CN108165666A - 检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法 - Google Patents

检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法。本发明提供一种检测犬细小病毒2a(CPV2a)、犬细小病毒2b(CPV2b)与犬细小病毒2c(CPV2c)的结构性蛋白VP2的方法，其中可利用荧光侦测系统及侧流式免疫分析侦测信号。本发明另提供一种区分野生型与疫苗型的方法，该方法的第一种手段是利用荧光侦测系统及侧流式免疫分析进行SNP 36的分析，第二种手段则是进行SNP 899及SNP 963的分析。

Description

检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法
技术领域
本发明是关于一种检测犬样本中检测犬细小病毒2a、犬细小病毒2b与犬细小病毒2c的方法，尤指一种鉴别野生型与疫苗型的方法。
背景技术
犬细小病毒第2型(以下称为CPV-2)感染症是一种高传染性的病毒性疾病，其会感染犬，并在犬只间传播，其征状在于严重的白细胞减少症(leucopenia)，呕吐，体重减轻，食欲不振(厌食)和出血性腹泻。感染方式例如是直接由口或鼻接触带有病毒的粪便，或是间接地接触病毒污染物等。在一般情况下，犬只往往是通过自然感染途径得到犬细小病毒感染症，且多数感染病例是发生在六周至六个月大的幼犬上。近年来，由于实验犬和宠物犬的数量增加，CPV-2感染俨然已为全球犬只的严重问题。
CPV-2的基因为单链负股的脱氧核糖核酸序列(DNA)，其长度为5.2Kb并具有两个启动子(promoter)，因此，通过选择性地剪接其信息核糖核酸序列(mRNA)而可表达两种结构性蛋白(包含VP1，VP2和VP3)以及三种非结构性蛋白(包含NS1和NS2)。其中，结构性蛋白VP2是经氨基端(NH2-terminal)剪辑后的结构性蛋白VP1(84kDa)，其是病毒核酸周围蛋白质膜的主要组成物(90％)，而可作为决定CPV-2抗原性的关键因素。CPV-2感染症首次发生于1970年代末，但随后几年即被其他抗原变异体所取代。目前，已知CPV-2的三种主要抗原变异体为2a型、2b型与2c型(以下称为CPV2a，CPV2b与CPV2c)，其广泛地存在于全球各地的狗群中。而原始CPV-2虽仍存在于市售可用的CPV-2疫苗中，但已于田间绝迹。
通常在临床症状发生之前，CPV-2即在犬只感染后4至5天内自感染犬只的粪便中排出。而在病况发生期间直至临床复原后10天左右，皆可检测到排出的病毒。因此，临床上，常使用粪便样本做为检测的依据。检测方式包含血细胞凝集测试(haemagglutination)、电子显微镜(electron microscopy,EM)、以犬肾细胞株(MDCK)、猫肾细胞株(CRFK)或犬纤维肉瘤细胞株(A72)等分离病毒、酶联免疫吸附测试(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、乳胶凝集测试(latex agglutination test,LAT)、荧光抗体测试(fluorescentantibody test,FAT)、CIE测试(CIE test)、病毒中和测试(virus neutralization test)、聚合酶链反应(以下称PCR)、实时聚合酶链反应(以下称real time PCR)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、核酸杂交(nucleic acidhybridization)、原位杂交(in situ hybridization)和核酸测序(nucleic acidsequencing)，前述各检测方式分别具备不同的灵敏度与特异性，同时也会产生一定比例的伪阳性案例。而在前述各检测方式中。属PCR与real time PCR对于检测CPV2a、CPV2b和CPV2c的准确性与特异性相对较高，而较为广泛应用。
然而，当针对接种疫苗数天后腹泻犬只的粪便样本进行检测时，可能得到模糊的检测结果。事实上，疫苗中含有弱毒病毒(modified-live virus)，尽管该弱毒病毒是经由非自然的途径进入犬只，其仍然能够在犬只的肠黏膜中进行复制，并且相较于野生型的病毒，该弱毒病毒会在短时间内以低量的方式自粪便中排出。在此情况下，针对已接种过疫苗的犬只所进行的CPV2a、CPV2b和CPV2c检测可能产生伪阳性的结果，而导致误诊。
据此，需要进一步研发具备高度准确性与稳定性的检测法，应用于CPV2a、CPV2b和CPV2c的检测，同时鉴别野生型与疫苗型。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种检测CPV2a、CPV2b与CPV2b的结构性蛋白VP2的目标核酸的方法，该检测方法可克服前述已知技术的问题。本发明的目的在于更进一步提供一种检测方法，其是用于检测对该目标核酸具特异性的探针(probe)、引物(primers)以及具备外切核酸酶水解(exonuclease hydrolysis)能力的模板依赖性聚合酶(template-dependent polymerase)来扩增目标核酸。
为达上述目的，本发明提供一种检测可疑样本中目标核酸的方法，其包含以下步骤：
(a)提供样本，其可能包含CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2的目标核酸；
(b)提供引物对(primers)，该引物对包含正向引物(forward primer)与反向引物(reverse primer)，正向引物是由选自于SEQ ID No.2所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，反向引物是由选自于SEQ ID No.3所示互补序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中探针的序列是选自于由SEQ ID No.4至6组成的群组；以及
(e)检测杂交体产生的信号，以判定样本中具有CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2的目标核酸。
本发明提供一种检测样本内包含犬细小病毒2a、犬细小病毒2b或犬细小病毒2c的结构性蛋白VP2核酸的目标核酸的方法，其包含：
(a)提供样本，其包含CPV2a、CPV2b或CPV2c的目标核酸；
(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ IDNo.2所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由选自于SEQ ID No.3所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中探针的序列是选自于由SEQ ID No.4至6组成的群组；以及
(e)检测杂交体产生的信号，以判定样本中包含有目标核酸。
依据本发明，所述杂交体产生的信号可通过荧光侦测系统(fluorescentdetection system)与侧流式免疫分析系统(lateral flow immunochromatographicassay)侦测。若荧光侦测系统或侧流式免疫分析系统可侦测到信号，出现信号表示可疑样本中具有CPV2a、CPV2b与CPV2c，未出现信号则表示可疑样本中不具有CPV2a、CPV2b与CPV2c。
本发明的另一目的在于提供可鉴别野生型与疫苗型的两种方法。
第一种方法是利用SNP 36达到鉴别的目的。利用前述对目标核酸具特异性的探针、引物以及具备外切核酸酶水解能力的模板依赖性聚合酶扩增目标核酸。为达上述目的，本发明提供一种检测目标核酸的方法，其包含以下步骤：
(a)提供样本，其可能包含CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP的目标核酸；
(b)提供引物对，该引物对包含正向引物与反向引物，正向引物是由选自于SEQ IDNo.7所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，反向引物是由选自于SEQ ID No.11、12或13所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中探针的序列是选自于由SEQ ID No.14及15组成的群组；以及
(e)侦测杂交体产生的信号，作为样本中包含有目标核酸的判定依据。
本发明提供一种鉴别样本内目标核酸为犬细小病毒野生型或疫苗型的方法，其包含：
(a)提供样本；
(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ IDNo.7所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由选自于SEQ ID No.11、12或13所示互补核酸序列的至少12个连续的核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合SNP探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中SNP探针对于CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2的基因的SNP 36具特异性，且SNP探针的序列包含SEQ ID No.14或15；以及
(e)侦测杂交体产生的信号，以判定样本中包含有目标核酸。
依据本发明，所述杂交体产生的信号可通过荧光侦测系统与侧流式免疫分析系统侦测。若信号可被荧光侦测系统或侧流式免疫分析系统侦测，出现信号表示为野生型，未出现信号则表示为疫苗型。
第二种方法是利用SNP 899与SNP 963达到鉴别野生型与疫苗型的目的。其扩增条件与检测步骤大体上与利用SNP 36鉴别的方式相同，除了以下条件外：
(a)正向引物：是由选自于SEQ ID No.16所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(b)反向引物：是由选自于SEQ ID No.22或23所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)探针：第一探针对于结构性蛋白VP2的SNP 899具特异性，第二探针对于结构性蛋白VP2的SNP 963具特异性。第一探针的序列是选自于由SEQ ID No.24至28组成的群组，第二探针的序列是选自于由SEQ ID No.29至33组成的群组。
本发明提供一种鉴别样本内目标为犬细小病毒野生型或疫苗型的方法，其包含：
(a)提供样本；
(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ IDNo.16所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由12个选自于SEQ IDNo.22或23所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标；
(d)黏合P1探针与P2探针至目标核酸，以在进行步骤(c)时形成杂交体，其中P1探针对CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2基因的SNP 899具特异性，P2探针对CPV2a、CPV2b与CPV2c的VP2基因的SNP 963具特异性，且P1探针包含选自由SEQ ID No.24至27组成的群组，P2探针包含选自由SEQ ID No.29至33组成的群组；以及
(e)侦测杂交体产生两种不同的荧光信号。
依据本发明，所述杂交体产生的信号可通过荧光侦测系统侦测。出现两不同信号表示为野生型，出现任一种荧光信号则表示样本中具有疫苗型。
上述段落仅简要地描述本发明的目的，其内容已进一步于下方段落详细描述。上述段落并不用于定义本案的关键或基本特征，亦不构成任何保护范围的限缩。
其中，“目的”一词视为“至少一目的”。前述目的以及本文所描述的其他目的将以例示的方式描述，并不限于附图所揭示特征。
附图说明
图1绘示了以琼脂凝胶电泳分析实施例1得到的扩增产物。
图2绘示了实施例1中动力学PCR的生长曲线。
图3绘示了以琼脂凝胶电泳分析实施例2得到的扩增产物，其中，样本数1至4为野生型样本，样本数5至7为疫苗型样本，NPC则表示负调控。
图4绘示了实施例2中动力学PCR的生长曲线，其中，样本数1至4为野生型样本，样本数5至7为疫苗型样本，NPC则表示负调控。
图5绘示了实施例2中动力学PCR的生长曲线，其中，样本数1至4为实体样本，样本数5至6为疫苗株，NPC则表示负调控。
图6绘示了实施例3中结合SNP 899与SNP 963的动力学PCR的生长曲线，其中，20个实体样本中，SNP 899和SNP 963均为阳性。
图7绘示了实施例3中结合SNP 899与SNP 963的动力学PCR的生长曲线，其中，Vanguard疫苗株仅SNP 963为阳性，Duramune疫苗株仅SNP 899为阳性。
图8绘示了以琼脂凝胶电泳分析实施例4得到的扩增产物。
图9绘示了实施例4的侧向流动。
图10绘示了以琼脂凝胶电泳分析实施例5得到的扩增产物。
图11绘示了实施例5的侧向流动。
具体实施方式
以下描述仅概述本发明的原理。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
此外，本文所述的所有实施例和条件语言仅为教示用，使本领域的技术人员能理解本发明的原理及其在本领域的贡献，而并非用于限缩本发明。
另外，有关本文所述本发明的原理，目的、实施例以及具体实施态样已涵盖其他在功能上与结构上与本发明相同或相近的类似物。再者，所述类似物包含现有类似物以及未来发展的类似物，举例来说，不论其结构，任何具等效功能的组件等。
除非另有说明，本案附图仅供参考，其并非按一定比例绘制。
为解决前述问题，本案公开一种可快速检测CPV2a、CPV2b或CPV2c的PCR或realtime PCR，其是利用连接有小沟结合(minor groove binder)配体的TaqMan探针进行检测。
在此种检测中，以不同的荧光报告物(fluorescent reporter)标记不同类型的特异性探针，以确保能检测到具类型特异性的荧光。在该检测中所使用的聚合酶(Taqpolymerase)为具备外切核酸酶水解能力的DNA依赖性聚合酶。通过DNA依赖性聚合酶的外切核酸酶水解，将荧光报告物的片段自与目标核酸杂交的探针上切割下来，并通过荧光报告物的片段数量来侦测荧光信号。
在本发明的一实施例中，是提供一种检测样本内带有CPV2a、CPV2b与CPV2b核酸序列的目标核酸的方法，其包含以下步骤：
(a)提供样本，其可能包含CPV2a、CPV2b或CPV2c的结构性蛋白VP2的目标核酸；
(b)提供引物对(primers)，该引物对包含正向引物(forward primer)以及反向引物(reverse primer)，正向引物是由选自于SEQ ID No.2所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，反向引物是由选自于SEQ ID No.3所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中探针的序列是选自于由SEQ ID No.4至6组成的群组；以及
(e)检测杂交体产生的信号，作为样本中具有CPV2a、CPV2b或CPV2c的目标核酸的判定依据。
由于结构性蛋白VP2(如SEQ ID No.1所示)为CPV2a、CPV2b与CPV2c的保守区(conserved region)，本发明中所记载的所有引物与探针皆选自于结构性蛋白VP2的基因。具体来说，用以检测CPV2a、CPV2b与CPV2c的正向引物是由选自于SEQ ID No.2所示核酸序列中的至少12个连续核酸序列所组成，而SEQ ID No.2所示核酸序列即为结构性蛋白VP2基因的一部分；而反向引物则是由选自于SEQ ID No.3所示互补核酸序列中的至少12个连续核酸序列所组成。探针的序列相对于VP2基因亦具备特异性，其是选自于由SEQ ID No.4至6组成的群组。由荧光信号的产生，可判定样本中具有CPV2a、CPV2b或CPV2c。
本发明亦公开一种藉由检测结构性蛋白VP的SNP 36、SNP 899与SNP 963来鉴别野生型与疫苗型的方法。对于SNP 36来说，其核苷酸为G者为野生型；为A者则为疫苗型，其中疫苗型是指样本曾经接种任一种疫苗，该疫苗包含Duramune MX5、Canivac 5、Vanguaradplus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II-SL、Eurican 5或Virbagen DA2Parvo。对于SNP 899来说，核苷酸为G者为野生型与Duramune MX5；为C者为疫苗型，其中疫苗型是指曾经接种任一种疫苗的样本，该疫苗包含Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、NobivacPuppy DP、Canine 6II-SL、Eurican5及Virbagen DA2Parvo。最后，对于SNP 963来说，核苷酸为T者为野生型、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II-SL、Eurican 5、Virbagen与DA2Parvo；为A者为疫苗型，其中疫苗型是指曾经接种DuramuneMX5的样本。前述疫苗中，CPV的病毒力价(TICD50)大于或等于105拷贝。因此，这些引物与探针是设计使其对于本发明的野生型具特异性。
表1：野生型与疫苗型的核苷酸
样本 SNP 36 SNP 899 SNP 963
野生型 G G T
Duramune MX5 A G A
Canivac 5 A C T
Vanguarad plus 5 L4 CV A C T
Nobivac Puppy DP A C T
Canine 6II-SL A C T
Eurican5 A C T
Virbagen DA2Parvo A C T
在本发明的另一实施例中，提供一种利用SNP 36来鉴别野生型与疫苗型的方法，其包含以下步骤：
(a)提供样本，其可能包含目标核酸；
(b)提供引物对，该引物对包含正向引物与反向引物，正向引物是由选自于SEQ IDNo.7所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，反向引物是由选自于SEQ ID No.11、12或13所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合SNP探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中所述SNP探针的序列对于结构性蛋白VP2的SNP 36具特异性，且SNP探针的序列是选自于SEQ ID No.14或15；以及
(e)侦测杂交体产生的信号，作为样本中具有目标核酸的判定依据。
SNP 36可以单独应用于鉴别野生型与疫苗型。SNP 36的正向引物是由选自于SEQID No.7所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，或者是选自由SEQ ID No.8至10所组成的群组。反向引物是由选自于SEQ ID No.11至13所组成的群组。探针则是选自于SEQID No.14及15所组成的群组。探针带有荧光报导子(fluorescent reporter)，其可选自由FAM、HEX、VIC、CY5及TET所组成的群组，探针的3’端具有荧光淬灭子(fluorescentquencher)，该荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB及BHQ所组成的群组。出现荧光信号表示为野生型，未出现荧光信号表示样本中具有疫苗型。疫苗型是指该犬只(样本)曾经接种过任一种疫苗，其包含Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II-SL、Eurican5及Virbagen DA2Parvo。出现荧光信号表示样本中为野生型，未出现荧光信号表示样本中为疫苗型。
在本发明的又一实施例中，提供一种同时利用SNP 899与SNP 963来鉴别野生型与疫苗型的方法，其包含以下步骤：
(a)提供目标，其可能包含结构性蛋白VP2；
(b)提供引物对，该引物对包含正向引物与反向引物，正向引物是由选自于SEQ IDNo.16所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，且反向引物是由选自于SEQ IDNo.22或23所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标；
(d)黏合两种探针至目标核酸，以在进行步骤(c)时形成杂交体，其中一种探针对于结构性蛋白VP2基因的SNP 899具特异性，另一探针则是对于结构性蛋白VP2基因的SNP963具特异性，其中，所述一种探针是选自由SEQ ID No.24至27组成的群组，另一探针则是选自由SEQ ID No.29至33组成的群组；以及
(e)检测杂交体产生两种不同的荧光信号。
所述正向引物是由选自于SEQ ID No.16所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，或者是选自于由SEQ ID No.17至21组成的群组。反向引物是由选自于由SEQ IDNo.22或23所组成的群组。两探针的5’端皆带有不同的荧光报导子，该荧光报导子是选自由FAM、HEX、VIC、CY5与TET组成的群组，两探针的3’端带有荧光淬灭子，该荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB与BHQ组成的群组。
SNP 899的探针是选自于SEQ ID No.24至28中之一，且SNP 963的探针是选自于SEQ ID No.29至33中之一。出现两种荧光信号表示为野生型，出现两种荧光信号的任一种表示为疫苗型。疫苗型是指该犬只(目标)曾经接种过任一种疫苗，其包含Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II-SL、Eurican5或Virbagen DA2Parvo。出现两种不同荧光信号表示为野生型，出现两种不同荧光信号的任一种表示为疫苗型。两种荧光信号皆未出现表示未被感染，或者是为低病毒载量的样本。
本发明所使用的TaqMan探针的方式较传统方法更具灵敏度，其中，本发明的方法的检测极限为101拷贝的CPV2a、CPV2b与CPV2c，并鉴别野生型/疫苗型。此外，因该方法的鉴别窗口(discrimination window)可达108拷贝，因此，其在检测CPV2a、CPV2b或CPV2c，以及鉴别野生型/疫苗型上亦能具有高特异性。据此，本发明可快速且准确地检测CPV2a、CPV2b或CPV2c，并鉴别野生型与疫苗型。
本发明同时提供一种侧流免疫分析法(lateral flow immunochromatographicassay)，以检测CPV2a、CPV2b或CPV2c。其可通过肉眼观察有色颗粒而得知试验结果。在此分析法中，是利用不同的抗原标记各类特异性探针，以确保特异性分析物的检测结果。其中，所述引物及/或所述探针其正向引物或反向引物的5’端带有一抗原，该抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas-red及Tamra组成的群组；并且，探针的3’端带有另一抗原，该另一抗原不同于第一探针或第二探针，且其是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas-red及Tamra组成的群组。有色颗粒是选自由胶体金(colloidal gold)、乳胶(latex)及纳米碳粒(nanoparticles)组成的群组。
除了正向引物的剂量小于反向引物的剂量，以及在扩增步骤中加入肽核酸(PNA)外，所述引物与探针的序列、检测步骤以及扩增条件皆与以TaqMan探针检测CPV2a、CPV2b或CPV2c的方法大体相同。
在完成扩增步骤后，将分析物加入试纸上以进行免疫色谱侧定(immunochromatographic assay)。在试验组中，出现分析信号则表示样本中具有CPV2a、CPV2b或CPV2c，未出现分析信号则表示样本中不具有CPV2a、CPV2b或CPV2c。
此外，本发明亦提供一种侧流免疫分析法，以鉴别野生型与疫苗型。除了正向引物的剂量小于反向引物的剂量，以及在扩增步骤中加入PNA外，所述引物及探针的序列、检测步骤以及扩增条件皆与以SNP 36进行检测的方法大体相同。在完成扩增步骤后，将分析物加入试纸上以进行免疫色谱侧定。在试验组中，出现分析信号则表示为野生型，未出现分析信号则表示为疫苗型。
本发明所应用的侧流免疫分析法相较于传统方法更具灵敏度，其中，本发明的方法的检测极限为101拷贝的CPV2a、CPV2b与CPV2c，并能鉴别野生型/疫苗型。除此之外，即使疫苗的力价(titer)较高(103拷贝)该方法仍可检测CPV2a、CPV2b、CPV2c或SNP 36，而兼具有高特异性。据此，本发明可利用侧流免疫分析法快速且准确地检测CPV2a、CPV2b或CPV2c，并鉴别野生型与疫苗型。
实施例1：利用Taqman探针检测CPV2a、CPV2b与CPV2c
本发明优选是不包含样本的准备步骤。自可疑样本中纯化或分离出包含目标核酸的核酸后，可利用不同的条件检测目标核酸。
在本实例中，准备一CPV2a感染样本、一CPV2b感染样本、CPV2c感染样本与一健康样本。利用DNA/RNA抽取套组(AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA)分离该些样本的DNA。利用具SEQ ID No.34与SEQ ID No.3的引物扩增结构性蛋白VP2的2a、2b与2c片段。所述引物与探针的序列如表2所示。其中，所述探针亦可替换为SEQ ID No.5或6。
表2：引物序列
所述扩增反应是在real time PCR分析仪(BioRad CFX Connect Real-timeSystem(BioRad Laboratories,Inc.))的实时测量与监控下进行。各反应混合物的体积为20微升，且其是在下表3记载的条件下进行扩增：
表3：参考样本的扩增条件
该反应混合物事先在95℃静置1分钟，而实际的扩增反应会按照下列流程进行50个循环：
95℃ 1sec.→65℃ 1sec
图1绘示了所述PCR产物，即结构性蛋白VP2，在琼脂凝胶上的相对位置。其中，“H”表示健康样本，该“M”表示标记(marker)。其证实利用给定引物进行PCR确实在野生型样本和疫苗型样本上都未表现或是较少出现的交叉反应性，或者是非特异性序列的扩增。
图2绘示了给定引物和给定探针的动力学PCR的生长曲线。当CPV2a，CPV2b和CPV2c的生长曲线超过阈值时，即可检测到明确和特定的信号。换句话说，如果样本包含有结构性蛋白VP2的序列，则会在动力学PCR生长曲线中显示一上升曲线。同时，由于引物与探针对健康样本的序列不具特异性，因此不会检测到健康样本的信号。
实施例2：通过Taqman探针而以SNP 36鉴别野生型与疫苗型
A.特异性与灵敏度试验
为了验证以SNP 36鉴别野生型与疫苗型的特异性和灵敏度，需要以已知拷贝数的序列进行测试。其中，所述序列是通过以下步骤制备：1、分别将野生型和疫苗型的SNP 36的对应区域克隆到指定的载体中；2、将这两因子(factors)转殖至大肠杆菌(E.coli)内；3、提取质粒DNA；4、通过PCR或测序确认序列是否正确。
制备野生型的结构性蛋白VP2的SNP 36(以下称为野生型样本)的四个连续单次稀释液，其拷贝数为104、103、102与101，以及疫苗型的结构性蛋白VP2的SNP 36(以下称为疫苗型样本)的三个连续单次稀释液，其拷贝数为108、107与106。
通过用于正向引物并具有SEQ ID No.8的引物、用于反向引物并具有SEQ IDNo.11的引物、以及具有SEQ ID No.14的探针扩增野生型样本以及疫苗型样本。所述引物和探针的序列如表4所示。
正向引物可替换为SEQ ID No.9或10，反向引物可替换为SEQ ID No.12或13，且探针可替换为SEQ ID No.15。其中，扩增的条件与前述实施例1大体相同。
表4：引物序列
表5：扩增SNP 36的条件
图3绘示了所述PCR产物，即结构性蛋白VP2的SNP 36，在琼脂凝胶上的相对位置。其中，“NTC”(“N”)表示阴性对照，“M”表示标记。其证实利用给定引物进行PCR确实在野生型样本和疫苗型样本上都未表现或是较少出现的交叉反应性，或者是非特异性序列的扩增。
图4绘示了给定引物和给定探针的动力学PCR生长曲线。本实施例中的给定探针对于野生型的SNP 36具特异性。如前所述，因野生型的核酸为“G”，是以，所述探针是互补于“G”。据此，当样本号为1至4的生长曲线超过阈值时，则开始检测到明确和特定的信号。同时，由于所述探针对于“A”不具特异性(该疫苗型的SNP 36的核酸为“A”)，因此不会检测到样本号为5至7的信号。
本实施例的侦测极限(LOD)在鉴别野生型与疫苗型上可以达到101拷贝。此外，鉴别窗口可以达到108拷贝，因此，其特异性相对较高。
B.实体样本试验
在本实施例中，是使用四个实体样本以及两个疫苗株(Duramune与Vanguard)。同样通过AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA分离该四个实体样本的病毒DNA。在本实施例和以下实施例中，为模拟经接种疫苗的犬只的序列型式而使用疫苗株。
引物序列、探针序列以及扩增条件皆与特异性和灵敏度试验相同。所述疫苗株是在不稀释的情况下进行扩增。
表6：实体样本SNP 36的扩增条件
如图5所示，当它们的生长曲线超过阈值时，可以检测到四个实体样本。因此，由于它们具有结构性蛋白VP2的序列，所述四个实体样本为野生型。另一方面，即使两个疫苗株具有高力价，也未能被检测到。
实施例3：通过Taqman探针而以SNP 899与SNP 963鉴别野生型与疫苗型
在本实施例中，是使用分别被CPV2a、CPV2b与CPV 2c感染的20个实体样本和两个不同的疫苗株(Duramune与Vanguard)。并利用AxyPrep Body Fluid VirusDNA/RNA分离出所述20个实体样本的病毒DNA。
通过用于正向引物并具有选自于SEQ ID No.17的30个连续核甘酸的引物、用于反向引物并具有SEQ ID No.22的引物、用于SNP 899并具有SEQ ID No.24的探针、以及用于SNP 963并具有SEQ ID No.29的探针，扩增野生型样本以及疫苗型样本。所述引物与探针的序列如表7所示。扩增的条件如表8所示。其中，所述疫苗株是在不稀释的情况下用于进行扩增。
正向引物可替换为SEQ ID No.18、19、20或21，反向引物可替换为SEQ ID No.23，用于SNP 899的探针可替换为SEQ ID No.25、26、27或28，且用于SNP 963的探针可替换为SEQ ID No.30、31、32或33。其中，扩增的条件与前述实施例1大体相同。
表7：引物与探针序列
表8：扩增SNP 899与SNP 963的条件
如图6所示，在所述20个实体样本中，SNP 899和SNP 963均为阳性，表示这些样本皆被感染。对比图6与图7所示，若样本为曾接种疫苗者，仅有一个荧光信号可被检测到。如图7左侧所示，其表示由于SNP 963的核苷酸“T”与野生型相同，且SNP 899的核苷酸为“C”与野生型不相同，因此，可检测到SNP 963，而不可检测到SNP 899。另一方面，如图7右侧所示，其表示由于SNP 899的核苷酸“G”与野生型相同，且SNP 963的核苷酸为“A”与野生型不相同，因此，可检测到SNP 899，而不可检测到SNP 963。
据此，若检测到两种不同的荧光信号表示为野生型。若仅检测到单一种荧光，表示为疫苗型。
实施例4：通过免疫色谱测定来检测CPV2a、CPV2b与CPV2c
在本实施例中，是使用一CPV2a感染样本，一CPV2b感染样本，一CPV2c感染样本以及一健康样本。利用AxyPrep Body Fluid Virus DNA/RNA分离DNA。使用具有SEQ ID No.34与SEQ ID No.3的引物扩增结构性蛋白VP2的2a、2b与2c序列。所述引物与该探针如表9所示。探针可以替换为SEQ ID No.5或SEQ ID No.6。在本实施例中，引物与探针的标记与实施例1中所用不同。其中，正向引物的5’端带有DIG，且探针的3’端带有FITC，其有色颗粒则是胶体金。
表9：引物序列
所述扩增反应是在BioRad CFX Connect Real-time System(BioRadLaboratories,Inc.)的实时测量与监控下进行。各反应混合物的体积为20微升，且其是在下表10记载的条件下进行扩增：
表10：参考样本的扩增条件
所述反应混合物事先在95℃静置1分钟，而实际的扩增反应会按照下列流程进行50个循环：
95℃ 1sec.→65℃ 1sec
图8绘示了PCR产物，即结构性蛋白VP2，在琼脂凝胶上的相对位置。其中，“H”表示该健康样本。其证实利用给定引物进行PCR确实在野生型样本和疫苗型样本上都未表现或是较少出现的交叉反应性，或者是非特异性序列的扩增。
图9绘示了给定引物和给定探针的侧向流动。当CPV2a、CPV2b、CPV2c的DIG与抗DIG和胶体金相遇时，则开始见到明确和特定的有色颗粒。换句话说，如果样本包含有结构性蛋白VP2的序列，则可在条带上见到有色线。同时，由于引物与探针对健康样本的序列不具特异性，因此，无法看见健康样本的着色线。
实施例5：通过免疫色谱测定而以SNP 36鉴别野生型与疫苗型
在本实施例中，是使用三种野生型样本和三种疫苗中。同样通过AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA分离所述三个实体样本的病毒DNA。为模拟经接种疫苗的犬只的序列型式，因而在本实施例和以下实施例中使用疫苗株。本实施例所使用的引物与探针的标记与前述实施例2不同。其中，正向引物的5’端带有DIG，且探针的3’端带有FITC，有色颗粒则是胶体金。引物序列、探针序列以及扩增条件如下表11、表12所列。
表11：引物序列
于所述扩增反应中加入PNA，以提升其特异性。所述疫苗株是在不稀释的情况下用于进行扩增。
表12：实体样本SNP 36的扩增条件
图10绘示了所述PCR产物，即结构性蛋白VP2的SNP 36，在琼脂凝胶上的相对位置。样本数1、3、5为实体样本，样本数2、4、6则来自于疫苗株。其证实利用给定引物进行PCR确实在野生型样本和疫苗型样本上都未表现或是较少出现的交叉反应性，或者是非特异性序列的扩增。
图11绘示了给定引物和探针的侧向流动。如前所述，所述引物与探针对于野生型的SNP 36具特异性。因此，样本数1、3与5的DIG与抗DIG和胶体金相遇时，则开始可见明确和特定的有色颗粒。换句话说，如果样本包含SNP 36的序列，则可在条带上见到有色线。同时，由于所述引物与探针对其序列不具特异性，无法看见所述疫苗株的着色线，即样本数2、4与6。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 克雷多生物医学私人有限公司
<120> 检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法
<130> GAI17TW1877
<150> US 15/371,223
<151> 2016-12-07
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> 犬细小病毒(canine parvovirus)
<400> 1
atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcagcctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60
acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120
tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180
atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240
agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300
actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360
tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420
tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480
ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540
aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600
aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660
tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720
gttcaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780
tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840
acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900
actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960
aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020
ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080
cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140
ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200
atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260
aaccttcctg taacagatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320
ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380
ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440
agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gccctggtca attatttgta 1500
aaagttgcgc ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560
attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620
gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatta atgtagataa ccaatttaac 1680
tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaaa attgtctatg aaaaatctca actagcacct 1740
agaaaattat actaa 1755
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 60
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VP2的反向引物
<400> 3
cctccaattg gatctgttgg tagcaatac 29
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 4
gattcaaaat attaac 16
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 5
tggattcaaa atattaac 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 6
gattcaaaat attaactt 18
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcag 36
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36的正向引物
<400> 8
atgagtgatg gagcagttca acca 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36的正向引物
<400> 9
tgagtgatgg agcagttcaa cca 23
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36的正向引物
<400> 10
gagtgatgga gcagttcaac cagacgg 27
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36的反向引物
<400> 11
gtacccgtag aaatccccac acccccagaa c 31
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36的反向引物
<400> 12
gaaagtaccc gtagaaatcc ccacaccc 28
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36的反向引物
<400> 13
gtacccgtag aaatccccac acccccag 28
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36 探针
<400> 14
cagcaggctg accacc 16
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 36 探针
<400> 15
cagcaggctg accac 15
<210> 16
<211> 961
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcagcctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60
acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120
tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180
atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240
agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300
actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360
tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420
tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480
ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540
aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600
aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacct 660
ctcatactgg aactagtggc acaccaacaa atatatacca tggtacagat ccagatgatg 720
ttcaatttta tactattgaa aattctgtgc cagtacactt actaagaaca ggtgatgaat 780
ttgctacagg aacatttttt tttgattgta aaccatgtag actaacacat acatggcaaa 840
caaatagagc attgggctta ccaccatttc taaattcttt gcctcaagct gaaggaggta 900
ctaactttgg ttatatagga gttcaacaag ataaaagacg tggtgtaact caaatgggaa 960
a 961
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 17
caaacaaata gagcattggg cttaccacca 30
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 18
ggcttaccac catttctaaa ttctttgcct ca 32
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 19
caaacaaata gagcattggg cttaccacca 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 20
tctttgcctc aagctgaagg aggtactaac 30
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 21
tctttgcctc aagctgaagg aggtac 26
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 22
gcactataac caacctcagc tggtctcata 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 23
acaccacgtc ttttatcttg ttgaactcct 30
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 24
ctgaaggagg tactaacttt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 899 探针
<400> 25
ctgaaggagg tactaacttt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 899 探针
<400> 26
tgaaggaggt actaactttg 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 27
ctgaaggagg tactaacttt g 21
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 899 探针
<400> 28
agctgaagga ggtactaact ttgg 24
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 963 探针
<400> 29
tcaaatggga aatacaaact ata 23
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 963 探针
<400> 30
caaatgggaa atacaaacta t 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 963 探针
<400> 31
tcaaatggga aatacaaact ata 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 963 探针
<400> 32
tcaaatggga aatacaaact ata 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP 963 探针
<400> 33
actcaaatgg gaaatacaaa ctat 24
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VP2的正向引物
<400> 34
ctaccacaac aggagaaaca cctgagag 28

Claims (29)

1.一种检测样本内包含犬细小病毒2a、犬细小病毒2b或犬细小病毒2c的结构性蛋白VP2核酸的目标核酸的方法，其特征在于包含：
(a)提供样本，其包含CPV2a、CPV2b或CPV2c的目标核酸；
(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ IDNo.2所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由选自于SEQ ID No.3所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中探针的序列是选自于由SEQ ID No.4至6组成的群组；以及
(e)检测杂交体产生的信号，以判定样本中包含有目标核酸。
2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物及/或所述探针包含修饰后核酸或非核酸化合物。
3.依据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杂交体产生的信号包含荧光信号。
4.依据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述探针的5’端具有荧光报导子，该荧光报导子是选自由FAM、HEX、VIC、CY5及TET组成的群组，所述探针的3’端具有荧光淬灭子，该荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB及BHQ组成的群组。
5.依据权利要求4所述的方法，其特征在于，出现荧光信号表示样本中具有目标核酸，未出现荧光信号表示样本中不具有目标核酸。
6.依据权利要求5所述的方法，其特征在于，通过DNA依赖性聚合酶的外切核酸酶水解，将荧光报告物的片段自与目标核酸杂交的探针上切割下来，并通过荧光报告物的片段数量来侦测荧光信号。
7.依据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述信号包含分析物，该分析物在经侧流免疫分析后为肉眼可见的有色颗粒。
8.依据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一引物或第二引物的5’端带有一抗原，该抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas-red及Tamra组成的群组，所述探针的3’端具有另一抗原，该另一抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas-red及Tamra组成的群组。
9.依据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述有色颗粒是选自由胶体金、乳胶及纳米碳粒组成的群组。
10.依据权利要求9所述的方法，其特征在于，出现分析物信号表示样本中具有目标核酸，未出现分析物信号表示样本中不具有目标核酸。
11.一种鉴别样本内目标核酸为犬细小病毒野生型或疫苗型的方法，其特征在于包含：
(a)提供样本；
(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ IDNo.7所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由选自于SEQ ID No.11、12或13所示互补核酸序列的至少12个连续的核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标核酸；
(d)黏合SNP探针至目标核酸，以在进行(c)步骤时形成杂交体，其中SNP探针对于CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2的基因的SNP 36具特异性，且SNP探针的序列包含SEQ ID No.14或15；以及
(e)侦测杂交体产生的信号，以判定样本中包含有目标核酸。
12.依据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一引物是选自于由SEQ ID No.8至10所组成的群组。
13.依据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述引物及/或所述SNP探针包含修饰后核酸或非核酸化合物。
14.依据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述杂交体产生的信号包含荧光信号。
15.依据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述SNP探针的5’端具有荧光报导子，该荧光报导子是选自由FAM、HEX、VIC、红光CY5及TET组成的群组，所述SNP探针的3’端具有荧光淬灭子，该荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB及BHQ组成的群组。
16.依据权利要求15所述的方法，其特征在于，出现荧光信号表示为野生型，未出现荧光信号表示为疫苗型。
17.依据权利要求16所述的方法，其特征在于，通过DNA依赖性聚合酶的外切核酸酶水解，将荧光报告物的片段自与目标核酸杂交的探针上切割下来，并通过荧光报告物的片段数量来侦测荧光信号。
18.依据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述疫苗型是指样本曾经接种过任一疫苗，该疫苗是选自由Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac PuppyDP、Canine 6II-SL、Eurican5及Virbagen DA2Parvo组成群组中的一个。
19.依据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述信号包含分析物，该分析物在经侧流式免疫分析后为肉眼可见的有色颗粒。
20.依据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第一引物或第二引物的5’端具有一抗原，该抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas-red及Tamra组成的群组，所述SNP探针的3’端具有另一抗原，该另一抗原是选自由FITC、DIG、Biotin、Texas-red及Tamra组成的群组。
21.依据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述有色颗粒是选自由乳胶金、乳胶及纳米碳粒组成的群组。
22.依据权利要求21所述的方法，其特征在于，出现分析物信号表示样本中具有目标核酸，未出现分析物信号表示样本中不具有目标核酸。
23.一种鉴别样本内目标为犬细小病毒野生型或疫苗型的方法，其特征在于包含：
(a)提供样本；
(b)提供引物对，该引物对包含第一引物与第二引物，第一引物是由选自于SEQ IDNo.16所示核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成，第二引物是由12个选自于SEQ IDNo.22或23所示互补核酸序列的至少12个连续核酸序列所组成；
(c)利用模板依赖性聚合酶扩增目标；
(d)黏合P1探针与P2探针至目标核酸，以在进行步骤(c)时形成杂交体，其中P1探针对CPV2a、CPV2b与CPV2c的结构性蛋白VP2基因的SNP 899具特异性，P2探针对CPV2a、CPV2b与CPV2c的VP2基因的SNP 963具特异性，且P1探针包含选自由SEQ ID No.24至27组成的群组，P2探针包含选自由SEQ ID No.29至33组成的群组；以及
(e)侦测杂交体产生两种不同的荧光信号。
24.依据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一引物是选自于由SEQ ID No.17至21所组成的群组。
25.依据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述P1探针及P2探针的5’端各具有荧光报导子，各荧光报导子是选自由FAM、HEX、VIC、CY5及TET组成的群组且彼此不相同，所述P1探针及P2探针的3’端各具有荧光淬灭子，各荧光淬灭子是选自由TMARA、MGB及BHQ组成的群组。
26.依据权利要求25所述的方法，其特征在于，出现两种荧光信号表示为野生型，出现两种荧光信号的任一种表示为疫苗型。
27.依据权利要求26所述的方法，其特征在于，通过DNA依赖性聚合酶的外切核酸酶水解，将荧光报告物的片段自与目标核酸杂交的探针上切割下来，并通过荧光报告物的片段数量来侦测荧光信号。
28.依据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述引物及/或所述P1探针、P2探针包含修饰后核酸或非核酸化合物。
29.依据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述疫苗型是指样本曾经接种过任一疫苗，该疫苗是选自由Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac PuppyDP、Canine 6II-SL、Eurican5及Virbagen DA2Parvo组成的群组中的一个。
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