CN113337478A - 一株猫细小病毒毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猫细小病毒毒株及其应用，属于生物制品技术领域。所述毒株保藏编号为：CCTCC NO:V202127，保藏时间为：2021年4月27日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。该毒株属于中国武汉的分离株，具有较高的病毒滴度；该病毒的灭活制品可在动物中产生良好的免疫应答反应，具有良好的免疫原性，作为灭活疫苗可以很好的刺激机体产生针对FPV的高水平中和抗体，具备疫苗的基本潜质。将该病毒株制备成疫苗可用于猫泛白细胞减少症防治中，以为我国猫泛白细胞减少症的防控提供重要的疫苗病毒源，实现猫细小病毒的有效防控。

Description

一株猫细小病毒毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，涉及一株猫细小病毒毒株及其应用。

背景技术

猫泛白细胞减少症又称猫瘟、猫瘟热、猫传染性肠炎，是一种猫的高度接触性急性传染病。主要发于幼猫(2月龄—4月龄)，患病率及死亡率都比较高，死亡率高达50％-70％，被称为幼猫杀手。成年猫患病几率较低，多呈隐性感染或亚临床感染。除了感染家猫外，还可感染其他野生的猫科动物，比如老虎、熊、豹等。患病猫的典型临床症状表现为初期厌食、精神萎靡，中期呕吐、体温升高(40℃±)、腹泻，后期可能出现便血、脱水、白细胞降低到检测线以下、神经症状(共济失调、角弓反张、划水样动作)、严重者死亡。但大多数猫会突然发病并死亡，几乎观察不到上述症状。病猫的呕吐物、口鼻分泌物、粪便、尿液、接触的物品中含有大量病毒，这些都将成为猫瘟传播的传染源头，该病的传播途径主要经粪—口传播。

猫泛白细胞减少症的病原是猫细小病毒(Feline Parvovirus，FPV)，FPV是一种单股负链DNA病毒，呈二十面体对称，病毒颗粒大小在20nm±，病毒粒子由内部的核酸与外部的结构蛋白组成，对外界环境有很强的抵抗力，可在环境中存活数月到数年，易被灭活。FPV基因组5123bp，基因组从左到右包括3’端Y型发卡结构、ORF1、ORF2、5’端U型发卡结构，两端的发卡结构均参与FPV的复制。ORF1编码两个非结构蛋白NS1、NS2，发挥解旋酶、ATP水解酶、剪切酶、免疫抑制等功能。ORF2编码结构蛋白VP1、VP2、VP3，VP2是构成病毒粒子衣壳最主要的结构蛋白，占比90％，也是最主要的抗原结构蛋白，是刺激机体产生中和抗体的主要蛋白。

FPV致病过程：FPV经口鼻途径感染后，在口咽部的淋巴结、上皮细胞中复制增殖，随着病程推进，病毒进入胃肠道相关淋巴组织，引起腹泻。并且可以通过感染的白细胞转移到小肠隐窝的上皮细胞进行大量复制。白细胞主要是通过循环和组织相关的淋巴细胞诱发急性淋巴细胞减少，主要的损伤部位在小肠，表现为出血性肠炎，肠系膜淋巴结和淋巴集结肿大，最终导致发病猫的死亡。通过组织病理学检查，小肠发生肠隐窝多病灶坏死和核内包涵体的出现，其余组织主要表现为淋巴集结、淋巴结、脾脏和胸腺的淋巴细胞出现广泛性的坏死。

FPV的预防分为被动免疫与主动免疫，被动免疫包括幼猫出生后所携带的母源抗体(MDA)，母猫若具有较高水平的FPV特异性抗体，其后代在一定时间内也会具有一定水平的抗体，在短时间内可保护幼崽免受FPV的感染，但是MDA水平在幼崽出生后2-3个月开始下降，到4个月左右基本消失。被动免疫还包括接种已经免疫过FPV疫苗的猫或者曾经患FPV康复猫的血清。主动免疫是接种疫苗。经研究表明，灭活的FPV疫苗可以在猫体中有效的激活体液免疫，产生很高水平的抗体，对FPV的保护率可达95％以上。目前市场上的基本是采用进口的猫三联灭活苗(FPV、FCV、FHV)，但是进口疫苗具有价格贵、进货渠道有限、易出现假冒伪劣产品等缺点。

经过资料的查询及信息的核对，目前没有国产的FPV疫苗被批准使用。因此，亟需国内FPV疫苗株的出现，并将其应用到FPV的预防中，这对现有技术中存在的问题的解决具有重大的科学意义与应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株猫细小病毒毒株及其应用，以解决背景技术存在的技术问题，该毒株的灭活产物可诱导强有力的体液免疫进而阻止FPV的感染，实现对FPV的有效防控。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一株猫细小病毒毒株(Feline Parvovirus)，命名为：猫细小病毒FPV WH1，其保藏编号为：CCTCC NO:V202127，保藏时间为：2021年4月27日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

优选的是，所述毒株的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种所述的猫细小病毒毒株或所述的如SEQ ID NO：1所示的基因序列在制备疫苗中的应用。

优选的是，所述疫苗为防治猫泛白细胞减少症的疫苗。

优选的是，所述疫苗为灭活疫苗。

优选的是，所述疫苗还包括赛比克水佐剂。

本发明还提供一种疫苗，包括所述的猫细小病毒毒株或所述的如SEQ ID NO：1所示的基因序列。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从确诊猫细小病毒的病料中分离出一株新的FPV病毒株FPV WH1，通过安全性、免疫原性等方面的研究，确定了该灭活疫苗毒株具有良好的安全性，并可产生良好的体液应答，诱导高于商品化疫苗的中和抗体水平，提供更好的保护力。因此，FPV WH1可作为潜在的猫泛白细胞减少症灭活疫苗的候选疫苗株，以有效防控FPV病毒的流行。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为FPV WH1在CRFK细胞上的病变情况；

图2为PCR检测FPV WH1的特异性条带电泳图；其中，1：FPV WH1；2：阴性对照；3：阳性对照；M：2000bp DNA Marker；

图3为FPV WH1在CRFK上的间接免疫荧光检测结果；

图4为对FPV WH1的噬斑纯化结果；

图5为FPV WH1的生长曲线测定结果；

图6为FPV WH1毒株灭活苗免疫家猫后的体温变化分析图；

图7为FPV WH1毒株灭活苗免疫家猫后的体重变化分析图；

图8为FPV WH1毒株灭活苗免疫家猫后的中和抗体水平变化情况；

图9为FPV WH1毒株灭活苗免疫家猫产生的中和抗体具有广谱抗病毒作用的测定结果。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 FPV WH1的分离及鉴定

一、实验方法

1、病毒分离

(1)从中国武汉某宠物医院收集确诊猫细小病毒的病料，病料多为粪便。将粪便用10倍体积的无菌4.5g/L DMEM稀释，混匀(冰上操作)，4℃，9000rpm，20min。离心取上清，0.22μm滤器过滤，分装至无菌EP管中，作为待分离病毒，-80℃保存。

(2)在T25细胞培养瓶中将易感细胞CRFK培养到细胞密度50％-60％，将上步处理后的病料按照1：10的比例接种易感细胞CRFK中，放入37℃培养箱，吸附2h，之后换成2％DMEM维持液，放入37℃、5％CO₂培养箱培养3-5天，观察是否有病变出现。

(3)第一代若未出现病变，将第一代的培养物取出在-80℃与常温之间冻融3次，9000rpm，4℃，20min，取上清，按照1：10的比例接于50％-60％密度的CRFK上，吸附2h，换成维持液，培养3-5天，观察病变。如此盲传3-5代，直到出现病变。

(4)将出现病变的代次同样冻融3次，离心，取上清，分装至无菌离心管中，即为原始毒，记为P0代毒。

2、病毒鉴定

(1)PCR鉴定

取病变病毒液1μL，进行PCR鉴定，引物序列为：

上游引物：ATGGTTGGTGACTCTTTGTTT；

下游引物：TACATTTGATTGACACTTCCC。

鉴定体系为2×MIX 5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1μL，水3μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃变性3min后进入循环，循环参数：95℃30s，56℃15s，72℃30s，34个循环后72℃延伸10min，16℃5min。反应结束后，将PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)间接免疫荧光(IFA)鉴定

将CRFK细胞培养于6孔培养板，细胞长成50-60％左右即可，加入100μL病毒液，吸附2h，换成2％维持液，放入培养箱培养36h。出现50％病变，弃掉孔中培养基，用PBS清洗2遍后加入4％多聚甲醛室温作用30min；弃掉废液，用PBS洗2次后加入含1％BSA的PBST的封闭液，在37℃静置作用1h左右；PBS洗2次后，加入1：1000稀释的一抗(FPV鼠单克隆抗体)，37℃静置作用1h；PBST洗4次后加入1：1000加入羊抗鼠荧光二抗，37℃避光温育1h；弃掉二抗，PBS洗三次，加入1：1000稀释的DAPI染料，常温作用5min；弃掉DAPI，PBST洗一遍，每孔加入1mL PBST，在荧光显微镜下观察并采集图片。

二、实验结果

1、通过对疑似FPV病例的病料进行病毒的分离鉴定，成功分离到一株猫细小病毒(FPV)，命名FPV WH1，其在易感细胞CRFK上培养表现出FPV样的病变，如图1所示，细胞出现拉网、拉丝、变狭长、破碎、脱落等病变。

2、通过用FPV特异性引物进行PCR检测，结果如图2所示，在510bp处出现亮条带，与预期大小相同。

通过FPV单克隆抗体进行IFA检测，结果如图3所示，细胞中检测到了特异性的荧光，荧光在细胞核内的分布比较多，表明FPV在细胞核中复制，这也符合FPV的复制特征。

实施例2 FPV WH1的噬斑纯化

一、实验方法

(1)将CRFK消化均匀后调节细胞浓度，以适宜的浓度接种6孔板，当细胞密度为50％-60％，准备病毒液，进行十倍稀释，获得五个浓度的病毒液。分别向每个孔里滴加病毒液100μL，37℃吸附2h，每15min摇一下板子，使病毒液充分吸附，2h后吸弃病毒液，PBS洗两遍。

(2)制备2％的低熔点琼脂糖溶液，72℃融化，置于37℃水浴锅中保温待用，2×DMEM也置于37℃水浴锅中预热。

(3)将上述2％低琼脂糖溶液与2×DMEM维持液(2％血清，1％双抗)按照1：1的比例混匀后，加入各孔中，2mL/孔，将6孔板放于4℃冰箱10min，使其凝固。待琼脂糖凝固后，置于37℃，CO₂培养箱中培养，于24，36h观察病变。

(4)待噬斑形成后，对光观察，对噬斑做标记，选取合适大小的噬斑连同琼脂一起挑起使用黄色枪头，提前剪掉尖端部位，使枪头口径与噬斑大小相仿，然后用移液器直接吸取，覆盖物一起被吸入枪头，溶解在适量细胞培养液中，用作病毒的下一轮增殖与鉴定。如此重复3轮。

二、实验结果

如图4所示，通过对FPV WH1株进行多轮噬斑纯化，得到一株单一纯合的病毒株。

实施例3 FPV WH1生长动力学的测定

一、实验方法

(1)将细胞传代接种于24孔板中，待细胞密度达到约60％，以0.1MOI病毒感染细胞，同时换成2％DEME维持液(2％血清，1％双抗)，置于37℃培养箱中培养。

(2)接毒后分别在12、24、36、48、60、72、84h收取细胞上清样品，用CRFK细胞检测病毒TCID₅₀。

(3)将细胞传代接种于96孔板中，待细胞密度达到约50％，用细胞维持液将病毒按10倍倍比稀释后，每孔加入100μL病毒液，每个稀释度作8个重复，放入培养箱中培养。

(4)60h后取出，用间接免疫荧光的方法对毒价结果进行测定，并用Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀。

二、实验结果

如图5所示，以0.1MOI病毒量接种CRFK，其在同步接种后，72h毒价达到最高，为10^7.3TCID₅₀/mL。

实施例4 FPV WH1病毒株全基因测序分析

一、实验方法

(1)目的基因扩增

取FPV WH1病毒液200μL，利用

ViralDNA/RNA Kit核酸提取试剂盒提取DNA。实验步骤参照试剂盒说明书进行。

以提取的病毒DNA为模板，利用如下引物：

M1上游引物：TTGTGTGTTTAAACTTGGGC

M1下游引物：GTTGTCATAATTACTGGAGTTGG

M2上游引物：GGAAGTAAGCAAATTGAACC

M2下游引物：AAACCTAATGTCTCAGATCT

M3上游引物：CTGTTTCAGAATCTGCTACTC

M3下游引物：GGTTAGTTCACCTTATAGACAG

扩增体系：5×SF Buffer 10μL，dNTP Mix 1μL，Phanta Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板1μL，水33μL。将上述试剂充分混匀，按下列条件进行扩增：95℃预变性3min后进入循环，循环参数：95℃30s，56℃15s，72℃1min，34个循环后72℃延伸10min，16℃5min。

(2)测序：将扩增的目的基因PCR产物送往生物测序公司测序。

二、实验结果

对分离到的FPV WH1株进行了全基因组测序(141-4875，具体序列如SEQ ID NO：1所示，该序列命名为M)，由于细小病毒3’、5’端具有复杂的二级结构，扩增有一定的难度，所以未能测出两端具体序列，但这并不影响对于该病毒免疫原性的研究。

SEQ ID NO：1：

ttgtgtgtttaaacttgggcgggaaaaggtggcgggctaattgtgggcgtggttaaaggtataaaagacaaaccatagaccgttactgacattcgcttcttgtctttgacagagtgaacctctcttactttgactaaccatgtctggcaaccagtatactgaggaagttatggagggagtaaattggttaaaaaaacatgcagaaaatgaagcattttcgtttgtttttaaatgtgacaacgtccaactaaatggaaaggatgttcgctggaacaactataccaaaccaattcaaaatgaagagctaacatctttaattagaggagcacaaacagcaatggatcaaaccgaagaagaagaaatggactgggaatcggaagttgatagtctcgccaaaaagcaagtacaaacttttgatgcattaattaaaaaatgtctttttgaagtctttgtttctaaaaatatagaaccaaatgaatgtatttggtttattcaacatgaatggggaaaagatcaaggctggcattgtcatgttttacttcatagtaagaacttacaacaagcaactggtaaatggctacgcagacaaatgaatatgtattggagtagatggttggtgactctttgttcggtaaacttaacaccaactgaaaagattaagctcagagaaattgcagaagatagtgaatgggtgactatattaacatacagacataagcaaacaaaaaaagactatgttaaaatggttcattttggaaatatgatagcatattactttttaacaaagaaaaaaattgtccacatgacaaaagaaagtggctattttttaagtactgattctggttggaaatttaactttatgaagtatcaagacagacaaactgtcagcacactttacactgaacaaatgaaaccagaaaccgttgaaaccacagtgacgacagcacaggaaacaaagcgcgggagaattcaaactaaaaaggaagtttcaatcaaatgtactttgcgggacttggttagtaaaagagtaacatcacctgaagattggatgatgttacaaccagatagttatattgaaatgatggcacaaccaggaggtgaaaatcttttaaaaaatacacttgaaatttgtactttgactttagcaagaacaaaaacagcatttgaattaatacttgaaaaagcagataatactaaactaactaactttgatcttgcaaattctagaacatgtcaaatttttagaatgcacggatggaattggattaaactttgtcacgctatagcatgtgttttaaatagacaaggtggtaaaagaaatacagttctttttcatggaccagcaagtacaggaaaatctattattgctcaagccatagcacaagctgtggggaatgttggttgttataatgcagcaaatgtaaattttccatttaatgactgtaccaataaaaatttaatttggattgaagaagctggtaactttggtcaacaagttaatcaatttaaagcaatttgttctggacaaacaattagaattgatcaaaaaggtaaaggaagtaagcaaattgaaccaactccagtaattatgacaactaatgaaaatataacaattgtaagaattggatgtgaagaaagacctgaacatacacaaccaataagagacagaatgttgaacattaagttagtatgtaagcttccaggagactttggtttggttgataaagaagaatggcctttaatatgtgcatggttagttaaacatggttatgaatcaaccatggctaactatacacatcattggggaaaagtaccagaatgggatgaaaactgggcagagcctaaaatacaagaaggtataaattcaccaggttgcaaagacttagagacacaagcggcaagcaatcctcagagtcaagaccaagttctaactcctctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccgtggagtactccagatacgcctattgcagaaactgcaaatcaacaatcaaaccaacttggcgttactcacaaagacgtgcaagcgagtccgacgtggtccgaaatagaggcagacctgagagccatctttacttctgaacaattggaagaagattttcgagacgacttggattaaggtacgatggcacctccggcaaagagagccaggagaggtaagggtgtgttaataaggtggggggaggggaaaaatttaataacttaactaagtatgtgttttcttataggacttgtgcctccaggttataaatatcttgggcctgggaacagtcttgaccaaggagaaccaactaacccttctgacgccgctgcaaaagaacacgacgaagcttacgctgcttatcttcgctctggtaaaaacccatacttatatttctcgccagcagatcaacgctttatagatcaaactaaggacgctaaagattggggggggaaaataggacattatttttttagagctaaaaaggcaattgctccagtattaactgatacaccagatcatccatcaacatcaagaccaacaaaaccaactaaaagaagtaaaccaccacctcatattttcatcaatcttgcaaaaaaaaaaaaagccggtgcaggacaagtaaaaagagacaatcttgcaccaatgagtgatggagcagttcaaccagacggtggtcaacctgctgtcagaaatgaaagagctacaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatttctacgggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacggatgggtggaaatcacagcaaactcaagcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaaaattataaaagagtagttgtaaataatatggataaaactgcagttaaaggaaacatggctttagatgatattcatgtacaaattgtaacaccttggtcattggttgatgcaaatgcttggggagtttggtttaatccaggagattggcaactaattgttaatactatgagtgagttgcatttagttagttttgaacaagaaatttttaatgttgttttaaagactgtttcagaatctgctactcagccaccaactaaagtctataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagatagtaataatactatgccatttactccagcagctatgagatctgagacattaggtttttatccatggaaaccaaccataccaactccatggagatattattttcaatgggatagaacattaataccatctcatactggaactagtggcacaccaacaaatgtatatcatggtacagatccagatgatgttcaattttatactattgaaaattctgtgccagtgcacttactaagaacaggtgatgaatttgctacaggaacatttttttttgattgtaaaccatgtagactaacacatacatggcaaacaaatagagcattgggcttaccaccatttctaaattctttgcctcaatctgaaggagctactaactttggtgatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaactcaaatgggaaatacagactatattactgaagctactattatgagaccagctgaggttggttatagtgcaccatattattcttttgaagcatctacacaagggccatttaaaacacctattgcagcaggacgggggggagcgcaaacagatgaaaatcaagcagcagatggtgatccaagatatgcatttggtagacaacatggtcaaaaaactactacaacaggagaaacacccgagagatttacatatatagcacatcaagatacaggaagatatccagaaggagattggattcaaaatattaactttaaccttcctgtaacaaatgataatgtattgctaccaacagatccaattggaggtaaaacaggaattaactatactaatatatttaatacttatggtcctttaactgcattaaataatgtaccaccagtttatccaaatggtcaaatttgggataaagaatttgatactgacttaaaaccaagacttcatgtaaatgcaccatttgtttgtcaaaataattgtcctggtcaattatttgtaaaagttgcgcctaatttaacaaatgaatatgatcctgatgcatctgctaatatgtcaagaattgtaacttactcagatttttggtggaaaggtaaattagtatttaaagctaaactaagagcatctcatacttggaatccaattcaacaaatgagtattaatgtagataaccaatttaactatgtaccaaataatattggagctatgaaaattgtatatgaaaaatctcaactagcacctagaaaattatattaatatacttactatgtttttatgtttattacatatcaactagcacctagaaaattatactaatatacttactatgtttttatgtttattacatattattttaagattaattaaattacagcatagaaatattgtacttgtatttgatataggatttagaaggtttgttatatggtatacaataactgtaagaaatagaagaacatttagatcatagttagtagtaggttttataaaatgtattgtaaactattaatgtatgttgttatggtgtgggtggttggttggtttgcccttagaatatgttaaggaccaaaaaaatcaataaaagacatttaaaactaaatggtctcgtatactgtctataaggtgaactaacc

实施例5 FPV WH1灭活疫苗安全性及免疫原性的测定

一、实验方法

1、FPV WH1灭活疫苗的制备

(1)扩毒：T75细胞培养瓶中的细胞密度为50％-60％时，以0.1MOI病毒感染细胞，同时换成2％维持液，72h收毒，-80℃与常温交替反复冻融3次，8500rpm，20min，4℃，取上清，将上清用0.22μm滤器过滤。

(2)在病毒液中按照1：2000的比例加入β-丙内酯，4℃灭活24h，灭活结束后37℃水解2h，水解残留的β-丙内酯。

(3)检验灭活：取灭活好的疫苗按照1：10的比例加入CRFK中，盲传三代，观察是否出现病变，检验是否灭活彻底。检测灭活彻底后，4℃保存。

2、灭活疫苗安全性及免疫原性的测定方法

(1)测定疫苗批的毒价，每只猫免疫10^6.5TCID₅₀的剂量，抗原与赛比克水佐剂比例为1：9，皮下多点注射，颈背部皮肤。

(2)免疫之后每天称体重，量体温，观察临床症状，评估疫苗的安全性。

(3)每周对猫进行前肢静脉采血，通过中和实验检测中和抗体水平。

中和实验：将采得的静脉血4℃过夜，析出血清，4500rpm，5min，取上清，56℃灭活30min。使用2％DMEM将血清进行2倍比稀释(4个重复)，加入96孔板，50μL/孔。将病毒液稀释到100TCID₅₀/50μL，与稀释好的血清等量混合，加入96孔板，50μL/孔，37℃感作1h。感作完成后，取出96孔板，同步接种加入细胞，50μL/孔细胞液，使细胞密度在50％-60％。

二、实验结果

安全性评价结果，如图6所示，免疫后14天内，动物未出现不良反应，体温正常，仅有一只猫出现一过性发热，随即便好转，体重未见减少(如图7所示)，呈逐日上升趋势。说明灭活的FPV WH1疫苗株具有良好的安全性。

免疫原性评价结果，免疫之后每隔7天进行一次前肢静脉采血，检测中和抗体水平。在免疫完1周抗体水平就有所上升，在第2、3周抗体水平持续上升。在第4周进行二免，第5周抗体水平大幅度升高至2¹⁶，并且抗体水平始终高于商品化疫苗妙三多(如图8所示)。说明FPV WH1灭活苗具有良好的免疫原性，作为灭活疫苗可以很好的刺激机体产生针对FPV的高水平中和抗体。

另外，由FPV WH1灭活苗刺激产生的中和抗体可以中和本实验室的多株FPV毒株(即图9横坐标1、2、3、6、7、10分别代表不同的6株FPV病毒)，说明FPV WH1疫苗株产生的中和抗体具有广谱的抗病毒作用(如图9所示)，可以对多株野毒产生保护作用。

实施例6 FPV WH1主要抗原结构蛋白VP2基因DNA疫苗的应用

一、实验方法

(1)载体pcDNA3.1分别用EcoR I和Xba I双酶切，纯化回收。

(2)克隆如SEQ ID NO：1所示序列的VP2核苷酸序列(nt 2654-nt 4408)，其中，扩增所用引物包含线性质粒pcDNA3.1同源臂，序列如下所述，扩增体系和扩增程序如实施例4所示。

F：CTAGTCCAGTGTGGTGGATGAGTGATGGAGCAGT

R：TTAAACGGGCCCTCTAGTTAATATAATTTTCTAGGTGC

(3)将上述克隆得到的VP2基因序列与EcoR I和Xba I双酶切后线性pcDNA3.1载体，同源重组，并转化大肠杆菌DH5α，再用氨苄抗生素筛选转化菌落。经PCR、酶切以及测序鉴定，成功构建pcDNA3.1-VP2表达质粒。

将重组质粒pcDNA3.1-VP2转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB(Amp80μg/mL)液体培养基振荡培养16h，收集菌体，按照QIAGEN Plasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，最后得到纯化的质粒DNA，即FPV WH1-VP2基因DNA疫苗pcDNA3.1-VP2。

(4)将上述制备的表达质粒pcDNA3.1-VP2溶解于生理盐水中，浓度调节为1.5μg/μL。2-3月龄健康猫10只，随机均分为2组，皮下注射：(1)以纯化的pcDNA3.1-VP2空质粒载体免疫组作为对照，免疫5只；(2)以纯化的pcDNA3.1-VP2质粒为实验组免疫5只。

二、结果分析

每周取对猫进行前肢静脉采血，通过如实施例5中的中和实验检测中和抗体水平。

实验结果表明和上述灭活疫苗产生了相似的结果：免疫后14天内，动物未出现不良反应，体温正常，未出现一过性发热，体重未见减少，呈逐日上升趋势。说明FPV WH1-VP2DNA疫苗具有良好的安全性，具有批量开发的潜力。

免疫之后每隔7天进行一次前肢静脉采血，检测中和抗体水平。在免疫完第14天抗体开始有所上升，并且3周内呈现抗体水平持续上升的趋势。在第4周进行二免，第5周抗体水平大幅度升高至2¹⁶。说明FPV WH1-VP2 DNA疫苗具有良好的免疫原性，作为DNA疫苗可以很好的刺激机体产生针对FPV的高水平中和抗体。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株猫细小病毒毒株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4785

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgtgtgttt aaacttgggc gggaaaaggt ggcgggctaa ttgtgggcgt ggttaaaggt 60

ataaaagaca aaccatagac cgttactgac attcgcttct tgtctttgac agagtgaacc 120

tctcttactt tgactaacca tgtctggcaa ccagtatact gaggaagtta tggagggagt 180

aaattggtta aaaaaacatg cagaaaatga agcattttcg tttgttttta aatgtgacaa 240

cgtccaacta aatggaaagg atgttcgctg gaacaactat accaaaccaa ttcaaaatga 300

agagctaaca tctttaatta gaggagcaca aacagcaatg gatcaaaccg aagaagaaga 360

aatggactgg gaatcggaag ttgatagtct cgccaaaaag caagtacaaa cttttgatgc 420

attaattaaa aaatgtcttt ttgaagtctt tgtttctaaa aatatagaac caaatgaatg 480

tatttggttt attcaacatg aatggggaaa agatcaaggc tggcattgtc atgttttact 540

tcatagtaag aacttacaac aagcaactgg taaatggcta cgcagacaaa tgaatatgta 600

ttggagtaga tggttggtga ctctttgttc ggtaaactta acaccaactg aaaagattaa 660

gctcagagaa attgcagaag atagtgaatg ggtgactata ttaacataca gacataagca 720

aacaaaaaaa gactatgtta aaatggttca ttttggaaat atgatagcat attacttttt 780

aacaaagaaa aaaattgtcc acatgacaaa agaaagtggc tattttttaa gtactgattc 840

tggttggaaa tttaacttta tgaagtatca agacagacaa actgtcagca cactttacac 900

tgaacaaatg aaaccagaaa ccgttgaaac cacagtgacg acagcacagg aaacaaagcg 960

cgggagaatt caaactaaaa aggaagtttc aatcaaatgt actttgcggg acttggttag 1020

taaaagagta acatcacctg aagattggat gatgttacaa ccagatagtt atattgaaat 1080

gatggcacaa ccaggaggtg aaaatctttt aaaaaataca cttgaaattt gtactttgac 1140

tttagcaaga acaaaaacag catttgaatt aatacttgaa aaagcagata atactaaact 1200

aactaacttt gatcttgcaa attctagaac atgtcaaatt tttagaatgc acggatggaa 1260

ttggattaaa ctttgtcacg ctatagcatg tgttttaaat agacaaggtg gtaaaagaaa 1320

tacagttctt tttcatggac cagcaagtac aggaaaatct attattgctc aagccatagc 1380

acaagctgtg gggaatgttg gttgttataa tgcagcaaat gtaaattttc catttaatga 1440

ctgtaccaat aaaaatttaa tttggattga agaagctggt aactttggtc aacaagttaa 1500

tcaatttaaa gcaatttgtt ctggacaaac aattagaatt gatcaaaaag gtaaaggaag 1560

taagcaaatt gaaccaactc cagtaattat gacaactaat gaaaatataa caattgtaag 1620

aattggatgt gaagaaagac ctgaacatac acaaccaata agagacagaa tgttgaacat 1680

taagttagta tgtaagcttc caggagactt tggtttggtt gataaagaag aatggccttt 1740

aatatgtgca tggttagtta aacatggtta tgaatcaacc atggctaact atacacatca 1800

ttggggaaaa gtaccagaat gggatgaaaa ctgggcagag cctaaaatac aagaaggtat 1860

aaattcacca ggttgcaaag acttagagac acaagcggca agcaatcctc agagtcaaga 1920

ccaagttcta actcctctga ctccggacgt agtggacctt gcactggaac cgtggagtac 1980

tccagatacg cctattgcag aaactgcaaa tcaacaatca aaccaacttg gcgttactca 2040

caaagacgtg caagcgagtc cgacgtggtc cgaaatagag gcagacctga gagccatctt 2100

tacttctgaa caattggaag aagattttcg agacgacttg gattaaggta cgatggcacc 2160

tccggcaaag agagccagga gaggtaaggg tgtgttaata aggtgggggg aggggaaaaa 2220

tttaataact taactaagta tgtgttttct tataggactt gtgcctccag gttataaata 2280

tcttgggcct gggaacagtc ttgaccaagg agaaccaact aacccttctg acgccgctgc 2340

aaaagaacac gacgaagctt acgctgctta tcttcgctct ggtaaaaacc catacttata 2400

tttctcgcca gcagatcaac gctttataga tcaaactaag gacgctaaag attggggggg 2460

gaaaatagga cattattttt ttagagctaa aaaggcaatt gctccagtat taactgatac 2520

accagatcat ccatcaacat caagaccaac aaaaccaact aaaagaagta aaccaccacc 2580

tcatattttc atcaatcttg caaaaaaaaa aaaagccggt gcaggacaag taaaaagaga 2640

caatcttgca ccaatgagtg atggagcagt tcaaccagac ggtggtcaac ctgctgtcag 2700

aaatgaaaga gctacaggat ctgggaacgg gtctggaggc gggggtggtg gtggttctgg 2760

gggtgtgggg atttctacgg gtactttcaa taatcagacg gaatttaaat ttttggaaaa 2820

cggatgggtg gaaatcacag caaactcaag cagacttgta catttaaata tgccagaaag 2880

tgaaaattat aaaagagtag ttgtaaataa tatggataaa actgcagtta aaggaaacat 2940

ggctttagat gatattcatg tacaaattgt aacaccttgg tcattggttg atgcaaatgc 3000

ttggggagtt tggtttaatc caggagattg gcaactaatt gttaatacta tgagtgagtt 3060

gcatttagtt agttttgaac aagaaatttt taatgttgtt ttaaagactg tttcagaatc 3120

tgctactcag ccaccaacta aagtctataa taatgattta actgcatcat tgatggttgc 3180

attagatagt aataatacta tgccatttac tccagcagct atgagatctg agacattagg 3240

tttttatcca tggaaaccaa ccataccaac tccatggaga tattattttc aatgggatag 3300

aacattaata ccatctcata ctggaactag tggcacacca acaaatgtat atcatggtac 3360

agatccagat gatgttcaat tttatactat tgaaaattct gtgccagtgc acttactaag 3420

aacaggtgat gaatttgcta caggaacatt tttttttgat tgtaaaccat gtagactaac 3480

acatacatgg caaacaaata gagcattggg cttaccacca tttctaaatt ctttgcctca 3540

atctgaagga gctactaact ttggtgatat aggagttcaa caagataaaa gacgtggtgt 3600

aactcaaatg ggaaatacag actatattac tgaagctact attatgagac cagctgaggt 3660

tggttatagt gcaccatatt attcttttga agcatctaca caagggccat ttaaaacacc 3720

tattgcagca ggacgggggg gagcgcaaac agatgaaaat caagcagcag atggtgatcc 3780

aagatatgca tttggtagac aacatggtca aaaaactact acaacaggag aaacacccga 3840

gagatttaca tatatagcac atcaagatac aggaagatat ccagaaggag attggattca 3900

aaatattaac tttaaccttc ctgtaacaaa tgataatgta ttgctaccaa cagatccaat 3960

tggaggtaaa acaggaatta actatactaa tatatttaat acttatggtc ctttaactgc 4020

attaaataat gtaccaccag tttatccaaa tggtcaaatt tgggataaag aatttgatac 4080

tgacttaaaa ccaagacttc atgtaaatgc accatttgtt tgtcaaaata attgtcctgg 4140

tcaattattt gtaaaagttg cgcctaattt aacaaatgaa tatgatcctg atgcatctgc 4200

taatatgtca agaattgtaa cttactcaga tttttggtgg aaaggtaaat tagtatttaa 4260

agctaaacta agagcatctc atacttggaa tccaattcaa caaatgagta ttaatgtaga 4320

taaccaattt aactatgtac caaataatat tggagctatg aaaattgtat atgaaaaatc 4380

tcaactagca cctagaaaat tatattaata tacttactat gtttttatgt ttattacata 4440

tcaactagca cctagaaaat tatactaata tacttactat gtttttatgt ttattacata 4500

ttattttaag attaattaaa ttacagcata gaaatattgt acttgtattt gatataggat 4560

ttagaaggtt tgttatatgg tatacaataa ctgtaagaaa tagaagaaca tttagatcat 4620

agttagtagt aggttttata aaatgtattg taaactatta atgtatgttg ttatggtgtg 4680

ggtggttggt tggtttgccc ttagaatatg ttaaggacca aaaaaatcaa taaaagacat 4740

ttaaaactaa atggtctcgt atactgtcta taaggtgaac taacc 4785

Claims (7)

1.一株猫细小病毒毒株，其特征在于，其保藏编号为：CCTCC NO:V202127，保藏时间为：2021年4月27日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

2.如权利要求1所述的猫细小病毒毒株，其特征在于，所述毒株的基因序列如SEQ IDNO：1所示。

3.如权利要求1所述的猫细小病毒毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO：1所示的基因序列在制备疫苗中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为防治猫泛白细胞减少症的疫苗。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗还包括水佐剂赛比克。

7.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的猫细小病毒毒株或权利要求2中所述的如SEQ ID NO：1所示的基因序列。

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