JP6936835B2 - Cpv2a、2b及び2cを検出する方法及び野生型をワクチン型から識別する方法 - Google Patents

Cpv2a、2b及び2cを検出する方法及び野生型をワクチン型から識別する方法 Download PDF

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Description

本発明は、イヌ試料におけるCPV2a、2b、2c検出方法に関する。特に、本発明は、ワクチン型を野生型から識別することに関する。
イヌパルボウイルス2型(以下CPV−2)感染は、重度の白血球減少、嘔吐、体重減少、食欲の欠如(食欲不振)及び血性下痢によって特徴づけられる、イヌに影響を与え且つイヌからイヌへと非常に感染力の高いウイルス性の病気である。感染は、ウイルス含有排泄物との直接の経口又は経鼻接触を介して、又は、ウイルス汚染媒介物との接触を介して間接的に得られる。頻繁に起こるように、イヌは自然感染を介してCPVを得て、さらに、CPV感染の例の大部分は、6週間から6カ月の週齢又は月齢の子犬において見られる。CPV−2感染は、実験用のイヌ及びペット用のイヌの増加により、最近世界中でイヌの重大な問題であるとして現れている。
CPV−2のゲノムは、長さが5.2Kbのサイズの一本鎖のマイナスセンスDNAであり、ウイルスmRNAの選択的スプライシングを介して3つの構造タンパク質(VP1、VP2及びVP3)及び2つの非構造タンパク質(NS1及びNS2)の発現をもたらす2つのプロモーターを有する。VP2(64kDa)は、VP1(84kDa)のNH末端切断型であり、さらに、抗原性の重要要素であるカプシドの主要構成成分(90%)である。CPV−2は1970年代後半に現れたが、ここ数年、その抗原変異体に取って代わられた。現在、CPV−2の3つの主要な抗原変異体が、2a、2b、2c型(以下CPV−2a、CPV−2b及びCPV−2c)として知られ、さらに、世界中のイヌ集団においてさまざまに分布している。最初の2型は、現場からは消えたけれども、市場で入手可能なCPV−2ワクチンにおいて依然として存在している。
ウイルスは、感染後4〜5日以内に感染したイヌの排泄物内に排出され、これは、臨床徴候が生じる前であることが多くある。ウイルス排出は、臨床的回復の約10日後まで、病気の間ずっと検出することができる。従って、排泄物試料は、一般的に、診断テストにおいて使用される。診断テストは、HA(赤血球凝集)、電子顕微鏡(EM)、MDCK、CRFK又はA72の細胞株で用いるウイルス単離、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラテックス凝集テスト(LAT)、蛍光抗体テスト(FAT)、CIEテスト、ウイルス中和テスト、PCR、リアルタイムPCR、ループ介在等温増幅(LAMP)、核酸ハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション及び核酸配列決定を含み、そのそれぞれが、さまざまな程度の感受性及び特異性を有し、さらに、偽陽性の例をもたらす場合がある。上述の診断テストの中でも、PCR及びリアルタイムPCRが、最も一般的に使用され、且つ、比較的高い精度及び特異性の、CPV−2a、CPV−2b及びCPV−2cの診断方法である。
CPV−2a、CPV−2b及びCPV−2cの感染の発生率は、若い子犬における早期のワクチン接種によって急激に減ってきている。一部の人気のワクチンは、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoである。しかし、CPV−2a、CPV−2b及びCPV−2cの診断は、ワクチン接種の数日後に下痢を示すイヌからの糞便試料に対して実行された場合に不明瞭であり得る。実際、ワクチン内に含有された修飾生ウイルスは、非天然の投与経路にもかかわらず、ワクチン接種されたイヌの腸管粘膜内で増殖することができ、さらに、野生型の鎖に関して低い力価で且つ短い期間はあるが、排泄物内に排出され得る。そのような状況において、ワクチン接種されたイヌの排泄物内のCPV−2a、2b及び2cの核酸の検出は偽陽性であり得、感染の誤診をもたらし得る。
CN105838826 CN105803112
Decaro et al.,"Diagnostic tools based on minor groove binder probe technology for rapid identification of vaccinal and field strains of canine parvovirus type 2b."Journal of Virological Methods 138(2006),P.10−16,Epub 2006 Sep 5. Decaro et al.,"Long−term viremia and fecal shedding in pups after modified−live canine parvovirus vaccination"Vaccine 32(2014)3850−3853 Decaro et al.,"A minor groove binder probe real−time PCR assay for discrimination between type 2−based vaccines and field strains of canine parvovirus",JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS,136(2006),P.65−70
上述の状況により、CPV−2a、CPV−2b及びCPV−2cを検出するため、及び、野生型をワクチン型から識別するための高い精度及び安定性のアッセイを開発することが必要である。
本発明の目的は、上記の従来技術の不利益を克服する、CPV−2a、2b及び2cのVP2遺伝子の標的核酸の検出方法を提供することである。本発明の目的は、特に、標的核酸が指定のプローブ、標的核酸に特異的なプライマーの対、及び、エキソヌクレアーゼ加水分解の能力を有する鋳型依存性ポリメラーゼを用いて増幅される、標的核酸を検出する方法を提供することである。この目的は、疑わしい試料内の標的核酸を検出する方法によって本発明に従い達成され、当該方法は、以下のステップ、すなわち:
(a)CPV2a、2b及び2c型のVP2の標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
(b)順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、VP2遺伝子の核酸配列の配列番号34から選択された核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列の配列番号3から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて標的核酸を増幅させるステップと、
(d)ステップ(c)の間に標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、プローブの配列は、配列番号4を含む群から選択される、ステップと、
(e)CPV2a、2b及び2c型の標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
本発明によると、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、蛍光検出システムによってもラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによっても検出することができる。信号が、蛍光検出システム又はラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによって検出される場合、信号の存在は、疑わしい試料内のCPV2a、2b及び2cの存在を示し、さらに、信号の欠如は、疑わしい試料内のCPV2a、2b及び2cの欠如を示す。
本発明の第2の目的は、野生型をワクチン型から識別する2つの方法を提供することである。この目的を達成するための第1の方法は、SNP36によって野生型をワクチン型から識別することである。標的核酸は上述のプローブ、標的核酸に特異的なプライマーの対、及び、エキソヌクレアーゼ加水分解の能力を有する鋳型依存性ポリメラーゼを用いて増幅される。この目的は、標的核酸を検出する方法によって本発明に従い達成され、当該方法は、以下のステップ、すなわち:
(a)CPV2a、2b及び2c型のVP2の標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
(b)順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列の配列番号11から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて標的核酸を増幅させるステップと、
(d)ステップ(c)の間に標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、プローブの配列は、配列番号14である、ステップと、
(e)標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、蛍光検出システムによってもラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによっても検出することができる。信号が、蛍光検出システム又はラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによって検出される場合、信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す。
この目的を達成するための第2の方法は、SNP899及びSNP963によって野生型をワクチン型から識別することである。増幅条件及び検出ステップは、以下の条件を除いて、SNP36と同じである。
(a)順方向プライマー:核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む。
(b)逆方向プライマー:相補的な核酸配列の配列番号22から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む。
(c)プローブ:第1のプローブはVP2遺伝子のSNP899に特異的であり、さらに、第2のプローブはVP2遺伝子のSNP963に特異的である。第1のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号24であり、さらに、第2のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号29である。
ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、蛍光検出システムによって検出することができる。異なる信号両方の存在がワクチン型を示し、異なる蛍光信号のうちいずれか1つの存在がワクチン型を示す。
この概要は、本発明の一部の態様を手短に明らかにするために提供されており、本発明の一部の態様は、以下に詳細な説明においてさらに記載される。この概要は、本開示の鍵となる又は本質的な特徴を明らかにするようには意図されず、又は、特許請求の範囲を限定するようには意図されない。
「態様」という用語は、「少なくとも1つの態様」として読まれることになる。本明細書において記載される本開示の上記の態様及び他の態様は、1つ又は複数の例として例示されており、付随の図面において限定されない。
本発明の上記及び他の目的が、種々の図及び図面において例示されている以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読んだ後で、当業者には疑問の余地なく明らかになる。
アガロースゲル電気泳動によって実施形態1から得られる増幅生成物を例示した図である。 実施形態1の動態学的なPCRの増殖曲線を例示した図である。 アガロースゲル電気泳動によって実施形態2から得られる増幅生成物を例示した図である。番号1〜4は野生型の試料であり、さらに、番号5〜7はワクチン型の試料である。NTCは、ネガティブコントロールを表している。 実施形態2の動態学的なPCRの増殖曲線を例示した図である。番号1〜4は野生型の試料であり、さらに、番号5〜7はワクチン型の試料である。NTCは、ネガティブコントロールを表している。 実施形態2の動態学的なPCRの増殖曲線を例示した図である。番号1〜4は基準試料であり、さらに、番号5〜6はワクチンバルク由来のものである。NTCは、ネガティブコントロールを表している。 実施形態3のSNP899とSNP963との組み合わせの動態学的なPCRの増殖曲線を例示した図である。20の基準試料は、SNP899に対してもSNP963に対しても全て陽性である。 実施形態3のSNP899とSNP963との組み合わせの動態学的なPCRの増殖曲線を例示した図である。VanguardのバルクはSNP963に対してのみ陽性であり、さらに、DuramuneのバルクはSNP899に対してのみ陽性である。 アガロースゲル電気泳動によって実施形態4から得られる増幅生成物を例示した図である。 実施形態4のラテラルフローを例示した図である。 アガロースゲル電気泳動によって実施形態5から得られる増幅生成物を例示した図である。 実施形態5のラテラルフローを例示した図である。
以下は、本発明の原理を例示しているだけである。従って、当業者は、種々のアレンジメントを考案することができ、種々のアレンジメントは、本明細書において明確に記載又は示されてはいないけれども、本発明の原理を具体化し且つその真意及び範囲に含まれるということが正しく理解されることになる。
さらに、本明細書において記載される全ての例及び条件としての言葉は、主として、本開示の原理及び本発明者等によって寄与される概念を理解して当技術分野を助成することにおいて読み手に寄与するように教育学的目的のためだけにあるとして明確に意図され、さらに、限定されることなく、特に記載される例及び条件であると解釈されることになる。
さらに、本開示の原理、態様及び実施形態を記載した本明細書における全ての記述、並びに、その特定の例は、その構造的同等物も機能的同等物も包含するとして意図される。加えて、そのような同等物は現在既知の同等物も、将来開発される同等物、すなわち、後に開発される、構造に関係なく同じ機能を行ういかなる要素も含むということが意図される。
本明細書において特に明確に定めのない限り、図面は一定の縮尺で描かれていない。
上述の疑問を解決するために、本発明は、マイナーグルーブバインダー(MGB)リガンドが結合したTaqManプローブを使用したCPV2a、2b及び2cの迅速な同定のためのPCR又はリアルタイムPCRアッセイを提供する。
そのようなアッセイにおいて、異なる蛍光レポーターで型特異的プローブを標識することは、型特異的な蛍光の検出を確実にしてきた。このアッセイにおいて適用されるTaqポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ加水分解機能を有したDNA依存性ポリメラーゼである。DNA依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ加水分解によって標的核酸にハイブリダイズされたプローブから切断された蛍光信号は、蛍光レポーターの断片の量によって検出される。プライマー及び/又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む。
本発明の一実施形態において、試料内のCPV2a、2b及び2cの核酸配列を含む標的核酸を検出する方法が提供され、当該方法は:
(a)CPV2a、2b及び2c型のVP2の標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
(b)順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、VP2遺伝子の核酸配列の配列番号34から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列の配列番号3から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて標的核酸を増幅させるステップと、
(d)ステップ(c)の間に標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、プローブの配列が、配列番号4を含む群から選択される、ステップと、
(e)CPV2a、2b及び2c型の標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
VP2は、CPV2a、2b及び2cの保存された領域のため、本発明において開示された全てのプライマー及びプローブは、VP2遺伝子から選択される。より正確に言えば、CPV2a、2b及び2cの検出のための順方向プライマーは、VP2遺伝子の一部である核酸配列の配列番号34から選択された核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーは、相補的な核酸配列の配列番号3から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む。配列番号4であるプローブも、VP2遺伝子に特異的である。蛍光信号の存在は、試料内のCPV2a、2b又は2cを示す。
本発明は、VP2遺伝子のSNP36、SNP899及びSNP963を検出することによって、野生型をワクチンから識別する方法も開示している。SNP36に関して、ヌクレオチドは、野生型に対してはGであり、さらに、ワクチン型に対してはAであり、ここで、ワクチン型は、試料が、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種されているということを意味している。さらに、SNP899に対して、ヌクレオチドは、野生型及びDuramune MX5に対してはGであり、さらに、ワクチン型に対してはCであり、ここで、ワクチン型は、試料が、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種されているということを意味している。最後に、SNP963に関して、ヌクレオチドは、野生型、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen及びDA2Parvoに対してはTであり、さらに、ワクチン型に対してはAであり、ここで、ワクチン型は、試料が、Duramune MX5でワクチン接種されているということを意味している。上述のワクチンのCPVのTICD50は、10コピー以上である。従って、本発明の野生型に特異的なプライマー及びプローブが設計される。
Figure 0006936835
本発明の別の実施形態において、SNP36によって野生型をワクチン型から識別する方法が提供され、当該方法は:
(a)標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
(b)順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列の配列番号11から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて対象を増幅させるステップと、
(d)ステップ(c)の間に標的核酸に対してSNPプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、SNPプローブは、VP2遺伝子のSNP36に特異的であり、さらに、SNPのプローブの配列は、配列番号14である、ステップと、
(e)標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
SNP36は、野生型をワクチン型から識別するために単独で適用することができる。SNP36の順方向プライマーは、核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含むか、又は、配列番号8の群から選択されたものである。逆方向プライマーは、配列番号11の群から選択されたものである。プローブは、配列番号14の群から選択されたものである。プローブは、FAM、HEX、VIC、CY5又はTETを含む群から選択された蛍光レポーターも保有しており、さらに、プローブの3´末端は、TMARA、MGB又はBHQを含む群から選択されたクエンチャーを保有している。蛍光信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す。ワクチン型は、イヌが、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種されているということを意味している。蛍光信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す。
本発明のさらに別の実施形態において、SNP899とSNP963との組み合わせによって、野生型をワクチン型から識別する方法が提供され、当該方法は:
(a)VP2を含有していると疑われる対象を提供するステップと、
(b)順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列の配列番号22から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて対象を増幅させるステップと、
(d)ステップ(c)の間に標的核酸に対して2つのプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、2つのプローブのうち1つはVP2遺伝子のSNP899に特異的であり、さらに、もう1つのプローブはVP2遺伝子のSNP963に特異的であり、1つのプローブのヌクレオチド配列は、配列番号24であり、さらに、もう1つのプローブのヌクレオチド配列は、配列番号29である、ステップと、
(e)ハイブリダイズされた生成物から生じる2つの異なる蛍光信号を検出するステップと、
を含む。
順方向プライマーは、少なくとも連続している12のヌクレオチドを含むか、又は、配列番号17から選択されたものである。逆方向プライマーは、配列番号22から選択されたものである。2つのプローブの5´末端も、FAM、HEX、VIC、CY5又はTETを含む群から選択された異なる蛍光レポーターを保有しており、さらに、プローブの3´末端は、TMARA、MGB又はBHQを含む群から選択されたクエンチャーを保有している。
SNP899のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号24であり、さらに、SNP963のプローブのヌクレオチド配列は、配列番号29である。蛍光信号両方の存在が野生型を示し、蛍光信号のうちいずれか1つの存在がワクチン型を示す。ワクチン型は、イヌが、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種されているということを意味している。異なる蛍光信号両方の存在は野生型を示し、さらに、異なる蛍光信号のうちいずれか1つの存在はワクチン型を示す。蛍光信号両方の欠如は、非感染又は低いウイルス負荷の試料を示す。
TaqManプローブを使用した本発明は従来の方法よりも感受性が高く、ここで、本発明の検出の限界(以下LOD)は、CPV2a、2b、2cの検出に対しても、野生型/ワクチン型の識別に対しても10コピーに達し得る。さらに、CPV2a、2b、2cの検出及び野生型/ワクチン型の識別の特異性は、識別窓(discrimination window)が10コピーに達し得るため、比較的高い。従って、本発明は、迅速且つ明確なCPV2a、2b及び2cの検出及び野生型のワクチン型からの識別に適している。
本発明は、CPV2a、2b及び2cを迅速に同定するラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイも提供する。テスト結果を、着色された粒子によって視覚的に観察することができる。そのようなアッセイにおいて、異なる抗原で型特異的プローブを標識することは、型特異的な分析物の検出を確実にしてきた。順方向プライマー又は逆方向プライマーのプライマー及び/又はプローブのc5´末端は、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された抗原を保有し、さらに、プローブの3´末端は、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された第1又は第2のプライマーとは異なる抗原を保有している。着色された粒子は、コロイド金、ラテックス及びカーボンナノ粒子の群から選択される。
プライマー及びプローブ両方の配列、検出ステップ及び増幅条件は、順方向プライマーの量が逆方向プライマーよりも少ない、及び、PNAが増幅ステップに添加され且つ関与するということを除いて、CPV2a、2b及び2c検出のTaqManプローブ検出方法と同じである。
増幅ステップが行われた後で、分析物はストライプ上に添加され、イムノクロマトグラフィーアッセイを開始させる。テストライン内の分析物信号の存在は、試料内のCPV2a、2b及び2cの存在を示し、さらに、テストライン内の分析物信号の欠如は、CPV2a、2b及び2cの欠如を示す。
さらに、本発明は、野生型をワクチン型から識別するラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイも提供する。プライマー及びプローブ両方の配列、検出ステップ及び増幅条件は、順方向プライマーの量が逆方向プライマーよりも少ない、及び、PNAが増幅ステップに添加され且つ関与するということを除いて、SNP36検出と同じである。増幅ステップが行われた後で、分析物はストライプ上に添加され、イムノクロマトグラフィーアッセイを開始させる。テストライン内の分析物信号の存在は野生型の存在を示し、さらに、テストライン内の分析物信号の欠如はワクチン型を示す。
ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイを使用した本発明は従来の方法よりも感受性が高く、ここで、本発明の検出限界は、CPV2a、2b、2cの検出に対しても、野生型/ワクチン型の識別に対しても10コピーに達し得る。加えて、本発明は、ワクチン力価は比較的高い(10コピー)けれどもCPV2a、2b、2c又はSNP36を依然として検出することができるため、特異的でもある。従って、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイを使用した本発明は、迅速且つ明確なCPV2a、2b及び2cの検出及び野生型のワクチン型からの識別に適している。
実施形態1 TaqManプローブによるCPV2a、2b及び2cの検出
好ましくは、本発明は、試料調製のステップを含まない。疑わしい試料からの標的核酸を含む核酸の精製又は単離の後で、標的核酸が異なる条件で検出されてもよい。
1つのCPV2a感染試料、1つのCPV2b感染試料、1つのCPV2c感染試料及び1つの健康な試料が実施形態1において使用される。AXYGEN(登録商標)AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNAを使用することによってDNAを単離した。配列番号34及び配列番号3を有するプライマーを使用して、VP2 2a、2b及び2cの配列を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表2において示されている。
Figure 0006936835
増幅反応が実行され、BioRad CFX Connect Real−time System(BioRad Laboratories,Inc.)においてリアルタイムで測定し且つモニターした。それぞれの反応混合物の量は20μlであり、以下の条件下で増幅させた。
Figure 0006936835
反応混合物を、第一に、1分間95℃にてインキュベートした。実際の増幅反応を、以下のスキームに従って50サイクル行った。
95℃ 1秒→65℃ 1秒
図1は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちVP2のPCR産物を示している。「H」は健康な試料を表し、さらに、「M」はマーカーを表している。図1は、所与のプライマーを用いたPCR反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
図2は、所与のプライマーの対及びプローブに対する動態学的なPCRの増殖曲線を示している。CPV2a、CPV2b及びCPV2cの増殖曲線が閾値を超える場合、明確且つ特異的な信号がはじめに検出可能である。言い換えると、試料がVP2配列を含有している場合、上昇曲線が、動態学的なPCRの増殖曲線に現れることになる。一方、プライマー及びプローブは健康な試料の配列に特異的ではないため、健康な試料の信号は検出可能ではない。
実施形態2 TaqManプローブによるSNP36を使用することによる野生型のワクチン型からの識別
A.特異性及び感受性のテスト
SNP36を使用することによって野生型をワクチン型から識別するための特異性及び感受性を検証するために、既知のコピー数を有する配列が、テストを行うために必要とされる。配列は、以下のステップ、すなわち:1.SNP36の対応する領域の野生型及びワクチン型を、それぞれ指定されたベクトル内にクローン化するステップ、2.これら2つの要素を大腸菌に形質転換するステップ、3.プラスミドDNAを抽出するステップ、4.PCR又は配列決定を用いて配列が正しいということを明らかにするステップによって調製される。
10、10、10、10のコピー数を有するVP2のSNP36の野生型の4つの連続的な単一の希釈物(以下、野生型試料)が調製され、さらに、10、10、10のコピー数を有するVP2のSNP36のワクチン型の3つの連続的な単一の希釈物(以下、ワクチン型試料)が調製される。
順方向プライマーに対して配列番号8を有するプライマー、逆方向プライマーに対して配列番号11を有するプライマー及び配列番号14を有するプローブを使用して、上述の野生型試料及びワクチン型試料を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表4において示されている。
増幅条件は、実施形態1と同じである。
Figure 0006936835
Figure 0006936835
図3は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちVP2のSNP36のPCR産物を示している。「NTC」はネガティブコントロールを表し、さらに、「M」はマーカーを表している。図3は、所与のプライマーを用いたPCR反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
図4は、所与のプライマーの対及びプローブに対する動態学的なPCRの増殖曲線を示している。この実施形態において与えられたプローブは、SNP36の野生型に特異的である。上述のように、ヌクレオチドが野生型に対してGであるため、プローブは「G」に相補的である。従って、試料番号1〜4の増殖曲線が閾値を超える場合、明確且つ特異的な信号がはじめに検出可能である。一方、プローブは、「A」に特異的ではなく、ここで、ヌクレオチドはSNP36のワクチンに対してAであるため、試料5〜7の信号は検出可能ではない。
この実施形態のLODは、野生型のワクチン型からの識別に対して10コピーに達し得る。さらに、特異性は、識別窓が10コピーに達し得るため、比較的高い。
B.基準試料のテスト
4つの基準試料及び2つのワクチンバルク(Duramune及びVanguard)が、この実施形態において使用される。4つの基準試料のウイルスDNAも、AXYGEN(登録商標)AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNAを使用することによって単離される。ワクチンバルクがこの実施形態及び以下の実施形態において使用される理由は、ワクチン接種されたイヌの配列型をシミュレートするためである。
プライマーの配列、プローブの配列及び増幅条件は、特異性及び感受性のテストと同じである。ワクチンバルクは、希釈なしで増幅を実行するために使用される。
Figure 0006936835
図5において示されているように、4つの基準試料は、その増殖曲線が閾値を超える場合に検出可能である。従って、これら4つの基準試料は、VP2配列を含有しているため、野生型である。一方、2つのワクチンバルクは、その力価が高い場合でさえも、検出可能ではない。
実施形態3 TaqManプローブによるSNP899及びSNP963を使用することによる野生型のワクチン型からの識別
それぞれCPV2a、2b及び2cによって感染された20の基準試料及び2つの異なるワクチンバルク(Duramune及びVanguard)が、この実施形態において使用される。20の基準試料のウイルスDNAも、AXYGEN(登録商標)AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNAを使用することによって単離される。
順方向プライマーに対して30の連続しているヌクレオチドを含む配列番号17を有するプライマー、逆方向プライマーに対して配列番号22を有するプライマー、及び、SNP899に対して配列番号24及びSNP963に対して配列番号29を有するプローブを使用して、上述の野生型試料及びワクチン型試料を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表7において示されている。増幅条件は表8において示されている。ワクチンバルクは、希釈なしで増幅を実行するために使用される。
増幅条件は、実施形態1と同じである。
Figure 0006936835
Figure 0006936835
図6において示されているように、SNP899もSNP963も20の基準試料に対して陽性であり、これらの試料が本当に感染しているということを意味している。図6とは対照的に、図7は、試料がワクチン接種された場合には1つの蛍光信号のみが検出されるであろうということを意味している。図7の左側には、ヌクレオチドが、SNP963において野生型と同じ「T」であり、さらに、ヌクレオチドが、野生型と同じではない「C」であるため、SNP963は検出可能であり、さらに、SNP899は検出可能ではないということが示されている。一方、図7の右側には、ヌクレオチドが、SNP899において野生型と同じ「G」であり、さらに、ヌクレオチドが、SNP963において野生型と同じではない「A」であるため、SNP899は検出可能であり、さらに、SNP963は検出可能ではないということが示されている。
従って、2つの異なる蛍光信号がどちらも検出可能である場合、野生型を示している。さらに、1つの信号のみが検出可能である場合、ワクチン型を示している。
実施形態4 イムノクロマトグラフィーアッセイによるCPV2a、2b及び2cの検出
1つのCPV2a感染試料、1つのCPV2b感染試料、1つのCPV2c感染試料及び1つの健康な試料が実施形態4において使用される。AXYGEN(登録商標)AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNAを使用することによってDNAを単離した。配列番号34及び配列番号3を有するプライマーを使用して、VP2 2a、2b及び2cの配列を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表2において示されている。この実施形態において使用されるプライマー及びプローブの標識は、実施形態1とは異なる。順方向プライマーの5´末端がDIGを保有し、さらに、プローブの3´末端がFITCを保有している。着色された粒子はコロイド金である。
Figure 0006936835
増幅反応が実行され、BioRad CFX Connect Real−time System(BioRad Laboratories,Inc.)においてリアルタイムで測定し且つモニターした。それぞれの反応混合物の量は20μlであり、以下の条件下で増幅させた。
Figure 0006936835
反応混合物を、第一に、1分間95℃にてインキュベートした。実際の増幅反応を、以下のスキームに従って50サイクル行った。
95℃ 1秒→65℃ 1秒
図8は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちVP2のPCR産物を示している。「H」は健康な試料を表している。図8は、所与のプライマーを用いたPCR反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
図9は、所与のプライマーの対及びプローブに対するラテラルフローを示している。CPV2a、CPV2b及びCPV2cのDIGが抗DIG及びコロイド金に会う場合、明確且つ特異的な着色された粒子がはじめに可視である。言い換えると、試料がVP2配列を含有している場合、着色された線が、ストリップ上で可視であり得る。一方、プライマー及びプローブは健康な試料の配列に特異的ではないため、健康な試料の着色された線は可視ではない。
実施形態5 イムノクロマトグラフィーアッセイによるSNP36を使用することによる野生型のワクチン型からの識別
3つの野生型試料及び3つのワクチンバルクが、この実施形態において使用される。3つの基準試料のウイルスDNAも、AXYGEN(登録商標)AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNAを使用することによって単離される。ワクチンバルクがこの実施形態及び以下の実施形態において使用される理由は、ワクチン接種されたイヌの配列型をシミュレートするためである。この実施形態において使用されるプライマー及びプローブの標識は、実施形態2とは異なる。順方向プライマーの5´末端がDIGを保有し、さらに、プローブの3´末端がFITCを保有している。着色された粒子はコロイド金である。プライマーの配列、プローブの配列及び増幅条件は以下に列挙されたものである。
Figure 0006936835
PNAが、特異性を上げるために増幅に添加される。ワクチンバルクは、希釈なしで増幅を実行するために使用される。
Figure 0006936835
図10は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちVP2のSNP36のPCR産物を示している。試料1、3、5は基準試料であり、さらに、試料2、4、6はワクチンバルク由来である。図10は、所与のプライマーを用いたPCR反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
図11は、所与のプライマーの対及びプローブに対するラテラルフローを示している。上述のように、プライマー及びプローブはSNP36の野生型に特異的である。従って、試料1、3、5のDIGが抗DIG及びコロイド金に会う場合、明確且つ特異的な着色された粒子がはじめに可視である。言い換えると、試料がSNP36野生型配列を含有している場合、着色された線が、ストリップ上で可視であり得る。一方、ワクチンバルク、すなわち試料2、4、6の着色された線は、プライマー及びプローブはその配列に特異的ではないため、可視ではない。
当業者は、本発明の教示を保持しながら、装置及び方法の多数の修正及び変更を行うことができるということを容易に観察することになる。従って、上記の開示は、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されると解釈されるべきである。
項目1. 試料内のCPV2a、2b又は2cのVP2の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
(a)前記CPV2a、2b又は2cの標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
(b)第1のプライマー及び第2のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第1のプライマーが、核酸配列の配列番号34から選択された核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、前記第2のプライマーが、別の核酸配列の配列番号3から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて前記標的核酸を増幅させるステップと、
(d)ステップ(c)の間に前記標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記プローブの配列が、配列番号4を含む群から選択される、ステップと、
(e)前記標的核酸の存在の指標として、前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む方法。
項目2. 前記プライマー及び/又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、項目1に記載の方法。
項目3. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は蛍光信号である、項目2に記載の方法。
項目4. 前記プローブの5´末端は、FAM、HEX、VIC、CY5又はTETを含む群から選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの3´末端は、TMARA、MGB又はBHQを含む群から選択されたクエンチャーを保有している、項目3に記載の方法。
項目5. 蛍光信号の存在は、前記試料内の前記標的核酸の存在を示し、さらに、蛍光信号の欠如は、前記標的核酸の欠如を示す、項目4に記載の方法。
項目6. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる蛍光信号は、DNA依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、項目5に記載の方法。
項目7. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイの後で着色された粒子によって視覚的に観察される分析物である、項目2に記載の方法。
項目8. 前記第1のプライマー又は第2のプライマーの5´末端が、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された抗原を保有し、さらに、前記プローブの3´末端が、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された前記第1のプライマー又は第2のプライマーとは異なる抗原を保有している、項目7に記載の方法。
項目9. 前記着色された粒子は、コロイド金、ラテックス及びカーボンナノ粒子の群から選択される、項目8に記載の方法。
項目10. テストラインにおける分析物信号の存在は、前記試料内の前記標的核酸の存在を示し、さらに、テストラインにおける分析物信号の欠如は、前記標的核酸の欠如を示す、項目9に記載の方法。
項目11. 試料内の野生型の標的核酸をワクチン型から識別する方法であって、
(a)前記標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
(b)第1のプライマー及び第2のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第1のプライマーが、核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、前記第2のプライマーが、別の核酸配列の配列番号11から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて対象を増幅させるステップと、
(d)ステップ(c)の間に前記標的核酸に対してSNPのプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記SNPのプローブは、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子のSNP36に特異的であり、さらに、前記SNPのプローブの配列は、配列番号14である、ステップと、
(e)前記標的核酸の存在の指標として、前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む方法。
項目12. 前記第1のプライマーは、配列番号8を含む群から選択される、項目11に記載の方法。
項目13. 前記プライマー及び/又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、項目12に記載の方法。
項目14. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は蛍光信号である、項目13に記載の方法。
項目15. 前記プローブの5´末端は、FAM、HEX、VIC、CY5又はTETを含む群から選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの3´末端は、TMARA、MGB又はBHQを含む群から選択されたクエンチャーを保有している、項目14に記載の方法。
項目16. 蛍光信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す、項目15に記載の方法。
項目17. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる蛍光信号は、DNA依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、項目16に記載の方法。
項目18. 前記ワクチン型の定義は、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種された試料である、項目11に記載の方法。
項目19. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイの後で着色された粒子によって視覚的に観察される分析物である、項目11に記載の方法。
項目20. 前記第1のプライマー又は第2のプライマーの5´末端が、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された抗原を保有し、さらに、前記プローブの3´末端が、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された前記第1のプライマー又は第2のプライマーとは異なる抗原を保有している、項目19に記載の方法。
項目21. 前記着色された粒子は、コロイド金、ラテックス及びカーボンナノ粒子の群から選択される、項目20に記載の方法。
項目22. テストラインにおける分析物信号の存在は、前記試料内の前記標的核酸の存在を示し、さらに、テストラインにおける分析物信号の欠如は、前記標的核酸の欠如を示す、項目21に記載の方法。
項目23. 試料内の野生型の対象をワクチン型から識別する方法であって、
(f)VP2を含有していると疑われる対象を提供するステップと、
(g)第1のプライマー及び第2のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第1のプライマーが、核酸配列の少なくとも連続している12のヌクレオチドを含み、さらに、前記第2のプライマーが、別の核酸配列の配列番号22から選択された少なくとも連続している12のヌクレオチドを含む、ステップと、
(h)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて前記対象を増幅させるステップと、
(i)ステップ(c)の間に標的核酸に対してP1のプローブもP2のプローブもアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記P1のプローブは、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子のSNP899に特異的であり、さらに、前記P2のプローブは、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子のSNP963に特異的であり、前記P1のヌクレオチド配列は、配列番号24であり、さらに、前記P2のヌクレオチド配列は、配列番号29である、ステップと、
(j)前記ハイブリダイズされた生成物から生じる2つの異なる蛍光信号を検出するステップと、
を含む方法。
項目24. 前記第1のプライマーは、配列番号17を含む群から選択される、項目23に記載の方法。
項目25. 前記P1の5´末端も前記P2の5´末端も、FAM、HEX、VIC、CY5又はTETを含む群から別に選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの両方の3´末端が、TMARA、MGB又はBHQを含む群から選択されたクエンチャーを保有し、P1のプローブ及びP2のプローブの蛍光レポーターは別である、項目24に記載の方法。
項目26. 異なる蛍光信号両方の存在が野生型を示し、前記異なる蛍光信号のうちいずれか1つの存在がワクチン型を示す、項目25に記載の方法。
項目27. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる2つの異なる蛍光信号は、DNA依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、項目26に記載の方法。
項目28. 前記プライマー及び/又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、項目27に記載の方法。
項目29. 前記ワクチン型は、試料が、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種されたということである、項目28に記載の方法。
2A CPV2a
2B CPV2b
2C CPV2c
H 健康な試料

Claims (14)

  1. 試料内の野生型の標的核酸をワクチン型から識別する方法であって、
    (a)前記標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
    (b)第1のプライマー及び第2のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第1のプライマーが、核酸配列の配列番号8から選択された連続している少なくとも12のヌクレオチドを含み、さらに、前記第2のプライマーが、別の核酸配列の配列番号11から選択された連続している少なくとも12のヌクレオチドを含む、ステップと、
    (c)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて前記標的核酸を増幅させるステップと、
    (d)ステップ(c)の間に前記標的核酸に対してSNPのプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記SNPのプローブは、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子のSNP36に特異的であり、さらに、前記SNPのプローブの配列は、配列番号14である、ステップと、
    (e)前記標的核酸の存在の指標として、前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
    を含み、
    前記標的核酸は、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子の核酸であり、
    前記信号の存在が野生型を示し、前記信号の欠如がワクチン型を示し、さらに、
    前記ワクチン型は、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種された試料である、方法。
  2. 前記プライマー及び/又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は蛍光信号である、請求項2に記載の方法。
  4. 前記プローブの5´末端は、FAM、HEX、VIC、CY5又はTETを含む群から選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの3´末端は、TMARA、MGB又はBHQを含む群から選択されたクエンチャーを保有している、請求項3に記載の方法。
  5. 蛍光信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す、請求項4に記載の方法。
  6. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる蛍光信号は、DNA依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、請求項5に記載の方法。
  7. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイの後で着色された粒子によって視覚的に観察される分析物である、請求項1に記載の方法。
  8. 前記第1のプライマー又は第2のプライマーの5´末端が、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された抗原を保有し、さらに、前記プローブの3´末端が、FITC、DIG、ビオチン、Texas−red及びTamraを含む群から選択された前記第1のプライマー又は第2のプライマーとは異なる抗原を保有している、請求項7に記載の方法。
  9. 前記着色された粒子は、コロイド金、ラテックス及びカーボンナノ粒子の群から選択される、請求項8に記載の方法。
  10. テストラインにおける分析物信号の存在は、前記試料内の前記標的核酸の存在を示し、さらに、テストラインにおける分析物信号の欠如は、前記標的核酸の欠如を示す、請求項9に記載の方法。
  11. 試料内の野生型の標的核酸をワクチン型から識別する方法であって、
    (f)VP2を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
    (g)第1のプライマー及び第2のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第1のプライマーが、核酸配列の配列番号17から選択された連続している少なくとも12のヌクレオチドを含み、さらに、前記第2のプライマーが、別の核酸配列の配列番号22から選択された連続している少なくとも12のヌクレオチドを含む、ステップと、
    (h)鋳型依存性ポリメラーゼを用いて前記標的核酸を増幅させるステップと、
    (i)ステップ(h)の間に標的核酸に対してP1のプローブもP2のプローブもアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記P1のプローブは、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子のSNP899に特異的であり、さらに、前記P2のプローブは、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子のSNP963に特異的であり、前記P1のヌクレオチド配列は、配列番号24であり、さらに、前記P2のヌクレオチド配列は、配列番号29である、ステップと、
    (j)前記ハイブリダイズされた生成物から生じる2つの異なる蛍光信号を検出するステップと、
    を含み、
    前記標的核酸は、CPV2a、2b又は2cのVP2遺伝子の核酸であり、
    前記異なる蛍光信号のうち両方の存在が野生型を示し、前記異なる蛍光信号のうちいずれか1つの存在がワクチン型を示し、さらに、
    前記ワクチン型は、Duramune MX5、Canivac 5、Vanguarad plus 5 L4 CV、Nobivac Puppy DP、Canine 6II−SL、Eurican5、Virbagen DA2Parvoを含むワクチン群のうちの1つでワクチン接種された試料である、方法。
  12. 前記P1の5´末端も前記P2の5´末端も、FAM、HEX、VIC、CY5又はTETを含む群から別に選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの両方の3´末端が、TMARA、MGB又はBHQを含む群から選択されたクエンチャーを保有し、P1のプローブ及びP2のプローブの蛍光レポーターは別である、請求項11に記載の方法。
  13. 前記ハイブリダイズされた生成物から生じる2つの異なる蛍光信号は、DNA依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、請求項12に記載の方法。
  14. 前記プライマー及び/又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、請求項13に記載の方法。
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