CN101815528A - 包含犬细小病毒遗传性变体的疫苗 - Google Patents

Abstract

提供了犬细小病毒疫苗和诊断以及其使用方法。所述疫苗有效抗新出现的占优势的犬细小病毒变体。

Description

包含犬细小病毒遗传性变体的疫苗

序列表

本申请包括2008年6月12日创建的伴随文本文件“Sequence.txt”的完整内容作为序列表，所述文本文件包含3,780字节，在此通过引用并入本文。

说明书

发明背景

发明领域

总的来说，本发明涉及改善的犬细小病毒(CPV)疫苗制剂和诊断测试。特别地，本发明提供了改善的CPV疫苗制剂和诊断测试，其包括在犬群体中目前循环的新出现的占优势CPV变体。

发明背景

犬细小病毒(CPV)主要是感染犬特别是幼年犬的肠病原体。细小病毒感染的特征在于超过4-5周龄的犬和幼犬中的急性腹泻、发热和白细胞减少症，以及更年幼的幼犬中的心肌病。来自未接种犬的疾病死亡率极高。尽管针对CPV的疫苗是可获得的，但CPV是单链RNA病毒且具有极度的突变能力，所以病毒显示在抗原上改变的显著能力，并且从而逃避由疫苗提供的免疫保护。因此，抗原型和致病剂的基因型的持续监控是必要的。

CPV首先在1978年分离，并且命名为“CPV-2”，以使其与细小病毒-犬细小病毒(CMV或CPV-I)区分。CPV-2一般被认为是猫传染性粒细胞缺乏症病毒(FPV)或貂肠病毒(MEV)的遗传性变体，并且在遗传和抗原上与感染貂、狐狸、浣熊和其他肉食动物的细小病毒非常紧密相关。CPV衣壳包含仅具有两个可读框的约5200个碱基的单链DNA基因组，但由于可变mRNA剪接而编码至少4种蛋白质。细小病毒衣壳由两种病毒蛋白质(VP)——VP1和VP2组成，其中VP2是主要免疫原性细小病毒衣壳蛋白质。原始CPV分离物的遗传性变体在1979-1980年鉴定，并且命名为CPV 2a型。在二十世纪八十年代中期，鉴定了另一种变体，2b型，并且自那以后，2a和2b型看起来已完全取代原始CPV-2。目前疫苗仅针对2a和2b变体，尽管2a变体在美国已不再检测出。对于CPV发现和进化的综述，参见Parrish和Kawaoka，2005。

CPV-2b仅在两个氨基酸位置处不同于CPV-2a：2a中的Asn-426(由AAT编码)是2b中的Asp(由GAT编码)，并且2a中的Ile-555是2b中的Val。Ile-555至Val的改变实际上是至原始2型序列的逆转。CPV-2a和2b抗原型看起来在多年中是相对稳定的。然而，在2000年，描述了变体“2c”，其中位置426是由GAA编码的Glu(位置555仍是Val)。2c变体已在意大利(Buonavoglia等人，2001)、越南(Nakamura等人，2001)和其他国家包括西班牙(Nakamura等人，2004；Decaro等人，2006)得到报告，但到目前为止不存在2c变体在美国证实的报告，并且CPV疫苗仍未更新以包括此种变体。这是特别重要的，因为与主要感染幼犬的先前描述的变体不同，CPV2c具有感染成年犬的能力。此外，在位置494和572处具有密码子变异的2b变体序列在2003年提交给GenBank(gi：54646340)，并且由Shackelton等人在2005年报告(Proceedings National Academy Sciences 102：379-384)，但未基于此种序列提出在CPV疫苗或诊断组合物中的改变。

当疫苗未更新时，出现几个问题。首先，即使接种过的犬也可能对疫苗中未包括的CPV变体引起的感染易感。其次，当接种过的犬生病时，它们的主人经常声称疫苗中的病毒株引起疾病。这通常导致对物主支付赔偿，因为疫苗公司没有切实的途径来提供相反的证据。

已提出几种CPV疫苗制剂：

Appel等人的美国专利4,193,990和4,193,991分别描述了异型和灭活(“杀死的”)病毒疫苗，其中示例性疫苗提供抗原始CPV的保护。

Carmichael等人的美国专利4,303,645描述了包含由非肿瘤形成细胞系中病毒延长的连续传代产生的减毒CPV的疫苗。示例性疫苗还提供抗原始CPV分离物的保护。

Wood等人的美国专利4,971,793和Valdes等人的美国专利5,882,652都描述了重组亚单位疫苗，其包括在重组杆状病毒中产生的CPV VP-2蛋白质。VP-2蛋白质无特定类型或亚型。

Parrish等人的美国专利5,885,585描述了包含减毒形式的2b变体的CPV疫苗。

由于CPV病毒突变且发展新抗原性变体的能力，存在监控CPV变体的基因构成且开发反映目前CPV变体的疫苗和诊断测试的迫切需要。

发明概述

本发明提供了用于预防CPV感染的更新疫苗，以及用于检测新的和正在出现的CPV变体的诊断方法。疫苗和诊断方法基于先前未知和先前未被了解的CPV变体的发现，并且考虑先前疫苗制剂和诊断对于其不足够的突变形式病毒的出现。本发明的疫苗提供抗新出现形式的CPV的保护作用，并且诊断提供了检测新进化形式的病毒的能力，这两种能力先前都无法获得。特别地，一种新的罕见变体可用作疫苗中的“标记”变体。标记变体的使用使得能够进行以下法医学研究，即，用标记变体接种的动物中的疾病症状是由疫苗还是由另一株CPV病毒引起的。

新疫苗制剂包括具有单链DNA的完整减毒CPV，其具有一种或多种下述特征：

2bΔ494Δ572是包含至少一种下述改变的2b CPV变体：编码VP2蛋白质位置494的密码子是TGC而不是TGT，并且编码VP2蛋白质位置572的密码子是GTC而不是GTA。这些改变不导致氨基酸改变(TGC和TGT都编码半胱氨酸，并且GTC和GTA都编码缬氨酸)。然而，这种变体在先前已用常规、目前可获得的疫苗接种过的动物中引起疾病，并且应掺入新疫苗制剂。尽管先前已描述了在位置494和572处的改变，但它们未被理解。此外，这种美国分离物可能包含其他突变。

2bΔ431是新发现的罕见2b CPV变体(例如，2bΔ494Δ572的变体)，其中编码VP2蛋白质的位置431的密码子是CTG而不是CTA。尽管这个改变不导致氨基酸改变，但这种变体仍在接种过的动物中引起疾病，并且可以掺入新疫苗制剂内。明显地，由于它的缺乏，2bΔ431代表理想的疫苗“标记”序列。

美国(Amrican)(或美国(United States))2c是在美国分离的第一种2c变体，并且是占优势的(81％)2c变体。这种变体也称为“主要2c变体”。

2cΔ440是新发现的2c CPV变体，其中编码VP2蛋白质的位置440的密码子是GCA而不是ACA，这导致在这个位置处氨基酸序列从苏氨酸(ACA)到丙氨酸(GCA)的改变。这种变体引起接种过的动物中的疾病，并且应掺入新疫苗制剂内。这种变体目前是次要(19％)变体，并且在本文中也称为“次要2c变体”。

2cΔ430Δ440，即2cΔ440的进一步变体，除在位置440的密码子处包含GCA外，其也通过在位置430处具有由TTA而不是常见TTG编码的亮氨酸而由已知2c序列改变。

所有这些CPV变体通过聚合酶链反应(PCR)检测出，并且在来自受CPV感染的犬和/或其幼犬的细胞培养物中分离，所述犬已使用常规商业疫苗进行了抗CPV接种。因此，这些新出现变体能够在根据目前方案接种的犬中逃避免疫监督，无论变异导致(2cΔ440和部分2cΔ430Δ440)还是未导致(2bΔ494Δ572和2bΔ431)VP2蛋白质的氨基酸序列中在指示位置处的改变。此外，目前可获得的用于野外使用的诊断技术未检测出新CPV变体或不佳地反应，导致减少的敏感性。本发明通过提供考虑新变体的疫苗和诊断解决这些问题。

本发明进一步提供了繁殖犬细小病毒特别是本文描述的变体的方法，当在CRFK细胞中单独培养时，其不产生致细胞病变效应(CPE)或仅产生轻微CPE。该方法包括在合适培养基中在Crandall Reese猫肾(CRFK)细胞和Vero细胞的混合物中培养犬细小病毒的步骤。培养步骤在允许犬细小病毒繁殖至比CPV在单独的CRFK细胞中培养时获得的滴度更高的滴度的条件下执行。

本发明进一步提供了包括一种或多种CPV变体的细小病毒疫苗。一种或多种CPV变体的中和水平比选自CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c的一种或多种CPV变体的中和水平低至少4倍，如使用来自用包含CPV变体CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c中的一种或多种的疫苗接种的动物的血清测定的。在某些实施方案中，中和水平通过血清中和测定法进行测定，并且表示为中和滴度。

附图简述

图1。示例性2bΔ494Δ572序列(由SEQ ID NO：1表示的核酸序列)，其中位置494的密码子是TGC，并且位置572的密码子是GTC。显示了编码VP2蛋白质的氨基酸426至572的核酸序列。

图2。示例性2bΔ431序列(由SEQ ID NO：2表示的核酸序列)，其中位置431的密码子是CTG。显示了编码VP2蛋白质的氨基酸426至572的核酸序列。

图3。显示了编码主要的美国2c VP2蛋白质的氨基酸426至572的核酸序列(由SEQ ID NO：3表示的核酸序列)。

图4。示例性2bΔ440(次要的美国2c)序列(由SEQ ID NO：4表示的核酸序列)，其中位置440的密码子是GCA而不是ACA，编码丙氨酸而不是苏氨酸。显示了编码VP2蛋白质的氨基酸426至572的核酸序列。

图5。示例性2cΔ430Δ440序列(由SEQ ID NO：5表示的核酸序列)。

图6。与2c变体相关的推定折叠结构。

图7。与2bΔ431变体相关的推定折叠结构。

图8。与2cΔ430Δ440变体相关的推定折叠结构。

发明详述

发明实施方案

本发明提供了CPV疫苗和诊断，其组成包括反映CPV的进化趋势的新发现变体。每种变体从已针对CPV进行过接种的犬中分离，但然而，所述犬接触CPV且患病。因此，为了终止或减少CPV的传播，这些新变体可以掺入疫苗方案内。此外，如下文详细描述的，这些变体的鉴定已导致CPV基因组中的高变区的发现。

本文描述的变体的发现已导致CPV基因组的关键高变(HPV)区的鉴定。过去，仅位置1276至1277处的核苷酸视为是重要的。然而，本文描述的流行病学发现已显示关键HPV区实际上几乎包括在完整VP2基因的位置1275-1326的CPV基因组中间。这个HPV区包含至少两个关键高变区密码子，即VP2基因的密码子426和440。优选地，高变区包含在密码子426前1个核苷酸开始直到密码子440的区域。不受理论束缚，如下文更充分地讨论的，可能这个HPV区的生物学意义与由序列形成的结构的热动力学稳定性相关。

变体如下：

2bΔ494Δ572是2b CPV变体，其中VP2蛋白质的位置494处的密码子是TGC而不是TGT，并且VP2蛋白质的位置572的密码子是GTC而不是GTA。这些突变无一导致编码的氨基酸中的改变(在位置494处的Cys和在位置572处的Val)，并且这些序列先前已得到描述。然而，先前未了解如本文所描述，这些改变允许病毒在用目前现有疫苗接种的宿主中逃避免疫清除。这种变体在图1中描述，其中显示了编码氨基酸426至572的2b(即426＝GAT)VP2基因的部分。两个突变密码子(494和572)以粗体和下划线显示。

2)2bΔ431是罕见的2b CPV变体，其中包含编码位置431的密码子处从CTA到CTG的改变。原始2bΔ431分离物也包括2bΔ494Δ572突变，并且因此是2bΔ431Δ494Δ572。然而，本发明包含任何CPV序列(2a、2b或2c)，其包括编码VP2蛋白质的位置431的密码子处的CTG。这个突变不导致氨基酸改变(CTA和CTG都编码Leu)，但由于它的稀少，2bΔ431代表用于法医目的的理想的疫苗“标记”序列。本发明的这个方面在下文详细讨论。这种变体在图2中描述，其中显示了编码氨基酸426至572的2b(即426＝GAT)VP2基因的部分。3个突变密码子(431、494和572)以粗体和下划线显示。

3)美国2c是在美国分离的第一种2c变体。这种变体的显著出现先前未被了解(参见图3)。

4)2cΔ440是2c CPV变体，其中VP2蛋白质的位置440的密码子是GCA，而不是ACA。这个突变导致在位置440处从Thr到Ala的氨基酸改变。此外，这个突变体也从先前接种过然而仍然由CPV致病的犬中分离。因此，这种变体序列应掺入新CPV疫苗和诊断制剂内。这种变体在图4中描述，其中显示了编码氨基酸426至572的2c VP2基因(即426＝GAA)的部分。突变密码子(440)以粗体和下划线显示。密码子494和572是有下划线的用于参考。

2cΔ430Δ440，即2cΔ440的进一步变体，除在位置440的密码子处包含GCA外，其也通过在位置430处具有由TTA而不是常见TTG编码的亮氨酸由已知2c序列改变。这种变体在图5中描述。

表1提供了这些变体中的序列改变概括。

表1.与目前美国CPV变体中的VP2蛋白质的关键氨基酸相关的密码子。

*指示突变密码子

尽管先前已描述了在位置494和572处的改变，但这种变体的新出现优势和特征先前未被了解。本文描述的所有变体从犬(或其后代)中分离，所述犬已进行了抗CPV接种而仍然由于CPV而患病且死亡。尽管该变体首先在美国中南部鉴定，但它们被认为还负责在美国其他部分在犬中的疫苗抗性细小病毒疾病的散发报告。在除澳大利亚和非洲外的所有洲中先前检测出的变体2c目前已在14个州(Alabama、Arizona、Arkansas、California、Delaware、Florida、Illinois、Kansas、Jew Jersey、Missouri、Oregon、Oklahoma、South Carolina和Texas)中检测出。考虑先前已知的CPV变体的快速传播史，这些变体中的一种或多种应立即包括在遍及全世界的疫苗中，以便停止病毒的这些最近期重复的传播。此外，应重新制定CPV诊断测试和方法，以考虑这些新出现的变体。

如实施例部分中所述的，接种过的犬(本发明的CPV变体从其中分离)的疾病症状和死亡的发作非常快速，表明强逃避突变体的存在，其不由针对目前疫苗中包括的CPV类型的免疫系统应答制止。不仅对于引起VP蛋白质一级序列中的改变的2cΔ440是如此，而且对于不包含研究区域中的氨基酸改变的2cΔ431、2bΔ494Δ572也是如此。迄今仍未认识到2bΔ494Δ572密码子改变的重要性，并且就我们所知，迄今为止仍未如本文所描述的提出调整CPV疫苗和诊断的组成，以包括或考虑这些新出现的变体。此外，2cΔ440和2bΔ431是先前未描述的新突变体。

这些变异看起来提供病毒的生存优势。不受理论束缚，突变序列在病毒生命周期的某些阶段时给病毒体或DNA自身赋予优点是可能的(例如，抗宿主核酸酶的保护作用；更快速或更有效的转录和/或翻译，其可以例如导致不同模式的蛋白质折叠；更快速或更有效地包装成病毒体颗粒等)。例如，当DNA聚合酶复制CPV DNA时，突变体序列可以赋予解折叠动力学方面的优点。图6-8分别描述了CPV2c、CPV2bΔ431和CPV2cΔ430Δ440高变区的折叠结构，这在实施例3中进一步描述。

在本发明的一个实施方案中，成功的、新出现CPV变体例如CPV2cΔ430Δ440可以用作攻击病毒，以在实验条件下检查商业疫苗制剂的价值。最古老形式的CPV2a和CPV2b对犬不高度致病，并且更新的CPV2c仍未得到研究。因为缺乏高毒力攻击模型，迄今为止疫苗公司仍不能正确评估疫苗制剂对接种过的动物赋予保护的能力。因此，本发明还提供了用于达到这点的方法，这是通过使接种过的动物暴露于高毒力变体CPV2cΔ430Δ440，并且评估疫苗是否提供抗疾病保护。

对于本文描述的每种变体，本发明包括包含一种或多种变体的疫苗制剂和诊断，以及使用其的方法。优选地，此种制剂和诊断包括2cΔ440或2bΔ431或这两者。此种制剂和诊断可以进一步包括2bΔ494Δ572和/或美国2c，和/或其他已知CPV序列，例如目前疫苗中已包括的那些。此外，具有新序列特别是具有新氨基酸序列的其他新分离的病毒可能适合或不适合包括在新疫苗中。一般而言，包括新野外分离物的决定基于现有疫苗在接种过的动物中引发针对野外分离物的中和应答的能力，并且部分基于变体的流行。如果新变体是普遍存在的，那么应决定它的抗原意义。这点的一个测量是抗原距离。特定CPV分离物的总抗原距离可以通过使用功能测定法测试分离物进行测定，例如血清中和滴度和/或血细胞凝集测定法和/或间接荧光抗体测试。如果，根据一种或多种测定法，与疫苗中已存在的病毒变体比较，分离物显示弱中和(即，如果新的、异源分离物的中和水平比疫苗中已存在的变体的中和水平低4倍以上)，那么包括新分离物的新疫苗的开发可以得到保证。例如，当分离新CPV变体时，总抗原距离可以用血清中和测定法进行计算，并且结果表示为中和滴度。中和滴度是来自接种过的动物的血清的最高稀释度(在此稀释度下完成中和，这是通过缺乏致细胞病变效应(CPE)或病毒的存在而证明的)的倒数。例如，如果来自用现有CPV疫苗接种过的犬的血清用同源病毒给出1∶4000的SN滴度和用新的异源CPV分离物给出1∶200的滴度，那么新分离物应可能包括在CPV疫苗中。换言之，如果现有疫苗未提供抗不在现有疫苗中的常见、普遍存在的变体的保护作用，那么变体可以小心包括在新疫苗制剂中。如果分离物位于小地理区域中，那么定制或自生疫苗可能比设计用于普遍使用的商业疫苗更合适。结果还应该用攻击保护实验证实。在攻击保护实验中，动物进行接种，并且随后暴露于中等剂量(例如10,000 TCID 50，即中值组织培养感染剂量)用作攻击病毒的变体。如果疫苗提供抗变体的保护作用，那么变体无需包括在疫苗组合物中。然而，如果接种过的动物不能得到抗变体的保护作用，那么变体可以包括在疫苗制剂中。此外，在接种过程期间，并非所有毒株或变体都需要包括在相同注射中。可以优选例如在3周龄时给幼犬施用包含一种变体的注射，在7周时施用包含不同变体的注射，和在10周时施用包含另外一种变体的注射。这与目前实践相反，目前实践中对于所有3次幼犬注射施用相同变体。这种目前的操作具有以下缺陷，即反应于较早接种而发展的现有免疫会中和较晚接种中送递的进入中的CPV病毒，使得较晚接种具有很少的作用或没有作用。值得注意的是，众所周知某些病毒病原体可以感染多个物种。在CPV的情况下，猫和貂病毒已知也感染犬。尽管此种病毒在犬CPV疫苗中的引入并不可取，但这些猫和貂病毒应包括在接种过的动物的攻击实验中。

特别地，变体2bΔ431在适合于法医追踪和检测的疫苗制备中有用。如上所述，目前疫苗越来越无法保护接种过的动物抗新出现的CPV。在接种疫苗后患病的动物的主人趋于归咎于疫苗自身引起疾病。因为目前的诊断方法不足以区分疫苗株和新出现毒株，所以疫苗制造商不具有针对此种控告的实际防卫，并且经常通过赔偿动物主人而解决这种索赔。这个过程对于疫苗制造商费用非常大。此外，密码子431与密码子426的接近及其在CPV基因组的高变区中的定位也仅允许完成有限测序，以验证在患病犬中致病CPV剂的来源。这可以通过将2bΔ431突变掺入用于配制疫苗的一种或多种疫苗株内得到避免。2bΔ431非常罕见，例如这种变体代表迄今为止研究的约1.2％的变体。因此，当测试来自己用2bΔ431变体接种的患病动物的组织的CPV时，如果检测出除2bΔ431外的任何CPV毒株，那么可以确信地得出疫苗不引起疾病的结论。相反，其他检测出的毒株可能是罪证。此外，无需广泛测序即可检测出Δ431突变。这种类型的法医研究可以为疫苗公司提供显著节省。

本发明提供了疫苗制剂及其使用方法，所述疫苗制剂包括由SEQ IDNOS：1、2、3、4和5表示的核酸序列，和/或由这些序列编码的蛋白质、多肽或肽。此外，还包含了具有这些序列的某些变异的疫苗。虽然序列代表单链(ss)DNA，但本发明还包括了相应的双链(ds)DNA、互补DNA、和任何形式的RNA(例如，mRNA、RNA/DNA杂交物等)，其基于这些序列、得自这些序列或与这些序列互补。此种序列可以是有义或反义序列。此外，也考虑了与SEQ ID NOS：1、2、3、4和5显示至少约50％同源性，优选约60％，更优选约70、80或90％同源性，或甚至约95、96、97、98或99％或更大同源性的序列用于疫苗中。此种序列可以例如由于包含在一个或多个位置处编码相同氨基酸的替代密码子而不同。此外，也考虑了编码CPV VP2蛋白质的抗原性区域的这些序列的部分，以及与此种氨基酸序列显示70％，或甚至更优选80、90或95％或甚至更大同一性(例如，96、97、98或99％同一性)的序列。例如，通过包含保守或非保守氨基酸取代、或缺失(特别是氨基或羧基末端缺失)、或各种插入等可以改变此种序列，只要所得到的蛋白质/肽如本文所述是抗原性的。此种抗原性区域优选长度是至少约10个氨基酸，并且包含VP白质的位置426、431、440、494、555和572中的一个或多个。然而，抗原性区域可以包含整个VP2基因。

此外，还考虑了在严格条件下(特别是高严格条件下)与本文公开的序列(或与这些序列的部分)杂交的核酸序列。严格条件指允许核酸序列与特定序列杂交的杂交条件。一般而言，高严格条件指这样的杂交条件，其允许至少50个核苷酸且优选约200个或更多核苷酸的核酸序列与特定序列在约65℃下在包含约1M盐的溶液中、优选6x SSC或具有相似离子强度的任何其他溶液中杂交，并且在65℃下在包含约0.1M盐或更少、优选0.2xSSC的溶液中或具有相似离子强度的任何其他溶液中洗涤。这些条件允许检测具有约90％或更多序列同一性的序列。一般而言，较低严格条件指这样的杂交条件，其允许至少50个核苷酸且优选约200个或更多核苷酸的核酸序列与特定序列在约45℃下在包含约1M盐的溶液、优选6xSSC或具有相似离子强度的其他溶液中杂交，并且在室温下在包含约1M盐、优选6xSSC的溶液或具有相似离子强度的其他溶液中洗涤。这些条件允许检测具有直至50％序列同一性的序列。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件，以便鉴定50％到90％同一性的序列。

本发明还提供了包含且表达本文公开的核酸序列(或其编码抗原性肽和/或多肽的部分)的各种类型的重组载体和/或表达。此种载体和表达系统的例子包括但不限于：各种细菌(例如，大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))或基于益生菌(例如，乳杆菌属(Lactobacillus))的表达载体；腺病毒载体、杆状病毒、毕赤酵母属(Pichia)和酵母表达系统等。此种重组载体和表达系统可以例如在疫苗制剂中利用，或可替代地用于其他目的，例如用于序列的实验室操作、或用于研究或诊断目的。

本发明提供了抗犬细小病毒的免疫原性和/或疫苗组合物。组合物包含核酸序列SEQ ID NO：1、2、3、4和5中的一个或多个、或这些序列的编码抗原性肽或多肽的部分(抗原性区域)，例如包括位置426、430、431、440、494、555和572的一个或多个密码子的序列部分。优选地，将至少包括包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的序列或其编码抗原性区域的部分。

本领域技术人员应认识到疫苗组合物还可以根据计划用途而改变。换言之，在疫苗中包括的特定组分(变体)可以根据产生特别设计的疫苗制剂的几种参数中的任何而改变。例如，可以设计疫苗以仅包括在特定地理位置中已检测出的那些变体。例如，2a变体在美国不再检测出，并且因此疫苗制造商可以选择在美国使用的疫苗制剂中不包括这种变体。美国疫苗可以包含例如仅CPV 2c和CPV 2b变体。相比之下，目前，2a是澳大利亚的唯一CPV变体。因此，要在澳大利亚使用的疫苗组合物可以仅包括2a变体。推荐用于欧洲的疫苗可以包括例如2c和2b变体，而用于亚洲的疫苗组合物可以包括2a和2b。所有此种根据地理学修改的疫苗由本发明包含，并且可以随时间随着疫苗分布模式改变而改变。关于此种地理学上特定疫苗的进一步考虑是修饰的活病毒疫苗包含大量疫苗病毒抗原。因此，如果用变体接种的犬换到不存在该变体的地区，那么优选在释放到新环境前使动物隔离至少约1个月。否则，变体可能释放到新场所内。例如，用2c变体接种的犬在例如澳大利亚中释放前应隔离。一个月时期后，病毒脱落应停止。即使脱落的病毒是减毒的，它的存在也可以使监控病毒流行病学的尝试混淆，并且可以提供天然病毒与脱落病毒重组的机会，导致更强毒力的突变引入当地的群体内。

此外，疫苗组合物可以修改用于在特定宿主中使用。例如，某些品种的犬可以对某些变体比其他更敏感；或动物的生命阶段(例如，幼犬相比成年)可能使动物易于对一种或多种变体敏感；或当除犬外的宿主(例如，野生生物、动物园或野生动物保护区中的动物等)待接种时，可以调整疫苗组合物以考虑待接受疫苗的特定宿主动物的敏感性。例如，在攻击模型的发展中，奇瓦瓦狗和拉布拉多猎犬品种趋于对CPV更敏感。因此，约4个对数的高毒力CPV-2c变体在有对照的情况下应足以诱导腹泻与呕吐。本发明包含所有此种宿主特异性或宿主选择性疫苗。

在其他实施方案中，疫苗组合物可以根据疫苗接受者的局部环境进行调整。例如，在超过100只犬的商业犬舍房屋中，其中接触传染的危险很高，用包含与美国主要和次要CPV 2c变体组合的变体2bΔ431Δ494Δ572的相对昂贵制剂进行接种可能是优选的。然而，在较小的犬舍(例如，具有小于25只犬)或在具有一只或仅数只犬的住宅中，其中暴露危险较低，用包含2bΔ431Δ494Δ572或2bΔ494Δ572连同仅美国主要2c变体的较不昂贵疫苗进行接种可能是足够的。当决定使用何种疫苗组合物时，动物感染疾病的危险应针对成本和未来分子监控且评估CPV变体的存在的能力进行权衡。

在另外一个方面，本发明提供了疫苗策略用于避免在幼犬中的母体抗体干扰疫苗免疫诱导。不是使用用于成年和幼犬的单一疫苗制剂，而是幼犬可以用在抗原上不同的一系列疫苗进行接种。换言之，最初幼犬疫苗将包含变体，其可能不同于已施用于母亲的那些，并且后续幼犬加强注射应包括疫苗的另外其他重复。以这种方式，将渐增地积累广谱抗体。接种途径可以进行修改，以克服某些接种限制，如在肠胃外免疫接种后脱落病毒。例如，通过使用采用无针技术的舌上接种途径，可以诱导免疫但可以预防粪便中的脱落。

制备适合于抗CPV接种的疫苗的几种方法是本领域已知的。参见例如，Appel等人的美国专利4,193,990和4,193,991、Carmichael等人的美国专利4,303,645、Wood等人的美国专利4,971,793；Valdes等人的美国专利5,882,652、和Parrish等人的美国专利5,885,585，所述专利各自提供合适疫苗配制策略的变更。这些专利各自的完整内容在此通过引用并入本文。一般地，为了制造疫苗，将采用包含所述核酸序列(例如，在病毒内天然存在的ssDNA、或基因工程化到非天然病毒载体内的ssDNA或其他等价形式(例如，dsDNA、ss或dsRNA、RNA-DNA杂交物等)的病毒载体。例子包括被“杀死”、灭活或以其他方式减毒的CPV(或其他)病毒，以便在它连同合适的生理学载体所施用的动物中不引起严重疾病症状。优选地，无疾病症状将由于施用而发生。然而，本领域技术人员应认识到许多有效的疫苗组合物在施用时或施用后引起某些不适或相对较小的痛苦。然而，使免于充分发展疾病的利益远远重于这种可能性。作为替代方案，可以利用不天然感染接种的动物或在接种的动物中通常不引起疾病的异型病毒。

减毒病毒可以是天然包含核酸序列的CPV，或病毒(CPV或其他病毒)可以是重组体，其中核酸序列通过基因工程化插入病毒内。在重组疫苗的情况下，核酸序列可以掺入除CPV外的病毒内，以形成异型重组疫苗。此种病毒的例子包括但不限于FPV、各种疱疹病毒、非致病性“孤儿病毒”、肠道病毒例如肠病毒等。在一个优选实施方案中，病毒是活的、减毒(修饰)高滴度CPV，并且核酸是ssDNA。

优选地，此种制剂还将包含编码其他CPV变体的抗原性区域的核酸序列，所述变体例如2、2a、2b和/或2c变体，以及随后可能鉴定且视为有用的任何其他CPV变体。然而，考虑到仅包含2a和2b变体的疫苗组合物的广泛分布，生产仅包含本文公开的一种或多种变体的疫苗组合物用于与已知2a-2b疫苗结合或补充已知2a-2b疫苗的效果也可以是有利的。此外，此种疫苗可以与抗其他致病实体的疫苗作为分开组合物、或在单一组合物中一起施用。

疫苗的确切形式可以改变。在一个实施方案中，疫苗包含减毒CPV病毒，所述病毒包含如本文公开的核酸序列。优选地，疫苗是多价的并且还包括减毒CPV 2、2a、2b和/或2c型病毒。可替代地，单一病毒可以基因工程化，以包含编码来自两种或更多变体类型的蛋白质(例如，VP2蛋白质、或其抗原部分)的核酸，即具有来自VP2的两个或更多区域的基因组区域的重组嵌合CPVs，可以通过重组技术通过交换来自两种或更多CPVs的DNA区域进行构建，如本领域技术人员已知的。

还考虑了其他形式的疫苗。例如，还考虑了“空”病毒体粒子疫苗(不含核酸)，以及包含抗原性病毒体或未组装到衣壳内的其他CPV蛋白质的疫苗。在这些情况下，疫苗制剂中的蛋白质由SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4或两者编码，或可替代地，较短的抗原性区域由SEQID NO：2和/或SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5的部分编码。还可以包括由SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3编码的蛋白质，和/或由SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3的部分编码的抗原性区域。

其他合适的疫苗组分，例如药理学上可接受的载体是本领域技术人员众所周知的，此种组合物的制剂可以用作疫苗也是本领域技术人员众所周知的。一般地，此种组合物制备为液体溶液或悬浮液，然而，还考虑了固体形式例如片剂、丸剂、粉剂等。还可以制备适合于在施用前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂还可以是乳化的。活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的且与活性成分相容。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等、或其组合。此外，组合物可以包含少量辅助物质，例如湿润或乳化剂、pH缓冲剂等。如果希望施用口服形式的组合物，那么可以添加各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂等。本发明的组合物可以包含任何此种附加成分，以便提供适合于施用形式的组合物。制剂中的可翻译核酸的最终量可以改变。然而，一般而言，量将为约1-99％。组合物可以进一步包括佐剂，它的合适例子包括但不限于Seppic、Quil A、Alhydrogel等。

本发明的免疫原性/疫苗制剂可以通过本领域技术人员众所周知的许多合适方法中的任何进行施用，所述方法包括但不限于通过注射、口服、鼻内、通过摄取包含抗原的食品等。然而，在一个优选实施方案中，施用方式是通过注射。此外，组合物可以单独或与其他药物或免疫原性组合物组合施用，例如作为多组分疫苗的部分。此外，施用可以是单次事件，或多个加强剂量可以以各种定时间隔施用以增强免疫应答。此外，施用可以是预防性的，即在暴露于病毒已发生、或怀疑已发生前，或在事实后，即在已知或怀疑暴露后，或治疗性的，例如在与病毒感染相关的疾病症状发生后。

在制剂施用后，本发明的核酸序列在已施用疫苗的宿主动物内表达，并且宿主动物产生针对由核酸编码的抗原性蛋白质(或其部分)的免疫应答。优选地，引发的免疫应答是保护性免疫应答。在某些实施方案中，减毒病毒保留在宿主内复制的能力，尽管这不是严格需要的。

本发明提供了预防有需要的哺乳动物中的CPV感染症状的方法。一般地，施用CPV疫苗以在幼犬和/或成年犬中提供主动免疫。该方法涉及给哺乳动物施用包含核酸的免疫原性和/或疫苗组合物，所述核酸包括由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中的至少一个或SEQ ID NO：5代表的序列，或其编码VP2的抗原性区域的部分，并且优选包含由SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5中的一个或多个代表的序列，或其编码VP2的抗原性区域的部分。在一个优选实施方案中，制剂还包括编码其他临床相关CPV变体，优选2a和2b变体，以及任选地原始CPV2的核酸。组合物的施用导致由接受者引发免疫应答。优选地，免疫应答提供抗未来对CPV的暴露的保护作用，并且完全消除疾病症状，或使疾病症状改善至比未接种将经历的水平更弱水平。

在本发明的一个优选实施方案中，使用本发明的疫苗接种的动物是驯养犬，包括成年犬和幼犬。然而，还考虑了其他潜在CPV宿主的接种。其他潜在宿主包括其他犬科动物，例如野生犬科动物(例如，狼、野生犬物种等)、猫(包括驯养猫和小猫，以及大型猫科物种，无论是驯养还是野生的)、貂、小熊猫、狐狸、狮子和老虎等。尽管疫苗当然将在驯养动物中使用，但野生或部分驯养的动物也可以从此种疫苗接种中获益，例如动物园或保护区、公园、研究机构等中的动物。无论病毒在宿主中是否引起疾病症状，可以成为CPV和CPV变体的宿主的任何动物都可以通过经由本文提供的疫苗制剂接种而获益。在被病毒感染后无症状的动物(即沉默携带者)的接种将是有益的，以便减少动物传播给更敏感的群体。

本发明还提供了与2bΔ494Δ572、2bΔ431、2cΔ440型或美国2c变体CPVs的蛋白质的抗原决定簇或抗原性区域特异性或选择性结合的抗体。此种差异抗体可以是多克隆或单克隆的，尽管一般优选单克隆抗体。单克隆抗体将通过将变体(以蛋白质形式、或编码蛋白质的核酸)注射到小鼠内进行制备。3次加强后，收获脾且与骨髓瘤细胞融合。产生单克隆抗体的克隆将通过ELISA、HA-HI和间接荧光抗体测试进行筛选。与2bΔ494Δ572、2bΔ431、2cΔ440和/或美国2c基因型反应的克隆将保存用于开发CPV诊断测定法。多克隆抗体可以通过将一种或多种肽注射到例如兔内进行制备，所述肽跨越作为2bΔ494Δ572、2bΔ431、2cΔ440和/或美国2c变体的优选抗原靶的氨基酸密码子。

本发明还提供了用于检测本文描述的CPV变体以及任选其他CPV变体(例如CPV2、2a和2b)的诊断试剂盒。此种试剂盒包括对用于扩增(例如，通过聚合酶链反应)本文公开的核酸序列特异的寡核苷酸引物。可替代地，此种试剂盒可以包括与独特抗原决定簇选择性或特异性结合的抗体(例如，单克隆或多克隆)，所述独特抗原决定簇由变体以及任选地由其他CPV变体(例如，CPV2、2a和2b)展示。

在本发明的一个进一步方面，提供了用于在体外培养CPV的新方法。该方法涉及在合适培养基中在1)已知对CPV感染敏感的细胞和2)Vero细胞的混合细胞培养物中培养病毒。在一个优选实施方案中，对CPV感染敏感的细胞是CRFK细胞。然而，也可以使用其他类型的此种细胞，包括但不限于：A72犬纤维瘤衍生细胞；得自CRFK细胞的细胞例如Nordisk实验室猫肾(NLFK)细胞；猫舌细胞例如Fe3Tg细胞；猫肺细胞例如AK-D细胞；猫淋巴瘤细胞系例如3201；犬T细胞系例如CT 45-S；犬胸腺上皮细胞系例如Cf2Th等。此外，各种猫和犬细胞系以及关于培养它们的说明书可以得自Manassas，Virginia的美国典型培养物保藏中心。

这些细胞系可以连同Vero细胞一起在本领域技术人员已知的各种培养基中进行繁殖。例如，CT 45-S细胞可以RPMI 1640培养基中进行培养，AK-D、Fe21u和Cf2Ths细胞可以在具有10％胎牛血清(FBS)的达尔贝科最低必需培养基(MEM)中进行培养；对于3201、NLFK、CRFL、A72和Fc3Tg细胞，使用具有5％FCS的McCoy′s 5A和LeibowitzL15。一般地，细胞系一起在37℃下温育4-5天。

实施例

引言

犬细小病毒(CPV)感染是最严重和流行的犬疾病，并且是幼犬中最常见的腹泻原因。尽管抗CPV的疫苗是可获得且广泛使用的，但已发生在接种过的犬中的几次最近CPV爆发。例如，尽管已经接种，在美国中南部中的犬舍主人已观察到由于CPV感染导致的高幼犬死亡率。

CPV是单链DNA病毒，其具有高突变率以及改变其宿主范围和亲嗜性的能力。目前可获得的商业疫苗一般仅包含CPV2、CPV2a和CPV2b变体。在来自具有细小病毒感染明显症状的CPV接种犬的样品分析过程中，我们观察到通过目前CPV诊断测试在CPV检测中的功能改变和目前试剂盒无法检测野生病毒，指示CPV超过2a和2b亚型的可能进化。进一步研究导致2种CPV变体——即2bΔ494Δ572和美国2c的鉴定。分离物与增强的毒力和比用迄今培养的CPV分离物观察到的更广泛的组织亲嗜性相关。此外，看起来新CPV分离物引起黄色粘液性腹泻而不是过去由CPV-2基因型引起的出血性腹泻。与其他报告一致，2bΔ494Δ572变体具有两个密码子改变。美国2c变体先前已在意大利、西班牙和越南检测出，但先前仍未在美国检测出。

材料与方法

通过Oklahoma动物疾病诊断实验室，经由联邦快递冰包裹法(约4-5℃)接受粪便样品。接受最少2-5克粪便或2-5ml液体腹泻大便。粪便样品一般通过商购可得的CPV酶联免疫吸附测定法(ELISA)当天进行测试。我们接受来自肠的不同区域的肠弯(约2-3片)用于荧光抗体测试(FAT)或免疫组织化学(IHC)。有时，我们接受舌片用于FAT或IHC或聚合酶链反应(PCR)，用于CPV检查。这些样本通过FedExp经过冰包裹法冷却接受。许多CPV病例具有通过现场诊断试剂盒(Assure，Synbiotics，CA；或IDEXX，Bar Harbor，Maine)对于CPV测试阴性的病史。

对具有与CPV相关病史的犬和成年犬的肠执行组织病理学。病史包括血性或粘液性腹泻和死亡。对新鲜和福尔马林固定的肠组织进行与CPV相关的损害检查：隐窝膨胀和坏死、以及小肠绒毛的丧失。

荧光抗体(FAT)测试用于在小肠中筛选CPV抗原。用丙酮固定厚度6-8微米的肠切片且在空气中干燥。加入用FITC标记的抗CPV缀合物，并且使切片在37℃下温育30分钟。洗涤后，用台盼蓝复染切片。通过荧光显微镜术检查切片：对于FAT测试，CPV阳性细胞染成苹果绿色，并且CPV阴性细胞染成砖红色。

提交用于组织病理学的福尔马林固定的切片通过免疫组织化学检查CPV抗原。

对粪便样品和CPV阳性或可疑肠样品刮屑执行PCR，随后测序，如由Desario等人，2005描述的。病毒蛋白质基因的部分通过PCR进行扩增。扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测并且从凝胶中洗脱用于测序。

对序列实施经由BLAST程序的分析，所述BLAST程序使结果与已在GenBank中保藏的大量序列集合比较。所有序列鉴定为与犬细小病毒相似。

实施例1.目前CPV诊断测试的失败。

如上所述分析粪便样品，并且使用下述标准，所有样品都是阳性的：如通过组织病理学测定的特征性病变、荧光抗体测试结果和免疫组织化学结果。然而，在使用商业诊断测试，对相同样品测试后，结果显示测试对于这些样品的CPV野外诊断是不可靠的，无法检测33-50％的CPV阳性病例。

大多数这些CPV分离物得自这样的犬舍，其目前根据疫苗标签使用商业CPV疫苗但仍经历CPV爆发和死亡率。这种保护的缺乏可能是由于新出现的CPV分离物中的抗原性变异。经过许多CPV病例(n约500)的这种流行病学现场观察发出需要将这些新CPV变体掺入商业CPV疫苗内的信号。

实施例2.CPV分离物的测序：2bΔ494Δ572变体和美国CPV2c分离物的鉴定

疫苗和诊断试剂盒的失败一般视为病毒进化的流行病学证据。因此，怀疑在被研究的样品中存在新CPV变体。为了证实这点，对于从粪便样品中分离的病毒执行病毒蛋白质VP2的部分的PCR测序，并且使用计算机软件程序和/或手工比对使结果与已知VP2序列比较。

结果证实在样品中存在两种新出现CPV类型：1)命名为2bΔ494Δ572的2b变体；和2)先前在美国未报告的美国2c。编码两种变体的VP2蛋白质的部分的DNA序列呈现于图1(2bΔ494Δ572，SEQ IDNO：1)和图3(美国2c，SEQ ID NO：3)中。这些序列与已知CPV 2参照序列的比较揭示，在2bΔ494Δ572中，已发生密码子494和572中的改变。在494处的常见CPV 2密码子是TGT，但在2bΔ494Δ572中，密码子494是TGC。相似地，在CPV2分离物中在位置572处的常见密码子是GTA，但在2bΔ494Δ572中，这个密码子是GTC。这些改变不导致VP2蛋白质的氨基酸序列中的改变。然而，这些改变可能赋予2bΔ494Δ572变体在其生命周期的一个或多个时期中的优点，例如在复制、转录或翻译效率中。有意义的是，美国2c变体在样品中的存在是这种CPV变体在美国的首例报告，并且可能是其作为占优势变体出现的预兆。约50％的疫苗失败病例是由于CPV2bΔ494Δ572的存在，并且50％可归于CPV2c或CPV2cΔ430Δ440。

这些发现证实2bΔ494Δ572和美国2c作为占优势CPV变体的出现，以及发出需要将这些变体掺入CPV疫苗制剂内的信号。

以相似方式鉴定其他变体。

实施例3.变体二级结构和相关能量的测定

病毒病原体的毒力已知与病毒基因组中的二级结构元件相关(Pellerin等人，1994.Virology 203：260-268)。使用位于万维网上的mfold.burnet.edu.au网站上的“mfold”DNA折叠程序评估变体2c、2bΔ431和2cΔ430Δ440的高变区的折叠模式。结果显示于图6-8中，其描述了每种变体的折叠模式和相关能量水平。如可见的，维持区域的二级结构，并且解折叠的能量水平可以改变。

实施例4.抗CPV的新多价疫苗开发和测试

开发了抗新出现的CPV变体的新多价疫苗。该疫苗包括CPV2a、2bΔ494Δ572、2bΔ431、美国2c、2cΔ440以及任选地CPV2型的一种或多种减毒的CPV病毒。换言之，在这种新型疫苗中，CPV2b由2bΔ494Δ572(新发现作为占优势基因型出现的变体)替换。看起来不再是威胁的CPV2的存在是任选的。

用多价疫苗接种疫苗的动物受到保护，免于发展由用于制备疫苗的变体导致的细小病毒感染的症状。

实施例5.用于CPV繁殖的新型混合细胞培养法

CPV一般在仅包含单一类型的细胞例如Crandall猫肾(CRFK)细胞系的细胞培养物中生长。

已开发了培养CPV的改良方法。根据新方法，CPV在基本必需培养基(MEM)中在CRFK和Vero细胞的等量混合物中进行培养。两种细胞系进行铺板并且在铺板后1小时接种样品。在这个阶段时，细胞附着但仍处于细胞分裂早期。新细胞培养法比当CPV用CRFK细胞单独培养时更快速地产生可检测的致细胞病变效应。此外，高滴度的CPV产生在混合细胞培养物中维持3次连续传代。

虽然本发明已就其优选实施方案而言进行描述，本领域技术人员应认识到本发明可以用所附权利要求的精神和范围内的修改进行实践。因此，本发明不应限于如上所述的实施方案，但应进一步包括本文提供的说明书的精神和范围内的其所有修改和等价物。本文引用的所有美国专利、专利申请和其他参考文献在此通过引用并入本文。

参考文献

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Desario，Constantina，N.Decaro，M.Campolo，A.Cavalli，F.Cirone，G.Elia，V.Martella，E.Lorusso，M.Camero and C.Buonavoglia.J.Virol.Methods 126(2005)179-185.

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Truyen，Uwe.Veterinary Microbiology(2006)117，9-13.

序列表

<110>THE BOARD OF REGENTS FOR OKLAHOMA STATE UNIVERSITY

Kapil，Sanjay

Cooper，Emily

 

<120>包含犬细小病毒遗传性变体的疫苗

 

<130>08-440WO

 

<150>US 60/943,947

<151>2007-06-14

 

<150>US 61/027,618

<151>2008-02-11

 

<160>5

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

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<212>DNA

<213>犬细小病毒

 

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Claims (15)

1.细小病毒疫苗，其包含下述中的一种或多种

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的编码抗原性区域的部分；和

SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的编码抗原性区域的部分。

2.权利要求1的细小病毒疫苗，其进一步包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的编码抗原性区域的部分、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：3的编码抗原性区域的部分和编码VP-2b型蛋白质的序列。

3.权利要求1的细小病毒疫苗，其中所述SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：2的所述部分和所述SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的所述部分存在于减毒的细小病毒中。

4.对动物进行抗细小病毒感染接种的方法，其包括给所述动物施用细小病毒疫苗的步骤，所述细小病毒疫苗包括

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的编码抗原性区域的部分；和

SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的编码抗原性区域的部分。

5.权利要求4的方法，其中所述细小病毒疫苗进一步包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的编码抗原性区域的部分、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：3的编码抗原性区域的部分和编码VP-2b型蛋白质的序列。

6.权利要求4的方法，其中所述SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的所述部分和所述SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的所述部分存在于减毒的细小病毒中。

7.检测生物样品中的CPV存在的方法，其包括使所述样品暴露于与下述序列特异性或选择性结合的分子：

a)核酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQID NO：4中的一种或多种；

或

b)由核酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的一种或多种编码的氨基酸序列

和

检测所述分子与所述一种或多种核酸序列或所述一种或多种氨基酸序列之间的结合事件。

8.权利要求7的方法，其中所述分子是寡核苷酸引物。

9.权利要求7的方法，其中所述分子是抗体。

10.诊断试剂盒，其包含

对于检测下述序列特异的分子：

a)核酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQID NO：4中的一种或多种；

或

b)由核酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的一种或多种编码的氨基酸序列。

11.权利要求10的诊断试剂盒，其中所述分子是寡核苷酸引物。

12.权利要求10的诊断试剂盒，其中所述分子是抗体。

13.繁殖犬细小病毒的方法，其包括下述步骤

在合适的培养基中在Crandall猫肾(CRFK)细胞和Vero细胞的混合物中培养所述犬细小病毒，其中所述培养步骤在允许所述犬细小病毒繁殖至当CPV在单独的CRFK细胞中培养时获得的滴度的条件下执行。

14.包含一种或多种CPV变体的细小病毒疫苗，其中所述一种或多种CPV变体的中和水平比选自CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c的一种或多种CPV变体的中和水平低至少4倍。

15.权利要求14的细小病毒，其中所述中和水平通过血清中和测定法进行测定，并且表示为中和滴度。

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