunt Simple载体购自北京全式金生物技术有限公司，pFastBac Dual载体、脂质体2000购自Invitrogen公司，Phusion DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，IPTG、X-gal购自大连宝生物公司，抗生素购自Sigma公司，Grace昆虫细胞培养基、Sf-900II SFM无血清细胞培养基购自Gibco公司，细胞培养皿、细胞摇瓶购自Corning公司，DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司。

2方法

2.1病毒基因组的提取

将水貂细小病毒同步接种至F81细胞中，37℃CO₂培养箱中培养3-5天，细胞培养物出现明显的细胞病变后，反复冻融3次收毒。对收获的病毒液进行DNA的提取，步骤见DNA提取试剂盒说明书。

2.2水貂细小病毒VP2序列的测定

参考GenBank中公布的MEV的VP2序列(GenBank No.D00765.1)，根据序列两端保守区设计扩增引物：VP2-F：5'-ATGAGTGATGGAGCAGT-3'；VP2-R：5'-TTAATATAATTTTCTAG-3'。以提取的貂细小病毒DNA为模板，利用扩增引物获得PCR产物MEV-VP2。将MEV-VP2连入pEASY-BluntSimple载体中，得到质粒MEV-VP2-pEASY。选取电泳条带大小正确的质粒送公司测序，以得到精确的MEV VP2序列。

2.3 VP2序列优化、分析及引物设计

将MEV VP2序列进行优化，优化标准如下：保证编码氨基酸不变前提下，根据昆虫细胞密码子偏爱性、GC含量、CpG二核苷酸含量、mRNA二级结构优化，去除隐蔽剪切部位、不成熟的PolyA位点、内部核糖体结合位点、RNA不稳定基序、重复序列(同向重复、反向重复、二连体重复)、干扰克隆的限制性酶切位点。

根据优化的序列MEV-VP2-opti，利用Primer Premier 5软件设计2对引物，分别可扩增出的VP2ORF区域1755bp长度的产物，并在引物的5'端引入酶切位点，上游引物5'端引入多角体蛋白的12个碱基序列(表1)。

表1 引物设计信息

注：下划线为酶切位点，粗体为多角体蛋白序列。

2.4供体质粒的构建

以MEV-VP2-opti为模板，以相应引物进行PCR扩增，得到PCR产物MEV-VP2-P10、MEV-VP2-PH。通过NotI+HindIII双酶切将MEV-VP2-PH连入pFastBac Dual中，得到pFD-MEV-PH-VP2。通过XhoI+NheI双酶切将MEV-VP2-P10连入pFD-MEV-PH-VP2中，得到供体质粒pFD-MEV-VP2，其含有的插入核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.5重组杆状病毒Bacmid质粒的构建

将供体质粒pFD-MEV-VP2转化DH10Bac感受态，步骤如下：取0.2μL供体质粒加入到E.coli感受态DH10Bac中，冰浴30min，42℃热激45s，再冰浴2min，加入1mL无抗性LB培养基，37℃200rpm/min复苏4h，将复苏后的菌液取10μL、20μL、30μL分别至50μL LB中，混匀后，依次涂板(含卡那霉素、庆大霉素、四环素三种抗性和IPTG、X-Gal的LB平板)，37℃培养36-48h，待蓝白斑区分较为明显时，挑选大的白色单菌落，加入LB培养基(含有终浓度为50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环霉素)中37℃200rpm/min摇12h，菌液进行PCR鉴定。PCR鉴定正确的为转座成功的菌液，进行重组质粒Bacmid的提取。

对Bacmid进行提取，命名为MEV-Bacmid。步骤如下：(1)取4mL菌液进行12000rpm离心1min；(2)弃去上清，加250μL溶液I，悬浮菌体；(2)弃去上清，加250μL溶液II，上下颠倒摇匀，至菌液变的清亮；(3)弃去上清，加250μL溶液III，上下颠倒摇匀，此时出现白色絮状物质；(4)12000rpm离心10min；(5)在无菌操作台内，上清转至新1.5mL EP管内，加入等体积异丙醇，上下颠倒摇匀，12000rpm离心10min；(6)小心弃去上清，加1mL 70％乙醇，上下颠倒摇匀，12000rpm离心10min；(7)重复步骤(6)一次；(8)小心弃去上清，置于吸水纸上10-15min；(9)加入50μL无菌水，溶解后测浓度，备用。

2.6水貂细小病毒病毒样颗粒的制备

将MEV-Bacmid转染Sf9细胞，步骤如下：(1)取8μg Bacmid DNA加入250μL双无(无血清、无双抗)Grace培养液中；(2)将10μL脂质体加入到250μL双无(无血清、无双抗)Grace培养液中混匀，室温作用5min；(3)将Bacmid与脂质体混合，室温放置20min；(4)将已长成单层的六孔板Sf9细胞(覆盖80-90％面积)用双无培养液洗两次，最后加入双无培养液1.5mL；(5)Bacmid与脂质体混合物加入细胞中，27℃静置5h；(6)吸去六孔板内液体，加入2mL含有双抗和血清的Grace细胞培养液继续培养5-6天。

待细胞肿胀，变大，脱落后，收取上清，该病毒记为P1代重组杆状病毒，即水貂细小病毒病毒样颗粒MEV-VLP-P1。将P1代重组杆状病毒向下传代，至P3代。

实施例2 水貂细小病毒病毒样颗粒的鉴定及水貂免疫

1 材料

新鲜猪血、兔血清、细小病毒单克隆抗体为长春西诺生物科技有限公司提供，FITC标记的山羊抗鼠二抗、HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗购自Sigma公司。

2 方法

2.1 水貂细小病毒病毒样颗粒的鉴定

2.1.1 血凝试验

使用新鲜猪血，缓冲液为15mM pH 6.5的PBS中进行血凝效价的测定。步骤如下：将新鲜采取的用阿氏液保存的猪血5000rpm离心5min，用PBS洗3遍，待离心后上清澄清后，可用离心的红细胞配制1％红血球，并加入0.5％兔血清。96孔V型血凝板内加入25μL PBS，加入25μL待测样品，进行2倍倍比稀释至第23个孔，留1孔做阴性对照。补加25μL PBS，再加入50μL 1％猪红血球，轻摇匀后，至4℃静置1h后观察结果。

2.1.2 间接免疫荧光

将P3代重组杆状病毒接种至24孔板内已长单层的Sf9细胞中，培养48h后使用3％多聚甲醛室温固定30min，以细小病毒单克隆抗体为一抗，FITC标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行荧光染色，在荧光显微镜下观察病毒样颗粒表达情况。

2.1.3 Western Blot

将P3代样品进行SDS-PAGE电泳，并Western Blot鉴定。即以细小病毒单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，通过DAB方法显色，特异性检测病毒样颗粒表达情况。

2.1.4 电镜检测

将待检样品反复冻融3次后，10000rpm离心10min，取上清进行负染后电镜观察。

2.2 水貂免疫试验

2.2.1 水貂肌肉注射免疫试验

将已知血凝效价的病毒样颗粒使用15mM pH 6.5的PBS稀释至血凝效价为1：2⁸，按比例加入终浓度为5％的氢氧化铝胶佐剂，通过肌肉注射途径免疫50日龄水貂(1mL/只)，并设立免疫商品化疫苗的疫苗对照组和免疫PBS的阴性对照组，分别于免疫后0、7、14天采血测定机体血凝抑制抗体效价，并取部分免疫水貂在免疫后14天以水貂病毒性肠炎强毒进行攻击，连续观察14天记录水貂死亡情况。

2.2.2 水貂口服免疫试验

将已知血凝效价的病毒样颗粒使用15mM pH 6.5的PBS稀释至血凝效价为1：2¹⁰，通过口服途径免疫50日龄水貂(1mL/只)，7天后加强免疫1次，第二次免疫后14天以水貂病毒性肠炎强毒进行攻击，连续观察14天记录水貂死亡情况，设立免疫PBS的阴性对照组。

3 结果

3.1 接种Sf9细胞后细胞变化

收获的P1代重组杆状病毒接种至Sf9细胞后，细胞会出现体积增大膨胀、脱落等病变(图1B)，而正常对照组细胞生长状态良好，细胞紧密，无脱落等现象(图1A)。

3.2 血凝效价检测

采用新鲜的猪血，使用15mM PBS pH 6.5进行血凝试验检测，结果表明重组杆状病毒接种Sf9细胞后表达的VP2蛋白可成功组装成一定的空间结构，并具有血凝活性，血凝效价可达1:2¹⁸。(图2)。

3.3 间接免疫荧光

利用细小病毒特异性单克隆抗体，采用间接免疫荧光对重组病毒进行了鉴定，结果表明重组病毒感染细胞后，可成功表达貂细小病毒结构蛋白，显示为绿色荧光(图3A)，而阴性细胞对照孔无荧光(图3B)。

3.4 Western blot结果

将收获的P3代样品通过Western blot特异性检测病毒样颗粒表达情况。结果表明，成功表达了MEV的病毒样颗粒(图4)。

3.5 电镜结果

将样品进行电镜负染，观察病毒样颗粒包装情况。结果可观察到典型的细小病毒样颗粒(图5)，表明重组杆状病毒表达的VP2可组装成特定的空间结构，且结构、大小与天然水貂细小病毒相似。

3.6 水貂免疫结果

将制备的基因工程疫苗通过肌肉注射免疫水貂后，可刺激机体产生较高水平的特异性抗体，且抗体产生时间比商品化疫苗早(图6A)，免疫动物可抵抗水貂细小病毒强毒的攻击，存活率为100％(图6B)。

通过口服方式免疫水貂后，也可刺激机体产生特异性抗体并抵抗水貂细小病毒强毒的攻击(图7A，7B)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，由部分多角体蛋白序列融合表达于水貂细小病毒VP2蛋白N端组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.水貂细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)重组杆状病毒Bacmid的构建：将权利要求2所述的基因克隆入转移载体pFastBac Dual中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态进行重组，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid；

(2)水貂细小病毒病毒样颗粒的制备：用重组杆状病毒Bacmid转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒，将重组杆状病毒接种昆虫细胞后即可获得水貂细小病毒病毒样颗粒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用的昆虫细胞为Sf9细胞。

6.由权利要求4或5所述的方法制备的水貂细小病毒病毒样颗粒。

7.权利要求6所述的水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎疫苗中的应用。

8.权利要求6所述的水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎抗体中的应用。

9.水貂病毒性肠炎疫苗，其特征在于，将权利要求6所述的水貂细小病毒病毒样颗粒不辅以佐剂或任选辅以佐剂制备而成。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为口服疫苗或肌肉注射疫苗。