JP5893829B2 - イヌパルボウイルス遺伝子変異株を含むワクチン - Google Patents

Description

配列リスト
本出願は、配列リストとして、２００８年６月１２日に作成した３，７８０バイトを収容した添付のテキストファイル“Sequence.txt”の内容全体を含み、これを本明細書に援用する。

発明の分野
本発明は一般に、改良されたイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ワクチン製剤および診断試験に関する。特に本発明は、イヌ類の集団で現在広まっている新たに出現した優性ＣＰＶ変異株を含む改良されたＣＰＶワクチン製剤および診断試験を提供する。

イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は主にイヌ、特に若いイヌに感染する腸病原体である。パルボウイルス感染症は、イヌおよび４〜５週齢以上の子犬における急性の下痢、発熱および白血球減少症、ならびにより若い子犬における心筋疾患を特徴とする。ワクチンを接種していないイヌではこの疾患による致死率がきわめて高い。ＣＰＶに対するワクチンはあるが、ＣＰＶは一本鎖ＤＮＡウイルスであり、極端な変異能をもつので、このウイルスは著しい抗原性変動能を示し、このためワクチンがもたらす免疫防御を逃れる。したがって、原因物質の抗原型および遺伝子型を絶えずモニターする必要がある。

ＣＰＶは１９７８年に初めて分離され、それをパルボウイルスイヌ微小ウイルス（parvovirus canine Minute virus）（ＣＭＶまたはＣＰＶ−１）と区別するために”ＣＰＶ−２”と命名された。ＣＰＶ−２は一般に、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）またはミンク腸内ウイルス（ＭＥＶ）の遺伝子変異株であると考えられており、ミンク、キツネ、アライグマその他の肉食動物に感染するパルボウイルスに遺伝的および抗原的にきわめて近縁である。ＣＰＶのキャプシドは約５２００塩基の一本鎖ＤＮＡゲノムを含み、２つのオープンリーディングフレームをもつにすぎないが、オルタナティブｍＲＮＡスプライシングのため少なくとも４種類のタンパク質をコードする。パルボウイルスのキャプシドは２種類のウイルスタンパク質（ＶＰ）、ＶＰｌおよびＶＰ２から構成され、ＶＰ２が主な免疫原パルボウイルスキャプシドタンパク質である。起源ＣＰＶ分離株の遺伝子変異株が１９７９〜１９８０年に同定され、ＣＰＶ ２ａ型と命名された。１９８０年代半ばにさらに他の変異株２ｂ型が同定され、それ以来、２ａ型および２ｂ型は起原ＣＰＶ−２を完全に排除したと思われる。現在のワクチンは２ａおよび２ｂ変異株のみに対するものであるが、２ａ変異株は米国ではもはや検出されない。ＣＰＶの発見および進化の概説については、Parrish and Kawaoka, 2005を参照されたい。

ＣＰＶ−２ｂは２つのアミノ酸位置においてＣＰＶ−２ａと異なるにすぎない：２ａのＡｓｎ−４２６（ＡＡＴによりコードされる）が２ｂではＡｓｐ（ＧＡＴによりコードされる）であり、２ａのＩｌｅ−５５５が２ｂではＶａｌである。Ｉｌｅ−５５５からＶａｌへの変化は、実際には起源型２の配列への復帰である。ＣＰＶ−２ａおよび２ｂ抗原型は長年、比較的安定であると思われていた。しかし２０００年に、位置４２６がＧＡＡによりコードされるＧｌｕである変異株”２ｃ”が記載された（位置５５５はＶａｌのままである）。２ｃ変異株は、イタリア(Buonavoglia et al., 2001)、ベトナム(Nakamura et al., 2001)、およびスペインを含む他の国(Nakamura et al., 2004; Decaro et al., 2006)で報告されているが、現在までに米国では２ｃ変異株の確認の報告はなく、ＣＰＶワクチンはそのような変異株を含むように更新されてはいない。主に子犬に感染するこれまでに記載された変異株と異なり、ＣＰＶ２ｃは成犬に対する感染能をもつので、これは特に重大である。さらに、位置４９４および５７２にコドン変異をもつ２ｂ変異株の配列が２００３年にＧｅｎＢａｎｋに提出され（ｇｉ：５４６４６３４０）、Shackelton et al. 2005 (Proceedings National Academy Sciences 102:379-384)に報告されたが、そのような配列に基づくＣＰＶワクチンまたは診断用組成物の変更は提唱されなかった。

ワクチンを更新しない場合には幾つかの問題が生じる。第１に、ワクチン接種してもイヌはそのワクチンに含まれないＣＰＶ変異株による感染に対して感受性である可能性がある。第２に、ワクチン接種したイヌが罹患すると、それらの飼主はそのワクチン中のウイルス株がその疾患を引き起こしたと主張することが頻繁にある。ワクチン企業がそれに反論する証拠を提示するための実際的な方法はないので、その結果飼主に賠償を支払うことが頻繁に起きた。

幾つかのＣＰＶワクチン製剤が提唱されている：
米国特許第４，１９３，９９０号および第４，１９３，９９１号（Ａｐｐｅｌら）には、それぞれヘテロタイプおよび不活化（”死滅させた”）ウイルスワクチンが報告されており、例示されたワクチンは起源ＣＰＶに対する防御をもたらした。

米国特許第４，３０３，６４５号（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら）には、非発癌性細胞系においてウイルスを長期間の連続継代により作製した弱毒ＣＰＶを含むワクチンが記載されている。例示されたワクチンは同様に起源ＣＰＶ分離株に対して防御する。

米国特許第４，９７１，７９３号（Ｗｏｏｄら）および米国特許第５，８８２，６５２号（Ｖａｌｄｅｓら）の両方に、組換えバキュロウイルスにおいて産生されたＣＰＶ ＶＰ−２タンパク質を含む組換えサブユニットワクチンが記載されている。このＶＰ−２タンパク質は特定されたタイプまたはサブタイプのものではない。

米国特許第５，８８５，５８５号（Ｐａｒｒｉｓｈら）には、弱毒型の２ｂ変異株を含むＣＰＶワクチンが記載されている。

米国特許第４，１９３，９９０号 米国特許第４，１９３，９９１号 米国特許第４，３０３，６４５号 米国特許第４，９７１，７９３号 米国特許第５，８８２，６５２号 米国特許第５，８８５，５８５号

Parrish, Colin R. And and Yoshihiro Kawaoka, Anna. Rev. Microbiol. (2005) 59, 553-86 Buonavoglia, Canio, V. Martella, A. Pratelli, M. Tempesta, A. Cavalli, D. Buonavoglia, G. Bozzo, G. EHa, N. Decaro and L. Carmichael, J. Gen. Virol. (2001) 82, 3021-3025 Nakamura, Kazuya, M. Sakamoto, Y. Ikeda, E., Sato, K. Kawakami, T. Miyazawa, Y. Tohya, E. Takahashi, E. Mikami, T. Mikami and M. Mochizuki. Clin. Diag. Lab. Immuno. (2001) 663-668 Nakamura M., Tohya, Y., Miyazawa, T., Mochizuki, M., Phung, H. T., Nguyen, N. H., Huynh, L. M., Nguyen, L. T., P. N. Nguyen, P. N., Nguyen, P. V., Akashi, H. (2004) Arch. Virol. 149, 2261-2269 Decaro, Nicola, V. Martella, G. Elia, C. Desario, M. Compolo, E. Lorusso, M. L. Colaianni, A. Lorusso, and C. Buonavoglia, Vet. Micro. 121 (2007) 39-44 Shackelton et al. 2005 (Proceedings National Academy Sciences 102:379-384)

ＣＰＶウイルスは変異して新たな抗原性変異株を発現する能力をもつため、遺伝子構成をモニターして現在のＣＰＶ変異株を反映するワクチンおよび診断試験を開発することが依然として求められている。

本発明は、ＣＰＶ感染症を予防するための更新されたワクチン、および新たに出現したＣＰＶ変異株を検出するための診断法を提供する。これらのワクチンおよび診断法は、これまで知られていなかったＣＰＶ変異株およびこれまで認識されていなかったＣＰＶ変異株の知見に基づき、従来のワクチン製剤および診断法が不適切であるウイルス変異型の出現を考慮している。本発明のワクチンは新生のＣＰＶ型に対する防御をもたらすことを意図し、診断法は新たに進化した型のウイルスを検出する能力を備えており、これらの能力は共にこれまで得られていなかった。特に、新たな希有変異株のひとつはワクチン中の”マーカー”変異株として有用である。マーカー変異株の使用により、そのマーカー変異株を含むワクチンを接種した動物における病状がＣＰＶのワクチン株により起きたのか他の株により起きたのか否かを法医学的に調べることが可能になる。

新規ワクチン製剤には、下記の特性のうち１以上をもつ一本鎖ＤＮＡを含む弱毒全ＣＰＶが含有される：
２ｂ△４９４△５７２は２ｂ ＣＰＶ変異株であり、少なくとも下記の変化を含む：ＶＰ２タンパク質の位置４９４をコードするコドンがＴＧＴではなくＴＧＣであり、ＶＰ２タンパク質の位置５７２をコードするコドンがＧＴＡではなくＧＴＣである。これらの変化はアミノ酸の変化を生じない（ＴＧＣおよびＴＧＴは両方ともシステインをコードし、ＧＴＣおよびＧＴＡは両方ともバリンをコードする）。それにもかかわらず、この変異株は一般的な現在得られるワクチンを予め接種した動物に疾患を引き起こすので、新規ワクチン製剤に組み込むべきである。位置４９４および５７２におけるこれらの変化はこれまでに記載されてはいたが、それらは認識されていなかった。さらに、このアメリカ分離株は他の変異を含む可能性がある。

２ｂ△４３１は新たに見いだされた希有２ｂ ＣＰＶ変異株であり（たとえば２ｂ△４９４△５７２の変異株）、この場合はＶＰ２タンパク質の位置４３１をコードするコドンがＣＴＡではなくＣＴＧである。この変化もアミノ酸の変化を生じないが、それにもかかわらずこの変異株はワクチン接種した動物に同様に疾患を引き起こすので、新規ワクチン製剤に組み込むことができる。重要なことに、２ｂ△４３１はその希少性のため理想的なワクチン”マーカー”配列となる。

アメリカ（または米国）２ｃは米国で分離された最初の２ｃ変異株であり、主要な（８１％）２ｃ変異株である。この変異株は”主２ｃ変異株”とも表記される。
２ｃ△４４０は新たに見いだされた２ｃ ＣＰＶ変異株であり、この場合はＶＰ２タンパク質の位置４４０をコードするコドンがＡＣＡではなくＧＣＡであり、その結果、アミノ酸配列がこの位置においてトレオニン（ＡＣＡ）からアラニン（ＧＣＡ）に変化する。この変異株はワクチン接種した動物に疾患を引き起こすので、新規ワクチン製剤に組み込むべきである。この変異株は現在は少数（１９％）変異株であり、”副２ｃ変異株”とも表記される。

２ｃ△４４０のさらに変異株である２ｃ△４３０△４４０は、位置４４０に対するコドンにＧＣＡを含むほか、位置４３０に通常のＴＴＧではなくＴＴＡがコードするロイシンをもつことによっても既知の２ｃ配列と異なる。

これらのＣＰＶ変異株はすべてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により検出され、既に一般的な市販ワクチンを用いてＣＰＶに対しワクチン接種されていたであろうＣＰＶ感染イヌおよび／またはそれらの子犬から細胞培養で分離された。したがって、これらの新たに出現した変異株は、その変異がＶＰ２タンパク質の指示した位置においてアミノ酸配列を変化させる（２ｃ△４４０および２ｃ△４３０△４４０の一部）か、または変化させない（２ｂ△４９４△５７２および２ｂ△４３１）かにかかわらず、現行のプロトコルに従ってワクチン接種したイヌの免疫監視を逃れることができる。さらに、現場用として現在得られる診断技術はこれらの新たなＣＰＶ変異株を検出できず、または反応性に乏しく、このため感度が低い。本発明は、新たな変異株を考慮したワクチンおよび診断法を提供することによりこれらの問題を解決する。

図１は、２ｂ△４９４△５７２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１により表わされる核酸配列）を例示し、この場合、位置４９４に対するコドンがＴＧＣであり、位置５７２に対するコドンがＧＴＣである。このＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はアミノ酸４２６から５７２のみをコードする核酸配列を反映し、一方ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は図１全体に示す配列を反映する。 図２は、２ｂ△４３１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２により表わされる核酸配列）を例示し、この場合、位置４３１に対するコドンがＣＴＧである。このＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はアミノ酸４２６から５７２のみをコードする核酸配列を反映し、一方ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は図２全体に示す配列を反映する。 図３は、主アメリカ２ｃ ＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３により表わされる核酸配列）を示す。 図４は、２ｃ△４４０（副アメリカ２ｃ）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４により表わされる核酸配列）を例示し、この場合、位置４４０に対するコドンがＡＣＡではなくＧＣＡであり、トレオニンではなくアラニンをコードする。このＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列を示す。 図５は、２ｃ△４３０△４４０配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５により表わされる核酸配列）を例示する。 図６は、２ｃ変異株（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す）に関連する推定フォールド構造を示す。 図７は、２ｂ△４３１変異株（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す）に関連する推定フォールド構造を示す。 図８は、２ｃ△４３０△４４０変異株（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す）に関連する推定フォールド構造を示す。

本発明はさらに、１種類以上のＣＰＶ変異株を含むパルボウイルスワクチンを提供する。その１種類以上のＣＰＶ変異株の中和レベルは、ＣＰＶ変異株であるＣＰＶ−２、ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂおよびＣＰＶ−２ｃのうち１種類以上を含むワクチンを接種した動物からの血清を用いて測定して、ＣＰＶ−２、ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂおよびＣＰＶ−２ｃからなる群より選択される１種類以上のＣＰＶ変異株の中和レベルより少なくとも４倍低い。ある態様において、中和レベルは血清中和アッセイにより決定され、中和力価として表わされる。

図１は、２ｂ△４９４△５７２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１により表わされる核酸配列）を例示し、この場合、位置４９４に対するコドンがＴＧＣであり、位置５７２に対するコドンがＧＴＣである。このＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列を示す。 図２は、２ｂ△４３１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２により表わされる核酸配列）を例示し、この場合、位置４３１に対するコドンがＣＴＧである。このＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列を示す。 図３は、主アメリカ２ｃ ＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３により表わされる核酸配列）を示す。 図４は、２ｃ△４４０（副アメリカ２ｃ）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４により表わされる核酸配列）を例示し、この場合、位置４４０に対するコドンがＡＣＡではなくＧＣＡであり、トレオニンではなくアラニンをコードする。このＶＰ２タンパク質のアミノ酸４２６〜５７２をコードする核酸配列を示す。 図５は、２ｃ△４３０△４４０配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５により表わされる核酸配列）を例示する。 図６は、２ｃ変異株に関連する推定フォールド構造を示す。 図７は、２ｂ△４３１変異株に関連する推定フォールド構造を示す。 図８は、２ｃ△４３０△４４０変異株に関連する推定フォールド構造を示す。

本発明は、ＣＰＶワクチンおよび診断法を提供し、その組成物はＣＰＶの進化動向を反映する新たに見いだされた変異株を含有する。変異株はそれぞれ、既にＣＰＶに対してワクチン接種されたにもかかわらずＣＰＶに罹患して疾病状態になったイヌから分離された。したがって、ＣＰＶの拡散を阻止または縮小するために、これらの新たな変異株をワクチンプロトコルに組み込むことができる。さらに、以下に詳述するように、これらの変異株の同定によりＣＰＶゲノムの超可変部が見いだされた。

本明細書に記載する変異株が見いだされたことにより、ＣＰＶゲノムの決定的な超可変（ＨＰＶ）部が同定された。従来は位置１２７６〜１２７７のヌクレオチドのみが重要であると考えられていた。しかし、本明細書に記載する疫学的知見により、決定的なＨＰＶ部は実際にはＣＰＶゲノムのほぼ中央の、完全ＶＰ２遺伝子の位置１２７５〜１３２６に位置することが示された。このＨＰＶ部には、ＶＰ２遺伝子の少なくとも２つの決定的な超可変コドン、すなわちコドン４２６および４４０が含まれる。好ましくは、超可変部はコドン４２６の１つ前のヌクレオチドから始まり４４０までの領域を含む。理論により拘束されるわけではないが、後記にさらに詳細に述べるように、このＨＰＶ部の生物学的重要性はこの配列により形成される構造の熱力学的安定性に関係すると思われる。

変異株は下記のものである：
２ｂ△４９４△５７２は２ｂ ＣＰＶ変異株であり、この場合、ＶＰ２タンパク質の位置４９４に対するコドンがＴＧＴではなくＴＧＣであり、ＶＰ２タンパク質の位置５７２に対するコドンがＧＴＡではなくＧＴＣである。これらの変異はいずれもコードされるアミノ酸を変化させず（Ｃｙｓが位置４９４に、Ｖａｌが位置５７２にある）、これらの配列はこれまでに記載されている。それにもかかわらず、本明細書に記載するようにこれらの変化によりこのウイルスが現在得られるワクチンを接種した宿主の免疫クリアランスを逃れうることは、これまで認識されていなかった。この変異株を図１に表わす；ここには、２ｂ（すなわち、４２６＝ＧＡＴ）ＶＰ２遺伝子のアミノ酸４２６〜５７２をコードする部分を示す。２つの変異コドン（４９４および５７２）を太字で示し、下線を施す。

２）２ｂ△４３１は希有２ｂ ＣＰＶ変異株であり、位置４３１をコードするコドンにＣＴＡからＣＴＧへの変化を含む。起源２ｂ△４３１分離株は２ｂ△４９４△５７２変異も含んでいたので、２ｂ△４３１２ｂ△４９４△５７２である。しかし本発明には、ＶＰ２タンパク質の位置４３１をコードするコドンにＣＴＧを含むＣＰＶ配列（２ａ、２ｂまたは２ｃ）がいずれも含まれる。この変異によりアミノ酸の変化は生じない（ＣＴＡおよびＣＴＧは両方ともＬｅｕをコードする）が、２ｂ△４３１はその希少性のため法医学的目的にとって理想的なワクチン”マーカー”配列となる。本発明のこの観点については後記に詳細に述べる。この変異株を図２に表わす；ここには、２ｂ（すなわち、４２６＝ＧＡＴ）ＶＰ２遺伝子のアミノ酸４２６〜５７２をコードする部分を示す。３つの変異コドン（４３１、４９４および５７２）を太字で示し、下線を施す。

３）アメリカ２ｃは米国で分離された最初の２ｃ変異株である。この変異株の著しい出現はこれまで認められていなかった（図３を参照）。
４）２ｃ△４４０は２ｃ ＣＰＶ変異株であり、この場合はＶＰ２タンパク質の位置４４０をコードするコドンがＡＣＡではなくＧＣＡである。この変異の結果、アミノ酸が位置４４０においてＴｈｒからＡｌａに変化する。さらに、この変異株は予めワクチン接種したにもかかわらずＣＰＶに罹患したイヌからも分離された。したがって、この変異配列を新規なＣＰＶワクチンおよび診断用製剤に組み込むべきである。この変異を図４に表わす；ここには、２ｃ ＶＰ２遺伝子（すなわち、４２６＝ＧＡＡ）のアミノ酸４２６〜５７２をコードする部分を示す。変異コドン（４４０）を太字で示し、下線を施す。参考のためコドン４９４および５７２に下線を施す。

２ｃ△４４０のさらに他の変異株である２ｃ△４３０△４４０は、位置４４０に対するコドンにＧＣＡを含むほか、位置４３０に通常のＴＴＧではなくＴＴＡがコードするロイシンをもつことにより既知の２ｃ配列と異なる。この変異を図５に表わす。

表１にこれらの変異株における配列変化のまとめを示す：
表１．現在の米国ＣＰＶ変異株におけるＶＰ２タンパク質の決定的アミノ酸に関連するコドン

^＊ 変異コドンを示す。
位置４９４および５７２における変化はこれまでに記載されていたが、この変異株に現われた優位性および特性はこれまで認識されていなかった。本明細書に記載する変異株はすべて、既にＣＰＶに対するワクチンを接種されていたけれどもＣＰＶに罹患して死亡したイヌ（またはその子孫）から分離された。これらの変異株は最初に米国中南部で確認されたが、米国の他の地域でも散発的に報告されているイヌのワクチン耐性パルボウイルス病に関与していると考えられる。これまでにオーストラリアおよびアフリカ以外のすべての国で検出された変異株２ｃは、現在では１４州（アラバマ、アリゾナ、アーカンサス、カリフォルニア、デラウェア、フロリダ、イリノイ、カンサス、ニュージュージー、ミズーリ、オレゴン、オクラホマ、サウスカロライナ、およびテキサス）で検出されている。これまでに知られているＣＰＶ変異株の急激な播種の歴史からみて、これら最新型のウイルスの拡散を止めるために、これらの変異株のうち１以上を速やかに世界中のワクチンに組み込むべきである。さらに、これらの出現した変異株を考慮に入れてＣＰＶの診断試験および診断法を再構成すべきである。

実施例のセクションに記載するように、本発明のＣＰＶ変異株をそれから分離したワクチン接種イヌにおける病状の発現および死亡はきわめて急激であり、現在のワクチンに含まれるＣＰＶ型に対する免疫系応答によって阻止されない強健な逸出変異株の存在が指摘される。これは、ＶＰタンパク質の一次配列に変化を生じる２ｃ△４４０についてだけでなく、調べた領域のアミノ酸の変化を含まない２ｃ△４３１、２ｂ△４９４△５７２についても同様であった。２ｂ△４９４△５７２のコドン変化の重大性はこれまで認識されておらず、本発明者らの知る限り、本明細書の記載に従ってこれらの出現した変異株を組み込むかまたは考慮するようにＣＰＶワクチンの組成および診断法を調整するという提案は現在まで無い。さらに、２ｃ△４４０および２ｂ△４３１はこれまでに記載されていない新たな変異株である。

これらの変異はウイルスに生存上の利点をもたらすと思われる。理論により拘束されるわけではないが、変異配列はウイルスのライフサイクルのある段階でウイルス粒子またはＤＮＡ自体に利点をもたらすという可能性がある（たとえば、宿主のヌクレアーゼに対する防御；より速やかまたはより効率的な転写および／または翻訳、その結果、たとえば異なるパターンのタンパク質フォールディングが生じる可能性がある；より速やかまたはより効率的なウイルス粒子中へのパッケージング、など）。たとえば、ＤＮＡポリメラーゼがＣＰＶのＤＮＡを複製する際に、変異配列はアンフォールディングの熱力学に関して利点をもたらす可能性がある。図６〜８は、それぞれＣＰＶ２ｃ、ＣＰＶ２ｂ△４３１、およびＣＰＶ２ｃ△４３０△４４０の超可変部のフォールド構造を表わす；これらについてはさらに実施例３に記載する。

本発明の１態様において、繁栄している出現ＣＰＶ変異株、たとえばＣＰＶ２ｃ△４３０△４４０は、実験条件下で市販のワクチン製剤の価値を検査するための攻撃ウイルスとして使用できる。ＣＰＶ２ａおよびＣＰＶ２ｂの最も古い型の変異株はイヌに対して病原性が高くはなく、より新しいＣＰＶ２ｃは研究されていない。病毒性の高い攻撃モデルが無かったため、現在までワクチン企業はワクチン製剤が接種動物に防御をもたらす能力を適正に評価することができなかった。したがって本発明は、ワクチン接種した動物を病毒性の高い変異株ＣＰＶ２ｃ△４３０△４４０に曝露し、そのワクチンが疾患に対して防御するか否かを評価することにより、それを行なう方法をも提供する。

本明細書に記載するそれぞれの変異株について、本発明には、１種類以上の変異株を含有するワクチン製剤および診断薬、ならびにそれらを使用する方法が含まれる。好ましくは、そのような製剤および診断薬は２ｃ△４４０もしくは２ｂ△４３１、または両方を含有する。そのような製剤および診断薬は、さらに２ｂ△４９４△５７２および／またはアメリカ２ｃ、および／または他の既知のＣＰＶ配列、たとえば現在のワクチンに既に含まれるものを含有することができる。さらに、新規配列をもつ他の新たに分離されたウイルス、特に新規アミノ酸配列をもつウイルスは、新規ワクチンに組み込むのに適切な場合または適切ではない場合がある。一般に、新たな現場分離株を組み込むという判断は、既存のワクチンがワクチン接種動物においてその現場分離株に対する中和反応を誘発する能力、および一部はその変異株の優勢度に基づく。新たな変異株が汎存性である場合、抗原としてのそれの重要性を判定すべきである。これの尺度のひとつは抗原距離（antigenic distance）である。特定のＣＰＶ分離株の総抗原距離は機能アッセイ法、たとえば血清中和力価および／または血球凝集反応アッセイ法および／または間接蛍光抗体検査法を用いて分離株を試験することにより決定できる。１以上のアッセイ法によって分離株が既にワクチン中にあるウイルス変異株と比較して低い中和度を示す場合（すなわち、新たなヘテロロガス分離株の中和レベルが既にワクチン中にある変異株の中和レベルより４倍以上低い場合）、その新たな分離株を含む新規ワクチンの開発は保証できる。たとえば、新たなＣＰＶ変異株が分離された場合、その総抗原距離を血清中和アッセイ法により計算し、結果を中和力価として表わすことができる。中和力価は、ワクチン接種した動物からの血清の中和が完全である（細胞障害作用（ＣＰＥ）またはウイルスの存在が無いことによって証明される）最高希釈度の逆数である。既存のＣＰＶワクチンを接種したイヌからの血清がたとえばホモロガスウイルスについて１：４０００のＳＮ力価、および新たなヘテロロガスＣＰＶ分離株について１：２００の力価を与えた場合、この新たな分離株はＣＰＶワクチンに組み込むべきであると思われる。言い換えると、現在のワクチンが現在のワクチン中に無い一般的な汎存変異株に対して防御しない場合、その変異株を新規ワクチン製剤に慎重に組み込むことができる。その分離株が狭い地域に局在する場合、広範に使用するために設計する市販ワクチンより注文生産または自家ワクチンの方が適切な可能性がある。結果を攻撃防御実験で同様に確認すべきである。攻撃防御実験では、動物にワクチンを接種し、次いで適量（たとえば１０，０００ ＴＣＩＤ ５０、すなわち組織培養感染量中央値（median tissue culture infective dose））の攻撃ウイルスとして用いる変異株に曝露する。ワクチンがその変異株に対する防御をもたらす場合、その変異株をワクチン組成物に組み込む必要はない。しかし、ワクチン接種した動物がその変異株から防御されない場合、その変異株をワクチン製剤に組み込むことができる。さらに、ワクチン接種の過程で必ずしもすべての株または変異株を同一注射に含める必要はない。たとえば、子犬に１種類の変異株を含有する一回分を３週齢時に投与し、異なる変異株を含有する一回分を７週齢時に投与し、さらに他の変異株を含有する一回分を１０週齢時に投与することが好ましい場合がある。これは、同一変異株を子犬に対する３回分すべてについて投与する現行方法とは対照的である。この現行方法は、以前のワクチン接種に応答して発生した既存免疫が、後続ワクチン接種に際して送達される進入ＣＰＶウイルスを中和し、これにより後続ワクチンをほとんどまたは全く無益なものにする可能性があるという欠点をもつ。注意すべきことであるが、あるウイルス病原体が複数の種に感染する可能性があることは周知である。ＣＰＶの場合、ネコウイルスおよびミンクウイルスがイヌにも感染することが知られている。そのようなウイルスをイヌのＣＰＶワクチンに組み込むことは推奨できないが、ワクチン接種する動物の攻撃実験にはこれらのネコウイルスおよびミンクウイルスを含めるべきである。

特に、変異株２ｂ△４３１は法医学的トラッキングおよび検出に適切なワクチンの調製に有用である。前記のように、現在のワクチンは接種した動物を出現ＣＰＶに対して次第に防御できなくなっている。ワクチン接種後に罹患した動物の飼主はワクチン自体が疾患の原因であると非難する傾向がある。現行の診断法はワクチン株と出現株を識別するのには不適切なので、ワクチン製造業者は実際的なそのような非難に対抗する防衛策をもたず、しばしば動物の飼主に賠償することによりそのような告発を鎮静する。この処理はワクチン製造業者にとって著しい経費がかかる。また、コドン４３１がコドン４２６に近接し、それがＣＰＶゲノムの超可変部内にあることも、罹患イヌにおける原因ＣＰＶ物質を立証するためになしうる配列決定がごく限定される。これは、ワクチンを調製するために用いる１種類以上のワクチン株に２ｂ△４３１変異を組み込むことにより避けられる。２ｂ△４３１はきわめて希有である；例えば、この変異株は現在までに調べられた変異株の約１．２％である。したがって、２ｂ△４３１変異株をワクチン接種して罹患した動物からの組織をＣＰＶについて検査した場合に、２ｂ△４３１以外のＣＰＶ株が検査されれば、そのワクチンはその疾患の原因ではなかったと確実に結論できる。むしろ、この検出された他の株が犯人であった可能性がある。さらに、△４３１変異は多大な配列決定を行なうことなく検出できる。このタイプの法医学的調査はワクチン企業に著しい経費節減をもたらすであろう。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４および５により表わされる単離した核酸配列、ならびに／あるいはそれらの配列によりコードされるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含むワクチン製剤、ならびにそれらの使用方法を提供する。さらに、これらの配列の特定の変異を含むワクチンも含まれる。これらの配列は一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡであるが、本発明には、これらの配列に基づく、由来する、または相補的である、対応する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、およびいずれかの形のＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドなど）も含まれる。そのような配列はセンス配列またはアンチセンス配列のいずれであってもよい。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４および５に対して少なくとも約５０％の相同性、好ましくは約６０％、より好ましくは約７０、８０もしくは９０％の相同性、またはさらに約９５、９６、９７、９８もしくは９９％またはそれ以上の相同性を示す配列も、ワクチン中に使用することが考慮される。そのような配列は、たとえば１以上の位置に同一アミノ酸をコードする代替コドンを含むことにより異なってもよい。さらに、これらの配列のＣＰＶ ＶＰ２タンパク質の抗原性領域をコードする部分、およびそのようなアミノ酸配列に対して７０％、またはさらに好ましくは約８０、９０もしくは９５％、またはさらにそれ以上の同一性（たとえば９６、９７、９８または９９％の同一性）を示す配列も考慮される。そのような配列は、生成するタンパク質／ペプチドが本明細書に記載するように抗原性である限り、たとえば保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換、または欠失（特にアミノ末端またはカルボキシ末端の欠失）、または種々の挿入などを含むことにより異なってもよい。そのような抗原性領域は好ましくは少なくとも約１０のアミノ酸の長さであり、ＶＰタンパク質の位置４２６、４３１、４４０、４９４、５５５および５７２のうち１以上を含む。しかし、抗原性領域はＶＰ２遺伝子全体を含むことができる。

さらに、本明細書に記載する配列（またはそれらの配列の一部）にストリンジェントな条件（特に高ストリンジェンシーの条件）下でハイブリダイズする核酸配列も考慮される。ストリンジェントな条件とは、核酸配列を特定の配列にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション条件を表わす。一般に高ストリンジェンシーの条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００ヌクレオチド以上の核酸配列を特定の配列に、約６５℃で、約１Ｍの塩類を含有する溶液、好ましくは６ｘＳＳＣ、または匹敵するイオン強度をもつ他のいずれかの溶液中においてハイブリダイズさせ、そして約６５℃で、約０．１Ｍ以下の塩類を含有する溶液、好ましくは０．２ｘＳＳＣ、または匹敵するイオン強度をもつ他のいずれかの溶液中において洗浄するハイブリダイゼーション条件を表わす。これらの条件により、約９０％以上の配列同一性をもつ配列を検出できる。一般に、より低いストリンジェンシーの条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００ヌクレオチド以上の核酸配列を特定の配列に、約４５℃で、約１Ｍの塩類を含有する溶液、好ましくは６ｘＳＳＣ、または匹敵するイオン強度をもつ他のいずれかの溶液中においてハイブリダイズさせ、そして室温で、約１Ｍの塩類を含有する溶液、好ましくは６ｘＳＳＣ、または匹敵するイオン強度をもつ他のいずれかの溶液中において洗浄するハイブリダイゼーション条件を表わす。これらの条件により、最高５０％の配列同一性をもつ配列を検出できる。当業者は、５０％〜９０％の異なる同一性をもつ配列を同定するためにこれらのハイブリダイゼーション条件を改変することができるであろう。

本発明は、本明細書に開示する核酸配列（またはその抗原性ペプチドおよび／またはポリペプチドをコードする部分）を含有および発現する種々のタイプの組換えベクターおよび／または発現をも提供する。そのような組換えベクターおよび／または発現系の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない；種々の細菌（たとえば大腸菌（Escherichia coli））またはプロバイオティック（probiotic）ベースの（たとえば乳酸菌（Lactobacillus））発現ベクター；アデノウイルスベクター、バキュロウイルス、ピチア属（Pichia）および酵母発現系など。そのような組換えベクターおよび／または発現系を、たとえばワクチン製剤中に、あるいは他の目的、たとえば前記配列の実験室操作、または研究もしくは診断の目的で、利用できる。

本発明は、イヌパルボウイルスに対する免疫原性および／またはワクチン組成物を提供する。これらの組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４および５のうち１以上の核酸配列、またはこれらの配列の抗原性ペプチドまたはポリペプチド（抗原性領域）をコードする部分、たとえばこれらの配列の位置４２６、４３０、４３１、４４０、４９４、５５５および５７２に対するコドンのうち１以上を含む部分を含有する。好ましくは、少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む配列、またはその抗原性領域をコードする部分を含有するであろう。

計画した用途に従ってワクチン組成を変更しうることも当業者には認識されるであろう。言い換えると、特別に設計したワクチン製剤を作製するために、ワクチン中に含有される特定の成分（変異株）を幾つかのパラメーターに従って変更することができる。たとえば、特定の地域に検出された変異株のみを含有するようにワクチンを設計することができる。たとえば、２ａ変異株は米国ではもはや検出されないので、ワクチン製造業者はこの変異株を米国で用いるためのワクチン製剤には含有させないように選択できる。米国のワクチンには、たとえばＣＰＶ ２ｃおよびＣＰＶ ２ｂ変異株のみを含有させることができる。これに対し、現在、オーストラリアでは２ａが唯一のＣＰＶ変異株である。したがって、オーストラリアで用いる予定のワクチン組成物は、２ａ変異株のみを含有することができる。欧州用に推奨されるワクチンはたとえば２ｃおよび２ｂ変異株を含有しうるが、アジア用のワクチン組成物は２ａおよび２ｂを含有することができる。地域に合わせたそのようなワクチンはすべて本発明に含まれ、変異株分布のパターンが変化するのに伴って経時的に変更することができる。そのような地域特異的ワクチンについてさらに考慮すべきことは、改変した生ウイルスワクチンが多量のワクチンウイルス抗原を含有することである。したがって、ある変異株をワクチン接種したイヌをその変異株が存在しない地域へ移す場合、その動物を新しい環境に放す前に少なくとも約１カ月間は隔離しておくことが好ましい。さもなければその変異株が新しい場所へ放出される可能性がある。たとえば、２ｃ変異株をワクチン接種したイヌは、たとえばオーストラリアで放す前に隔離しておくべきである。１カ月後にはウイルスの放出は止むはずである。放出されたウイルスが弱毒化されていたとしても、それの存在がウイルス疫学をモニターする試みを混乱させる可能性があり、また原住ウイルスが放出されたウイルスと組換えられる機会をもたらし、その結果、より病毒性の高い変異が地域集団に導入される可能性がある。

さらに、ワクチン組成物を特定の宿主用に合わせることができる。たとえば、ある品種のイヌはある変異株に対して他より感受性である可能性があり；あるいは、動物のライフステージ（たとえば子犬−対−成犬）がその動物を１種類以上の変異株に対して感受性素因にする可能性があり；あるいは、イヌ以外の宿主（たとえば野生動物、動物園または禁漁区の動物など）にワクチン接種する場合には、ワクチンを投与する特定の宿主動物の感受性を考慮に入れてワクチン組成を調整することができる。たとえば、攻撃モデルを開発する際、チワワおよびラブラドル・レトリーバー品種はＣＰＶに対してより感受性の傾向がある。よって、対照付き設定で高病毒性ＣＰＶ−２ｃ変異株は約４ｌｏｇで下痢および嘔吐を誘発するのに十分なはずである。そのような宿主特異的または宿主選択的ワクチンがすべて本発明に含まれる。

他の態様においては、ワクチンレシピエントの居所環境に従ってワクチン組成を調整することができる。たとえば、１００匹以上のイヌを収容した接触感染リスクの高い商業的犬舎では、変異株２ｂ△４３１△４９４△５７２を主および副両方のアメリカＣＰＶ ２ｃ変異株と合わせて含有する比較的高価な製剤のワクチン接種が好ましいであろう。しかし、被曝のリスクがより低い、より小さな犬舎（たとえば２５匹未満のイヌを収容したもの）または１匹もしくは数匹のみのイヌをもつ家庭では、２ｂ△４３１△４９４△５７２または２ｂ△４９４△５７２を主アメリカ２ｃ変異株のみと一緒に含有する、より安価なワクチンで十分な可能性がある。どのワクチン組成物を使用するかを決定する際には、動物がその疾患に罹患するリスクを、経費、ならびにＣＰＶ変異株の存在を将来において分子的にモニターおよび評価する能力と対比すべきである。

さらに他の面で本発明は、子犬におけるワクチン免疫誘導に伴う母体抗体干渉を避けるためのワクチン接種方式を提供する。成体と子犬に単一のワクチン製剤を用いるのではなく、子犬には抗原性の異なる一連のワクチンを接種することができる。言い換えると、子犬の初回ワクチンは母親に投与したものと異なると思われる変異株を含有し、子犬の後続の追加免疫分はさらに他の型のワクチンを含む。この方法で、広範囲の抗体を漸増構築することができる。非経口免疫化後のウイルス放出など、あるワクチン接種の制限を克服するためには、ワクチン接種経路を改変することができる。たとえば、無針法を用いる舌上ワクチン接種経路によれば、免疫を誘導することができるが糞便中への放出は阻止できる。

ＣＰＶに対するワクチン接種に適切なワクチンを作製する幾つかの方法が当技術分野で知られている。たとえば米国特許第４，１９３，９９０号および第４，１９３，９９１号（Ａｐｐｅｌら）、米国特許第４，３０３，６４５号（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら）、米国特許第４，９７１，７９３号（Ｗｏｏｄら）、米国特許第５，８８２，６５２号（Ｖａｌｄｅｓら）および米国特許第５，８８５，５８５号（Ｐａｒｒｉｓｈら）を参照；これらはそれぞれ適切なワクチン配合方式の変法を提供する。これらの特許それぞれの内容全体を本明細書に援用する。一般に、ワクチンを製造するためには、前記の核酸配列を含むウイルスベクター（たとえば、ウイルス内にある天然のｓｓＤＮＡ、または非天然ウイルスベクター内へ遺伝子工学的に導入したｓｓＤＮＡもしくはこれと均等な形態（たとえばｄｓＤＮＡ、ｓｓまたはｄｓＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドなど）が用いられるであろう。その例は、それを投与した動物において重篤な病状を生じないように”死滅させた”、不活性化した、または他の方法で弱毒化したＣＰＶ（または他の）ウイルスを、適切な生理的キャリヤーと共に含有する。投与の結果として病状が起きないことが好ましいであろう。しかし、多くの有効なワクチン組成物が投与時または投与後に若干の不快感または比較的軽症の窮迫を生じることは当業者には認識されるであろう。しかし、本格的な疾患に対して防御されることの有益性はこの可能性よりはるかに勝る。別法としては、ワクチン接種される動物に自然界では感染しないかまたは普通は疾患を生じないヘテロタイプのウイルスを使用できる。

弱毒ウイルスは自然に前記の核酸配列（１以上）を含むＣＰＶであってもよく、あるいはウイルス（ＣＰＶまたは他のウイルス）は前記の核酸配列を遺伝子工学によりウイルスに挿入したという点で組換え体であってもよい。組換えワクチンの場合、核酸配列をＣＰＶ以外のウイルスに取り込ませてヘテロタイプの組換えワクチンを形成することができる。そのようなウイルスの例には、ＦＰＶ、種々のヘルペスウイルス、非病原性”オーファンウイルス”、腸内ウイルス、たとえばエンテロウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、ウイルスは生きた、弱毒化した（改変した）高力価ＣＰＶであり、核酸はｓｓＤＮＡである。

好ましくは、そのような製剤は他のＣＰＶ変異株、たとえば２、２ａ、２ｂおよび／または２ｃ変異株、ならびに今後同定されて有用とみなされる可能性のある他のいずれかのＣＰＶ変異株の抗原性領域をコードする核酸配列をも含有するであろう。しかし、２ａおよび２ｂ変異株のみを含有するワクチン組成物が広く販売されているので、これら既知の２ａ−２ｂワクチンと組み合わせてその効果を補足するのに用いるために、本明細書に開示する変異株のうち１以上のみを含有するワクチン組成物を製造するのも有益な可能性がある。さらに、そのようなワクチンは、他の病原体に対するワクチンと共に、別個の組成物として、または一緒に単一組成物中で投与することができる。

ワクチンの厳密な形態は多様であってよい。１態様において、ワクチンは本明細書に開示する核酸配列を含む弱毒ＣＰＶウイルスからなる。好ましくは、ワクチンは多価であり、弱毒化したＣＰＶ ２、２ａ、２ｂおよび／または２ｃ型のウイルスをも含有する。あるいは、単一ウイルスを遺伝子工学的に処理して、２以上の型の変異株に由来するタンパク質（たとえばＶＰ２タンパク質、またはその抗原性部分）をコードする核酸を含有させることができる；すなわち、当業者に既知のとおり、組換え技術で２種類以上のＣＰＶに由来するＤＮＡ領域を入れ換えることにより、ＶＰ２の２以上の領域に由来するゲノム領域をもつ組換えキメラＣＰＶを構築することができる。

他の形態のワクチンも考慮される。たとえば、”空の”ウイルス粒子ワクチン（核酸を含まない）も考慮され、抗原性ウイルス粒子または他のＣＰＶタンパク質であってキャプシドに組み立てられていないものを含むワクチンも考慮される。これらの場合、ワクチン製剤中のタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、または両方によってコードされ、あるいはより短い抗原性領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の一部によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によりコードされるタンパク質、ならびに／あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の一部によりコードされる抗原性領域を含有することもできる。

他の適切なワクチン成分、たとえば薬理学的に許容できるキャリヤーは当業者に周知であり、ワクチンとして使用するためのそのような組成物の調製法も周知である。一般に、そのような組成物は液剤または懸濁液剤として調製されるが、固体剤形、たとえば錠剤、丸剤、散剤なども考慮される。投与前に液体に溶解または懸濁するのに適切な固体剤形も調製される。その製剤を乳化することもできる。有効成分を、医薬的に許容できかつ有効成分と適合性である賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、たとえば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またはその組合わせである。さらに、組成物は少量の補助物質、たとえば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含有することができる。経口剤形の組成物を投与することが望ましい場合、種々の増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤などを添加することができる。本発明の組成物は、投与に適切な形態の組成物が得られるように、そのような追加成分のいずれかを含有することができる。製剤中の翻訳可能な核酸の最終量は多様であってよい。しかし、一般にその量は約１〜９９％であろう。組成物はさらに佐剤を含有することができ、その適切な例にはＳｅｐｐｉｃ、Ｑｕｉｌ Ａ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌなどが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の免疫原性／ワクチン製剤は、当業者に周知である多数の適切な手段のいずれかで投与でき、これには注射、経口、鼻内、抗原を含有する食品の摂取などが含まれるが、これらに限定されない。しかし、好ましい態様において、投与様式は注射によるものである。さらに、本発明組成物を単独で投与するか、あるいは他の医薬または免疫原組成物と組み合わせて、たとえば多成分ワクチンの一部として投与することができる。さらに、投与は一回投与であってもよく、あるいは免疫応答を増強するために複数の追加免疫量を種々の時間間隔で投与することができる。さらに投与は、予防的なもの、すなわちウイルス被曝が起きる前もしくは起きると推測される前、またはその事実の後、すなわち被曝が分かった後もしくは疑われた後であってもよく、あるいは治療的なもの、たとえばウイルス感染に関連する病状が起きた後であってもよい。

本発明の製剤を投与すると、ワクチンを投与した宿主動物内で本発明の核酸配列が発現し、宿主動物はその核酸配列がコードする抗原性タンパク質（またはその一部）に対する免疫応答を装備する。好ましくは、誘発された免疫応答は防御免疫応答である。ある態様において弱毒ウイルスは宿主内で複製する能力を保持しているが、厳密にはこれは必要ない。

本発明は、その必要がある哺乳動物においてＣＰＶ感染症の症状を予防する方法を提供する。一般に、ＣＰＶワクチンは子犬および／または成犬に有効免疫を付与するために投与される。この方法は、下記のものを含む免疫原性および／またはワクチン組成物を哺乳動物に投与することを伴う：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のうち少なくとも１つにより表わされる配列またはそのＶＰ２の抗原性領域をコードする部分を含む核酸、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のうち１以上により表わされる配列またはそのＶＰ２の抗原性領域をコードする部分。好ましい態様において、製剤は他の臨床関連ＣＰＶ変異株、好ましくは２ａおよび２ｂ変異株、ならびに場合により起源ＣＰＶ２をコードする核酸をも含有する。本発明組成物を投与すると、レシピエントによる免疫応答が誘発される。好ましくは、免疫応答は将来のＣＰＶ被曝に対する予防的なものであり、病状を完全に排除するか、あるいはワクチン接種しない場合に経験するより軽度なレベルにまで病状を改善する。

本発明の好ましい態様において、本発明のワクチンを用いてワクチン接種した動物は、成犬および子犬の両方を含む家畜化されたイヌである。しかし、可能性のある他のＣＰＶ宿主も考慮される。可能性のある他の宿主には、他のイヌ科動物、たとえば野生のイヌ科動物（たとえばオオカミ、野生種のイヌなど）、ネコ（家畜化されたネコおよび子猫、ならびに大型種のネコであって家畜化されたものまたは野生のものを含む）、ミンク、レッドパンダ、キツネ、ライオンおよびトラなどが含まれる。本発明のワクチンはもちろん家畜に用いられるであろうが、野生動物または部分的に家畜化された動物、たとえば動物園または保護区、公園、研究施設などの動物もそのようなワクチン接種により恩恵を受けることができる。ＣＰＶおよびＣＰＶ変異株の宿主となる可能性のある動物はいずれも、そのウイルスが宿主に病状を引き起こすか否かに関係なく、本明細書に提示するワクチン製剤の接種により恩恵を受けることができる。ウイルスが感染した際に無症候性である動物（すなわち無症状キャリア）のワクチン接種は、そのウイルスがより感受性の集団に拡散するのを縮小するために有益であろう。

本発明は、２ｂ△４９４△５７２、２ｂ△４３１、２ｃ△４４０および／またはアメリカ２ｃ型の変異株ＣＰＶのタンパク質の抗原決定基または抗原性領域に特異的または選択的に結合する抗体をも提供する。そのようなディファレンシャル抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよいが、モノクローナル抗体が一般に好ましい。モノクローナル抗体は、変異株を（タンパク質、またはそれらのタンパク質をコードする核酸の形で）マウスに注射することにより産生される。３回の追加免疫後、脾臓を採集し、骨髄腫細胞と融合させる。モノクローナル抗体を産生するクローンを、ＥＬＩＳＡ、ＨＡ−ＨＩ、および間接蛍光抗体検査法によりスクリーニングする。２ｂ△４９４△５７２、２ｂ△４３１、２ｃ△４４０および／またはアメリカ２ｃ遺伝子型と反応するクローンを、ＣＰＶ診断アッセイ法の開発のために保存する。ポリクローナル抗体は、２ｂ△４９４△５７２、２ｂ△４３１、２ｃ△４４０および／またはアメリカ２ｃ変異株の好ましい抗原性標的であるアミノ酸コドンを含む１種類以上のペプチドを、たとえばウサギに注射することにより産生させることができる。

本発明は、本明細書に記載するＣＰＶ変異株および場合により他のＣＰＶ変異株（たとえばＣＰＶ ２、２ａおよび２ｂ）を検出するための診断キットをも提供する。そのようなキットは、本明細書に開示する核酸配列の増幅（たとえばポリメラーゼ連鎖反応による）に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを含む。あるいは、そのようなキットは、前記の変異株および場合により他のＣＰＶ変異株（たとえばＣＰＶ ２、２ａおよび２ｂ）が提示するユニーク抗原決定基に選択的または特異的に結合する抗体（たとえばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を含むこともできる。

本発明の他の観点においては、ＣＰＶをインビトロで培養するための新規方法を提供する。この方法は、１）ＣＰＶによる感染に感受性であることが知られている細胞と２）ベロ細胞との混合細胞培養において、適切な培地でウイルスを培養することを伴う。好ましい態様において、ＣＰＶ感染に感受性である細胞はＣＲＦＫ細胞である。しかし、他のタイプのそのような細胞も使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Ａ７２イヌ線維腫由来の細胞；ＣＲＦＫ細胞に由来する細胞、たとえばＮｏｒｄｉｓｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙネコ腎（ＮＬＦＫ）細胞；ネコの舌細胞、たとえばＦｅ３Ｔｇ細胞；ネコの肺細胞、たとえばＡＫ−Ｄ細胞；ネコのリンパ腫細胞系、たとえば３２０１；イヌのＴ−細胞系、たとえばＣＴ ４５−Ｓ；イヌの胸腺上皮細胞系、たとえばＣｆ２Ｔｈなど。さらに、ネコおよびイヌの多様な細胞系、ならびにそれらの培養に関する指示を、バージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できる。

これらの細胞系をベロ細胞と一緒に、当業者に既知の多様な培地中で増殖させることができる。たとえば、ＣＴ ４５−Ｓ細胞はＲＰＭＩ １６４０培地で培養できる；ＡＫ−Ｄ、Ｆｅ２１ｕおよびＣｆ２Ｔｈｓ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコの最少必須培地（ＭＥＭ）で培養できる；３２０１、ＮＬＦＫ、ＣＲＦＬ、Ａ７２およびＦｃ３ Ｔｇ細胞には、ＭｃＣｏｙの５ＡおよびＬｅｉｂｏｗｉｔｚ Ｌｌ ５（５％のＦＣＳを含む）を使用できる。一般に、これらの細胞系を一緒に３７℃で４〜５日間インキュベートする。

概説
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）感染症はイヌの最も重篤かつ優勢な疾患であり、子犬の下痢の最も一般的な原因である。ＣＰＶに対するワクチンがあり、広く用いられているが、ワクチン接種したイヌにＣＰＶの大発生が最近幾つか起きた。たとえば米国中南部の犬舎所有者らは、ワクチン接種したにもかかわらずＣＰＶ感染症による子犬の死亡率が高いことを観察で認めている。

ＣＰＶは一本鎖ＤＮＡウイルスであり、高い変異率をもち、その宿主範囲および指向性を変化させる能力をもつ。現在入手できる市販ワクチンは一般にＣＰＶ２、ＣＰＶ２ａおよびＣＰＶ２ｂ変異株のみを含有する。ＣＰＶワクチン接種したパルボウイルス感染症の顕性症状を伴うイヌからの試料を本発明者らが分析していた際に、現在のＣＰＶ診断試験によるＣＰＶ検出に機能変化がみられ、現在のキットは現場ウイルスを検出できないことが認められた；これは、ＣＰＶが２ａおよび２ｂサブタイプからさらに進化している可能性を指摘する。その後の調査でＣＰＶの２つの変異株、すなわち、２ｂ△４９４△５７２およびアメリカ２ｃが同定された。これらの分離株は、これまでに培養されたＣＰＶ分離株より増強した病毒性および広い組織指向性を伴う。さらに、これらの新たなＣＰＶ分離株は従来のＣＰＶ−２遺伝子型により起きる出血性下痢ではなく黄色粘性下痢を引き起こすと思われる。他の報文と一致して、２ｂ△４９４△５７２変異株は２つのコドン変化をもつ。アメリカ２ｃ変異株はこれまでにイタリア、スペインおよびベトナムで検出されているが、米国ではこれまで検出されていない。

材料および方法
糞便試料はオクラホマ動物診断研究所（Oklahoma Animal Disease Diagnostic Laboratory）がＦｅｄｅｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓによりアイスパック（約４〜５℃）で受け取った。最低２〜５ｇの糞便または２〜５ｍｌの液状下痢便を受け取った。糞便試料を一般に同日に、市販のＣＰＶ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により検査した。本発明者らは、腸管の異なる領域からの腸ループ（約２〜３片）を蛍光抗体検査（ＦＡＴ）または免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）用に受け取っている。時には、本発明者らはＣＰＶ検査のためのＦＡＴもしくはＩＨＣまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用として数片の舌を受け取った。これらの検体はＦｅｄＥｘによるアイスパック冷却状態で受け取られる。多くのＣＰＶ症例が現場診断キット（Ａｓｓｕｒｅ，Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ，カリフォルニア州；またはＩＤＥＸＸ，メイン州バーハーバー）によりＣＰＶについて陰性という検査歴をもつ。

ＣＰＶ適合病歴をもつ子犬および成犬の腸について組織病理学的検査を実施した。この病歴には、血性もしくは粘性の下痢、および死亡が含まれていた。新鮮な腸組織およびホルマリン固定した腸組織をＣＰＶに適合する病変について検査した：陰窩の拡張および壊死、ならびに腸絨毛喪失。

蛍光抗体検査（ＦＡＴ）を用いて腸をＣＰＶ抗原についてスクリーニングした。厚さ６〜８マイクロメートルの腸切片をアセトンで固定し、風乾した。ＦＩＴＣで標識した抗ＣＰＶコンジュゲートを添加し、切片を３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、切片をトリパンブルーで対比染色した。切片を蛍光顕微鏡検査により調べた：ＦＡＴ検査で、ＣＰＶ陽性細胞は青りんご色に着色し、ＣＰＶ陰性細胞は赤れんが色に着色する。

組織病理学的検査用に提供されたホルマリン固定切片を、免疫組織化学的検査によりＣＰＶ抗原について調べた。
糞便試料、およびＣＰＶ陽性またはその疑いのある腸試料の擦過標本につき、Desario et al., 2005の記載に従ってＰＣＲ、続いて配列決定を実施した。ウイルスタンパク質遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅させた。増幅したＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により検出し、配列決定のためにゲルから溶離した。

結果をＧｅｎＢａｎｋに寄託された大量の配列コレクションと比較するＢＬＡＳＴプログラムにより、配列を分析した。配列はすべてイヌパルボウイルスと類似すると同定された。

実施例１．現在のＣＰＶ診断試験の欠点
前記に従って糞便試料を分析して、すべての試料が標準的な基準によれば陽性であった：組織病理学的検査により判定した特徴的な病変、蛍光抗体検査の結果、および免疫組織化学的検査の結果。ところが、同一試料を市販の診断試験により検査したところ、その結果はそれらの検査法がこれらの試料のＣＰＶ現場診断について信頼性がなく、ＣＰＶ陽性症例の３３〜５０％を検出できないことを示した。

これらのＣＰＶ分離株の大部分は、市販のＣＰＶワクチンをそのワクチンのラベルに従って現在用いているけれどもなおＣＰＶの大発生および死亡を経験している犬舎から入手された。この防御欠如は、新たに出現したＣＰＶ分離株における抗原性の変異に帰因すると思われる。多数のＣＰＶ症例（ｎは約５００）にわたるこの疫学的な現場所見は、これらの新たなＣＰＶ変異株を市販のＣＰＶワクチンに組み込む必要性を示している。

実施例２．ＣＰＶ分離株の配列決定：２ｂ△４９４△５７２変異株およびアメリカＣＰＶ２ｃ分離株の同定
ワクチンおよび診断キットの欠陥は、一般にウイルス進化の疫学的証拠であるとみなされる。したがって、被験試料中に新たなＣＰＶ変異株が存在することが疑われた。これを確認するために、糞便試料から分離したウイルスについてウイルスタンパク質ＶＰ２の一部のＰＣＲ配列決定を実施し、コンピューターソフトウェアプログラムおよび／または手動アラインメントを用いて結果を既知のＶＰ２配列と比較した。

それらの結果により、２種類の新たに出現したＣＰＶ型が試料中に存在することが確認された：１）２ｂの変異株、これを２ｂ△４９４△５７２と命名した；および２）アメリカ２ｃ、これはこれまで米国では報告されていなかった。これら２変異株のＶＰ２タンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列を図１（２ｂ△４９４△５７２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）および図３（アメリカ２ｃ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示す。これらの配列を既知のＣＰＶ ２基準配列と比較することにより、２ｂ△４９４△５７２ではコドン４９４および５７２の変化が起きたことが明らかになった。通常のＣＰＶ２の４９４におけるコドンはＴＧＴであるが、２ｂ△４９４△５７２ではコドン４９４はＴＧＣである。同様に、ＣＰＶ２分離株の位置５７２における通常のコドンはＧＴＡであるが、２ｂ△４９４△５７２ではこのコドンがＧＴＣである。これらの変化によりＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列の変化は生じない。しかし、これらの変化は、そのライフサイクルの１以上の段階で、たとえば複製、転写または翻訳効率において、２ｂ△４９４△５７２変異株に利点をもたらすと思われる。重要なことに、これらの試料中にアメリカ２ｃ変異株が存在したことが米国でのこのＣＰＶ変異株の最初の報告であり、それが優性変異株として出現する前兆であると思われる。ワクチン欠陥の症例のうち約５０％がＣＰＶ２ｂ△４９４△５７２の存在に帰因し、５０％はＣＰＶ２ｃまたはＣＰＶ２ｃ△４３０△４４０が原因であった。

これらの所見は、優性ＣＰＶ変異株としての２ｂ△４９４△５７２およびアメリカ２ｃの出現を証明し、これらの変異株をＣＰＶワクチン製剤に組み込むことの必要性を示している。

同様な方法で他の変異株を同定した。
実施例３．変異株の二次構造および関連エネルギーの決定
ウイルス病原体の病毒性はウイルスゲノムの二次構造要素に関連することが知られている(Pellerin et al., 1994. Virology 203: 260-268)。変異株２ｃ、２ｂ△４３１および２ｃ△４３０△４４０の超可変部のフォールディングパターンを、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上のmfold.burnet.edu.auにあるウェブサイトの”ｍｆｏｌｄ”ＤＮＡフォールディングプログラムにより評価した。結果を図６〜８に示す；これらは変異株それぞれのフォールディングパターンおよび関連のエネルギーレベルを表わす。これから分かるように、その領域の二次構造は維持されており、アンフォールディングのためのエネルギーレベルが変化している可能性がある。

実施例４．ＣＰＶに対する新規な多価ワクチンの開発および試験
新たに出現したＣＰＶ変異株に対して防御性のある新規な多価ワクチンを開発する。このワクチンは、ＣＰＶ２ａ、２ｂ△４９４△５７２、２ｂ△４３１、アメリカ２ｃ、２ｃ△４４０、および場合によりＣＰＶ２型のうち１種類以上の弱毒ＣＰＶウイルスを含有する。言い換えると、この新規ワクチンでは、ＣＰＶ２ｂが、２ｂ△４９４△５７２、すなわち優性遺伝子型として出現しつつあることが新たに見いだされた変異株で置き換えられている。もはや脅威ではないと思われるＣＰＶ２の存在は任意である。

この多価ワクチンを接種した動物は、ワクチンの製造に用いた変異株によるパルボウイルス感染症の発症に対して防御される。
実施例５．ＣＰＶ増殖のための新規な混合細胞培養法
ＣＰＶは一般に、単一タイプの細胞、たとえばクランダルネコ腎（ＣＲＦＫ）細胞系のみを含む細胞培養において増殖されている。

改良されたＣＰＶ培養法を開発した。この新規方法によれば、ＣＰＶをＣＲＦＫ細胞とベロ細胞の等量混合物中において最少必須培地（ＭＥＭ）で培養する。両細胞系を平板培養し、平板培養の１時間後に試料を播種する。この段階で細胞は定着しているが、なお細胞分裂の初期にある。この新規な細胞培養法により、ＣＰＶをＣＲＦＫ細胞のみと共に培養した場合より急速に、検出可能な細胞障害作用が生じた。さらに、混合細胞培養では高力価のＣＰＶ産生が３継代の間維持された。

本発明をその好ましい態様に関して記載したが、本発明を特許請求の範囲の精神および範囲内で改変して実施しうることは当業者に認識されるであろう。したがって、本発明は前記の態様に限定されるべきではなく、本明細書に提示する記載の精神および範囲内のそのすべての改変および均等物をさらに含むべきである。本明細書に引用したすべての米国特許、特許出願、および他の参考文献を本明細書に援用する。

参考文献

Claims (11)

1. イヌ科用免疫原性組成物であって、ＶＰ−２型タンパク質を有するパルボウイルス・ウイルス粒子を含み、該パルボウイルス・ウイルス粒子は核酸を含み、該核酸は、以下：
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；
   ＣＴＧによりコードされるアミノ酸４３１を含む該ＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の部分；
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４；および、
   ＧＣＡによりコードされるアミノ酸４４０、および、ＧＡＡによりコードされるアミノ酸４２６を含む該ＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の部分；
   からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、前記免疫原性組成物。
2. さらに、以下：
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；
   ＴＧＣによりコードされるアミノ酸４９４、および、ＧＴＣによりコードされるアミノ酸５７２を含むＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の部分；
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；
   ＴＴＧによりコードされるアミノ酸４３０、および、ＡＣＡによりコードされるアミノ酸４４０を含むＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の部分；および、
   ＶＰ−２ｂ型タンパク質をコードする配列；
   からなる群より選択される核酸配列を含むパルボウイルス・ウイルス粒子を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. パルボウイルス・ウイルス粒子が弱毒化されている、請求項２に記載の免疫原性組成物。
4. パルボウイルス・ウイルス粒子が弱毒化されている、請求項１に記載の免疫原性組成物。
5. 家畜化された成犬および子犬、野生のイヌ科動物、オオカミ、野生のイヌ、家畜化されたネコおよび子猫、野生のネコ、ミンク、レッドパンダ、キツネ、ライオン、トラ、動物園または保護区内の動物、並びに、研究施設内の動物におけるパルボウイルスを検出するための診断用キットであって、
   家畜化された成犬および子犬、野生のイヌ科動物、オオカミ、野生のイヌ、家畜化されたネコおよび子猫、野生のネコ、ミンク、レッドパンダ、キツネ、ライオン、トラ、動物園または保護区内の動物、並びに、研究施設内の動物において、以下の：
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；
   ＣＴＧによりコードされるアミノ酸４３１を含む該ＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の部分；
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４；および、
   ＧＣＡによりコードされるアミノ酸４４０、および、ＧＡＡによりコードされるアミノ酸４２６を含む該ＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の部分；
   からなる群から選択される核酸配列を特異的に検出するハイブリダイズ可能な核酸を含む、前記診断用キット。
6. 該ハイブリダイズ可能な核酸が、オリゴヌクレオチドプライマーである、請求項５に記載の診断用キット。
7. さらに、以下：
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；
   ＴＧＣによりコードされるアミノ酸４９４、および、ＧＴＣによりコードされるアミノ酸５７２を含むＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の部分；
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；および
   ＴＴＧによりコードされるアミノ酸４３０、および、ＡＣＡによりコードされるアミノ酸４４０を含むＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の部分
   からなる群から選択される核酸配列を特異的に検出するハイブリダイズ可能な核酸を含む、請求項５又は６に記載の診断用キット。
8. 家畜化された成犬および子犬、野生のイヌ科動物、オオカミ、野生のイヌ、家畜化されたネコおよび子猫、野生のネコ、ミンク、レッドパンダ、キツネ、ライオン、トラ、動物園または保護区内の動物、並びに、研究施設内の動物におけるパルボウイルスを検出するための診断用キットであって、
   家畜化された成犬および子犬、野生のイヌ科動物、オオカミ、野生のイヌ、家畜化されたネコおよび子猫、野生のネコ、ミンク、レッドパンダ、キツネ、ライオン、トラ、動物園または保護区内の動物、並びに、研究施設内の動物において、位置４４０がアラニンである２ｃ型 ＶＰ−２タンパク質、又は、位置４４０のアラニンを含む２ｃ型 ＶＰ−２タンパク質の部分、を検出するのに特異的な抗体を含む、前記診断用キット。
9. 該２ｃ型 ＶＰ−２タンパク質又は該２ｃ型 ＶＰ−２タンパク質の部分が、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４；または
   位置４４０のアラニンを含む、該ＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の部分
   の核酸配列によってコードされる、請求項８に記載の診断用キット。
10. 該抗体がモノクローナル抗体である、請求項８または９に記載の診断用キット。
11. さらに、以下：
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；
    ＴＧＣによりコードされるアミノ酸４９４、および、ＧＴＣによりコードされるアミノ酸５７２を含むＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の部分；
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；
    ＴＴＧによりコードされるアミノ酸４３０、および、ＡＣＡによりコードされるアミノ酸４４０を含むＶＰ−２タンパク質の抗原性領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の部分；および
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；
    からなる群から選択される、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を検出するのに特異的な抗体を含む、請求項８−１０のいずれか１項に記載の診断用キット。

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