CN109321681A - 检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用 - Google Patents

检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109321681A
CN109321681A CN201811307219.0A CN201811307219A CN109321681A CN 109321681 A CN109321681 A CN 109321681A CN 201811307219 A CN201811307219 A CN 201811307219A CN 109321681 A CN109321681 A CN 109321681A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cpv
virus
detection
primer
nucleic acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811307219.0A
Other languages
English (en)
Inventor
薛峰
陈伟
苏静
周莉质
陆寿祥
吴城霖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Tadpole Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Tadpole Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Tadpole Biotechnology Co Ltd filed Critical Suzhou Tadpole Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811307219.0A priority Critical patent/CN109321681A/zh
Publication of CN109321681A publication Critical patent/CN109321681A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human Parvovirus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测CPV‑2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用。所述检测CPV‑2a病毒的引物对包括第一引物和第二引物，其序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。所述金标试纸条包括衬板，所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。所述试剂盒包括前述引物对和核酸捕获金标试纸条。本发明对CPV‑2a病毒的检测方法特异性高、灵敏度高、准确、快速，应用前景广阔。

Description

检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种PCR扩增结合核酸分子捕获技术，检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条，相应的试剂盒及其检测应用。
背景技术
犬细小病毒(CPV-2a)是一种无囊膜、单链、DNA病毒，可通过较小的抗原转移与自然突变而感染犬科动物。
带病毒的犬是主要的传染源，病犬的呕吐物、粪便、尿液均含有大量病毒。传播途径有直接和间接两种，前者是无免疫力的健康犬与病犬直接接触而被传染，后者是无免疫力的健康犬食入了被污染的水、饲料等被传染。临床以剧烈呕吐、出血性肠炎、心肌炎和白细胞显著减少为主要特征。本病主要侵害半岁以内的幼犬，特别是三个月以内的幼犬，一旦感染本病50％以上为胃肠炎和心肌炎混合型，死亡率高达80％以上，有时其感染率可高达100％，是为害养犬业最为重要的传染病。因此，建立CPV-2a快速检测方法在犬病害筛查和控制上显得尤为重要。
目前检测CPV-2a的常见方法有：酶联免疫法，但是该方法灵敏度低，假阳性高，易造成误检；荧光定量PCR法，该方法灵敏度较高，但仪器成本投入较大，对操作人员要求较高。此外，还有斑点杂交法、southern杂交法等，但这些方法假阳性高，操作繁琐，耗时较长。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种用于CPV-2a PCR扩增和核酸捕获的特异性引物，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一主要目的在于提供一种CPV-2a核酸捕获金标试纸条。
本发明的另一目的还在于提供一种用于CPV-2a PCR扩增和核酸捕获的试剂盒。
本发明的另一目的还在于提供前述试剂盒在制备检测CPV-2a病毒的产品中的用途。
本发明的另一目的还在于提供一种包含前述的用于CPV-2a PCR扩增和核酸捕获的试剂盒的产品。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种检测CPV-2a病毒的引物对，其包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述引物对的上游引物的5’和下游引物的5’都经生物素标记。
进一步地，所述上游引物标记的生物素为地高辛，所述下游引物标记的生物素为异硫氰酸。
本发明实施例还提供了一种检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条，包括衬板，所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。
本发明实施例还提供了一种检测CPV-2a病毒的试剂盒，其包括至少一引物对和至少一核酸捕获金标试纸条，其中一引物对为前述的检测CPV-2a病毒的引物对，其中一核酸捕获金标试纸条为前述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条。
本发明实施例还提供了前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒于制备检测CPV-2a病毒的产品中的用途。
进一步地，应用所述产品检测CPV-2a病毒的方法包括：
提供前述的检测CPV-2a病毒的引物对和阳性样本；
使所述引物对与前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；
之后对所述混合液进行PCR扩增；
将所获PCR扩增产物加入前述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含CPV-2a病毒。
本发明实施例还提供了一种包含前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的产品，所述产品应用于CPV-2a病毒的检测方法，所述检测方法包括：
提供前述的检测CPV-2a病毒的引物对和阳性样本；
使所述引物对与前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；
之后对所述混合液进行PCR扩增；
将所获PCR扩增产物加入前述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含CPV-2a病毒。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明以CPV-2a的VP基因的保守区域设计生物素标记引物，用以CPV-2a的定性检测，引物具有极高的扩增效率和特异性；
2)本发明的上下游引物两端采用不同生物素标记，分别与核酸捕获金标试纸条上包被的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，特异性好，灵敏度高，能快速、简便地检测CPV-2a病毒；
3)本发明提供的核酸捕获金标试纸条的检测线包被上游引物标记生物素的抗体，金标结合垫上干燥有胶体金偶联下游引物标记生物素的抗体，由于本发明的试纸条采用了核酸捕获的方法，经PCR扩增后样本含量得到了几何级数的放大，因此大大提高了检测灵敏度；
4)本发明提供的核酸捕获金标试纸条对PCR产物进行一定量的稀释，再进行上样，可进一步提高胶体金试纸条的检测灵敏度。
综上所述，本发明利用PCR扩增与核酸捕获金标试纸条相结合的方法，对CPV-2a重新设计、标记特异性引物，优化反应体系，以核酸捕获金标试纸条为载体对PCR扩增产物进行检测，充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了核酸捕获金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件，使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，为犬细小病毒病的检测提供了一种更为灵敏、更为准确、更为便捷、更为快速的检测方法。
附图说明
图1是实施例1中CPV-2a病毒以CPV/VP201、CPV/VP211、CPV/VP288、CPV/VP187四对引物分别进行PCR扩增的电泳图。
图2是检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条的检测原理示意图。
图3是检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图截面图。
图4是检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图俯视图。
图5是设有壳体的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图截面图。
图6是设有壳体的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条的结构示意图俯视图。
图7是检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条判读结果标准示意图。
图8是实施例5中CPV-2a灵敏度实验PCR产物电泳示意图。
图9是实施例5中CPV-2a PCR产物金标试纸条检测灵敏度实验结果图。
附图标记说明：1-衬板，2-样品垫，3-金标结合垫，4-包被膜，5-检测印迹线，6-对照印迹线，7-吸水垫，81-样品浸入端保护膜，82-手柄端保护膜，9-样品标记线，10-加样孔，11-观察窗，12-面板，13-定位槽，14-底座，15-凹槽，16-凸条。
具体实施方式
鉴于当前ELISA和免疫胶体金技术存在的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是采用PCR核酸扩增与免疫层析相结合的方法，以CPV-2a的VP基因的保守区域设计生物素标记引物，PCR产物与金标试纸条结合并显色，根据显色结果，对犬细小病毒进行定性检测，具有灵敏度高、特异型强、稳定性好等特点，可用于宠物疾病中犬细小病毒病的快速检测。
如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。
在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：
采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。
在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。
本发明实施例的一个方面提供了一种检测CPV-2a病毒的引物对，其包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述引物对的上游引物的5’和下游引物的5’都经生物素标记。
进一步地，所述上游引物标记的生物素为地高辛(Digoxigenin)，所述下游引物标记的生物素为异硫氰酸(FITC)。本发明的上下游引物两端采用不同生物素标记，分别与核酸捕获金标试纸条上包被的抗体进行结合，形成类似于三明治夹心结构的双重夹心结构，特异性好，灵敏度高，能快速、简便地检测CPV-2a病毒。
本发明的引物根据CPV-2a的VP基因的保守区域设计，用以CPV-2a的定性检测。
进一步地，所述引物对的上游引物具有序列表中CPV-2a-VP-F的核苷酸序列，下游引物具有序列表中CPV-2a-VP-R的核苷酸序列。
进一步地，所述引物对所含引物序列如下表1：
本发明以CPV-2a的VP基因的保守区域设计生物素标记引物，用以CPV-2a的定性检测，引物具有极高的扩增效率和特异性。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条(检测原理可参见图2)，包括衬板，所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。
在一些实施例中，所述检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条还包括第一保护膜和第二保护膜，所述第一保护膜的至少局部区域覆设于所述样品垫和金标结合垫上，所述第二保护膜的至少局部区域覆设于所述吸水垫上。
进一步地，所述第一保护膜的上表面设置有样品标记线。
在一些实施例中，所述检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条还包括外壳，所述外壳包括相互配合连接的底座和面板，所述底座包括定位槽，所述衬板卡设于所述定位槽内，所述面板上开设有观察窗和加样孔，所述观察窗与所述包被膜的位置对应，所述加样孔与所述样品垫的位置对应。
进一步地，所述底座的上端面设置有凸条，所述面板与底座相配合的一面上开设有与所述凸条相配合的凹槽，所述凸条与凹槽能够插接相连，实现底座和面板的连接。
进一步地，所述包被膜上的隐性检测区和隐形对照区均为线条型，即可分别为检测印迹线和对照印迹线。
进一步地，所述衬板为硬质PVC塑胶条，但不限于此。
进一步地，所述样品垫为聚酯膜，但不限于此。
进一步地，所述包被膜为硝酸纤维素膜，但不限于此。
进一步地，所述吸水垫为滤纸或滤油纸，但不限于此。
在一些较为具体的实施案例中，所述检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条的结构参见图3-图4所示，其包括长条型衬板1，衬板1的上表面从一端到另一端依次粘贴有样品垫2、吸附有FITC金标抗体的金标结合垫3、包被膜4及吸水垫7，所述包被膜4上印制有地高辛抗体的隐形检测印迹(即检测印迹线5)和羊抗鼠二抗的隐形对照印迹(即对照印迹线6)，所述吸水垫7是滤纸或滤油纸。
所述金标试纸条的两端覆有保护膜，一端是样品浸入端保护膜81覆盖在样品垫2和金标结合垫3上，该样品浸入端保护膜81上印制有样品标记线9；另一端的手柄端保护膜82覆盖在吸水垫7上。
参见图5和图6所示，所述核酸捕获金标试纸条还包括外壳，所述外壳由底座14和面板12组成，所述底座14设有用于固定衬板1的定位槽13，所述面板12上设有观察窗11和加样孔10，所述底座14和面板12之间以凹槽15和凸条16插接相连。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测CPV-2a病毒的试剂盒，其包括至少一引物对和至少一核酸捕获金标试纸条，其中一引物对为前述的检测CPV-2a病毒的引物对，其中一核酸捕获金标试纸条为前述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件。
进一步地，所述PCR扩增检测的常规组件包括PCR反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液和DNA聚合酶。
更进一步地，30μL PCR反应体系包括：上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，样品DNA 1μL，无RNA酶水12μL，预混液15μL。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒于制备检测CPV-2a病毒的产品中的用途。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种应用所述产品检测CPV-2a病毒的方法，其包括：
提供前述的检测CPV-2a病毒的引物对和阳性样本；
使所述引物对与前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；
之后对所述混合液进行PCR扩增；
将所获PCR扩增产物加入前述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含CPV-2a病毒。
本发明提供了提供最适PCR扩增体系和条件，具有极高的扩增效率。
进一步地，所述30μL PCR反应体系包括：上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，样品DNA 1μL，无RNA酶水12μL，预混液15μL。
进一步地，所述CPV-2a病毒PCR扩增的条件为：
预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；
PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；
其后，在70～75℃延伸保温5～10min。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的产品，所述产品应用于CPV-2a病毒的检测方法，所述检测方法包括：
提供前述的检测CPV-2a病毒的引物对和阳性样本；
使所述引物对与前述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；
之后对所述混合液进行PCR扩增；
将所获PCR扩增产物加入前述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含CPV-2a病毒。
本发明提供了提供最适PCR扩增体系和条件，具有极高的扩增效率。
进一步地，所述30μL PCR反应体系包括：上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，样品DNA 1μL，无RNA酶水12μL，预混液15μL。
进一步地，所述CPV-2a病毒PCR扩增的条件为：
预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；
PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；
其后，在70～75℃延伸保温5～10min。
以下结合附图和若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。
实施例1用于对CPV-2a进行PCR的引物设计
参照GenBank收录的CPV-2a基因组序列，选择CPV-2a的VP基因保守区域，采用ABIPrimerExpress 3.0PCR引物设计软件，设计合成引物。
其中的典型的引物对序列如下：
如图1所示，针对CPV-2a病毒设计的四对引物对，进行PCR扩增实验，电泳结果则说明了CPV/VP187对引物扩增效率最高，因此本实验使用CPV/VP187-F和CPV/VP187-R作为CPV-2a病毒的检测序列，其序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
其中图1中编号1的扩增片段条带为引物对CPV/VP201的PCR扩增产物；图1中编号2的扩增片段条带为引物对CPV/VP211的PCR扩增产物；图1中编号3的扩增片段条带为引物对CPV/VP288的PCR扩增产物；图1中编号4的扩增片段条带为引物对CPV/VP187的PCR扩增产物。
实施例2 PCR实验
一、磁珠法提取核酸
1.1样品处理
取宠物粪便或鼻腔分泌物样品于1mL生理盐水或1×PBS(0.01M，pH7.2)中，制备成匀浆。2000rpm离心10min，将上清液转移至新的离心管中。
1.2核酸制备
1.2.1无菌条件下将样本液体混合均匀后，取300μL样品于1.5mL洁净离心管中，加入500μL裂解液和10μL蛋白酶K，56℃水浴30min。
1.2.2磁珠使用前须于37℃温育10min，用手轻轻摇匀使之呈现悬浮状态。
1.2.3经水浴裂解完毕的样品中，加入15μL已加热混匀的磁珠，再加入250μL的结合液，涡旋混匀。
1.2.4将离心管于混合仪旋转混合10min(转速0.83～0.85转/s)。
1.2.5混合完毕，于磁力架固定吸附，肉眼观察，磁珠完全被吸附至磁铁一侧即可(约需要10～15s)，用移液器吸去离心管内清液，加入500μL漂洗液漂洗磁珠，每次注入漂洗液后轻轻摇匀5s，再次固定于磁力架，10s后再次完全吸去清液，重复漂洗三次。
1.2.6将离心管从磁力架上取下，开盖放置5min使乙醇完全挥发。
1.2.7加入100μL洗脱液，超声分散附着在离心管壁的磁珠(超声时间大约45s，时间不宜过长以免DNA断裂)，期间不断取出摇匀肉眼观察分散情况。
1.2.8水浴65℃，10min，然后置于磁力架上分离磁珠，用移液器吸取清液至新的洁净1.5mL离心管中，即得到DNA溶液。
二、生物素标记PCR引物
所述的引物修饰为：上游引物是地高辛(Digoxigenin)修饰，下游引物是FITC修饰。
2.1 CPV-2a生物素标记引物
F：5’-Digoxigenin-ACTGGAACTAGTGGCACACC-3’20bp
R：5’-FITC-TGGTGGTAAGCCCAATGCTC-3’20bp
三、PCR反应体系构建及反应条件确立
3.1 PCR反应体系
PCR Total(30μl)
预混液 15μl
上游引物(10μM) 1μl
下游引物(10μM) 1μl
模板 1μl
双蒸水 12μl
3.2 PCR反应条件
3.2.1 CPV-2aPCR反应条件
94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环后进入72℃，7min；4℃保存。
用上述引物跑完PCR电泳图如图8，电泳条带清晰可见。
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含CPV-2a的样品作阳性对照，用已知不含CPV-2a的样品作阴性对照，用等体积的DEPC水代替模板DNA作空白对照。
实施例3、胶体金标试纸条制作
3.1制金
3.1.1向装有磁力搅拌子的洁净锥形瓶，加入1ml氯金酸(5g/L)，超纯水稀释到50ml，用保鲜膜封口。
3.1.2将锥形瓶置于磁力搅拌器上，打开搅拌器，调整锥形瓶位置使搅拌子位于锥形瓶中间，同时缓慢增大搅拌速度，至转速1300±20r/min，保证磁力搅拌子在锥形瓶中央稳定搅拌后，关闭搅拌器，停止搅拌，将加热旋钮调至最大，开始加热。
3.1.3当瓶中液体开始暴沸，开启搅拌器，同时向瓶中快速加入1000μL柠檬酸三钠溶液(1％)。
3.1.4持续加热搅拌，待液体颜色由黑色逐渐变至酒红色稳定后，开始计时，继续加热搅拌5min后，停止加热搅拌。
3.1.5自然冷却至室温，封口膜封口，2-8℃保存，效期6个月。
3.2.金标结合垫制作
3.2.1取1000μL胶体金注入1.5ml锥形离心管，加入10μL碳酸钾溶液(0.1mol/L)，涡旋仪振荡6s混匀。
3.2.2加入6μl Anti-FITC(1mg/ml)，涡旋仪振荡6s。
3.2.3于旋转混合仪上振荡反应60min。
3.2.4加入80μL BSA溶液(10％)，涡旋仪振荡6s。
3.2.5于3D旋转混合仪振荡封闭30min。
3.2.6冷冻离心机上以r＝11000r/min、t＝4℃离心15min。(注意：离心前对称位置离心管重量需配平，相对质量误差≤20mg)
3.2.7配制重悬液：离心结束用移液枪快速吸取底部20μL酒红色沉淀物转移至200μL的PCR管中(注意：尽量避免吸取上清)，加入10μL蔗糖溶液(10％)和70μL BSA溶液(10％)，涡旋仪振荡8s。
3.2.8重悬液6μL/片滴加在金标结合垫(4*6mm/片)上，25℃干燥2h。
3.3 NC膜固定抗体：喷金划膜仪将抗体划到NC膜，于烘箱37℃干燥2h。
检测线(T)：Anti-Digoxigenin抗体浓度：1mg/ml,划线量：0.8μL/cm。
质控线(C)：羊抗鼠二抗(H+L)抗体浓度：1mg/ml,划线量：0.8μL/cm。
3.4附件制作及切割
3.4.1附件制作
3.4.1.1样品垫制备：将玻璃纤维板裁切成17*300mm宽度长条，样品垫处理液浸泡120min后，放置在含有泡沫棉的纸盒中，37℃烘箱烘干，时间120min。
3.4.1.2吸水纸制备：将纸板裁切19*300mm宽度长条，待用。
3.5组装
组装详见图3-6。
3.5.1样品垫组装
样品垫贴合位置与PVC底板齐平。
将PVC底板19mm宽度一侧不干胶揭除，样品垫贴合位置与PVC底板齐平。
3.5.2吸水纸组装
将PVC底板17mm宽度一侧不干胶揭除，吸水纸贴合至相应位置，一侧于PVC底板边缘齐平，另一侧压覆于NC膜上(压覆尺寸2.0±0.3mm)。
3.5.3切条
将组装好的PVC板放置切条机进板口，调整限位板，空隙≤0.5mm。调整滚轮压入底板，设定切条宽度4mm，切条。
3.5.4金标结合垫安装
用镊子将样品垫掀起，再用另外一把镊子将铺金干燥好的金标结合垫填放在样品垫和NC膜中间，调整金标结合垫与NC膜压覆尺寸2.0±0.2mm。
实施例4、判读标准
4.1试纸条上样
取6μL PCR产物，加入54μL上样稀释液，混匀后垂直缓慢滴加于试条样品孔中，3-5分钟之间观察结果。
4.2结果判定
试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为阳性。试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性，详见图7。
4.3表述
阳性：试纸条质控线(C线)变红色，且检测线(T线)变红色，检测结果为阳性，判定为检出CPV-2a。
阴性：试纸条质控线(C线)变红色，且检测线(T线)不变色，检测结果为阴性，判定为未检出CPV-2a。
4.4质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
A)空白对照：质控线变红，检测线未变红。
B)阴性对照：质控线变红，检测线未变红。
C)阳性对照：质控线变红，检测线变红。
实施例5、CPV-2a PCR产物试纸条检测灵敏度实验
为了验证该方法对CPV-2a检测的灵敏度，将CPV-2a的质粒DNA梯度稀释，PCR之后进行电泳检测和试纸条检测。PCR-电泳检测(结果见图8)，当质粒DNA浓度为1fg时，CPV-2a仍然有很清晰的条带。PCR-试纸条检测(结果见图9)，当质粒DNA浓度为1fg时，CPV-2a试纸条质控线和检测线依然能显示红色条带。
实施例6、CPV-2a PCR扩增结合核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒
将用于对犬细小病毒(CPV-2a)核酸进行PCR检测的修饰引物CPV-2a-VP-F(10μM)50μL，CPV-2a-VP-R(10μM)50μL以及Premix Ex Taq 0.8mL、CPV-2a质粒DNA(30ng/μL)20μL、超纯水1.5mL、上样样品稀释液5mL、成品试纸条48条共同包装，得到犬细小病毒(CPV-2a)PCR产物核酸捕获金标试纸条的检测试剂盒。
综上所述，藉由上述技术方案，本发明利用PCR扩增与核酸捕获金标试纸条相结合的方法，对CPV-2a重新设计、标记特异性引物，优化反应体系，以核酸捕获金标试纸条为载体对PCR扩增产物进行检测，充分利用PCR扩增的高灵敏度、高特异性的特点，又结合了核酸捕获金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，避免了PCR结果电泳检测耗时、易污染、操作复杂、危害环境、人员需培训等不利条件，使PCR结果的检测极为直观简便，易于操作，极大缩短了检测时间，为犬细小病毒病的检测提供了一种更为灵敏、更为准确、更为便捷、更为快速的检测方法。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州蝌蚪生物技术有限公司
<120> 检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
actggaacta gtggcacacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
tggtggtaag cccaatgctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gagcattggg cttaccacca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
aatggccctt gtgtagacgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
atctgggaac gggtctggag 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
ccccaagcat ttgcatcaac c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
aggtacgaga gattctacag ca 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
ttatagcaga aagcgcgcg 19

Claims (10)

1.一种检测CPV-2a病毒的引物对，其特征在于包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的检测CPV-2a病毒的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物的5’和下游引物的5’都经生物素标记；优选的，所述上游引物标记的生物素为地高辛，所述下游引物标记的生物素为异硫氰酸。
3.一种检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条，包括衬板，其特征在于：所述衬板的上端面包括沿设定方向依次设置的样品垫、结合有FITC金标抗体的金标结合垫、包被膜及吸水垫，所述包被膜上设置有结合地高辛抗体的隐形检测区和结合羊抗鼠二抗的隐形对照区。
4.根据权利要求3所述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条，其特征在于还包括第一保护膜和第二保护膜，所述第一保护膜的至少局部区域覆设于所述样品垫和金标结合垫上，所述第二保护膜的至少局部区域覆设于所述吸水垫上；优选的，所述第一保护膜的上表面设置有样品标记线；
和/或，所述检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条还包括外壳，所述外壳包括相互配合连接的底座和面板，所述底座包括定位槽，所述衬板卡设于所述定位槽内，所述面板上开设有观察窗和加样孔，所述观察窗与所述包被膜的位置对应，所述加样孔与所述样品垫的位置对应；优选的，所述底座的上端面设置有凸条，所述面板与底座相配合的一面上开设有与所述凸条相配合的凹槽，所述凸条与凹槽能够插接相连，实现底座和面板的连接。
5.根据权利要求3所述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条，其特征在于：所述包被膜上的隐性检测区和隐形对照区均为线条型；和/或，所述衬板包括硬质PVC塑胶条；和/或，所述样品垫包括聚酯膜；和/或，所述包被膜包括硝酸纤维素膜；和/或，所述吸水垫包括滤纸或滤油纸。
6.一种检测CPV-2a病毒的试剂盒，其特征在于包括至少一引物对和至少一核酸捕获金标试纸条，其中一引物对为权利要求1或2所述的检测CPV-2a病毒的引物对，其中一核酸捕获金标试纸条为权利要求3-5中任一项所述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR扩增检测的常规组件；优选的，所述PCR扩增检测的常规组件包括PCR反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液和DNA聚合酶。
8.权利要求6-7中任一项所述的检测CPV-2a病毒的试剂盒于制备检测CPV-2a病毒的产品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，应用所述产品检测CPV-2a病毒的方法包括：
提供权利要求1或2所述的检测CPV-2a病毒的引物对和阳性样本；
使所述引物对与权利要求6-7中任一项所述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；
之后对所述混合液进行PCR扩增；
将所获PCR扩增产物加入权利要求3-5中任一项所述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含CPV-2a病毒；
优选的，所述CPV-2a病毒PCR扩增的条件为：
预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；
PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；
其后，在70～75℃延伸保温5～10min。
10.一种包含权利要求6-7中任一项所述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的产品，所述产品应用于CPV-2a病毒的检测方法，所述检测方法包括：
提供权利要求1或2所述的检测CPV-2a病毒的引物对和阳性样本；
使所述引物对与权利要求6-7中任一项所述的检测CPV-2a病毒的试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
在所述混合液中加入待检测的DNA样本或阳性样本；
之后对所述混合液进行PCR扩增；
将所获PCR扩增产物加入权利要求3-5中任一项所述的检测CPV-2a病毒的核酸捕获金标试纸条进行检测，根据显色结果判断待检测的DNA样本中是否包含CPV-2a病毒；
优选的，所述CPV-2a病毒PCR扩增的条件为：
预变性，包括：在92～95℃下变性保温5～10min；
PCR循环，包括30～40个循环，每个循环包括：依次在92～95℃下变性保温30s～1min，55～60℃退火保温30s～1min，70～75℃延伸保温1～2min；
其后，在70～75℃延伸保温5～10min。
CN201811307219.0A 2018-11-05 2018-11-05 检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用 Pending CN109321681A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811307219.0A CN109321681A (zh) 2018-11-05 2018-11-05 检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811307219.0A CN109321681A (zh) 2018-11-05 2018-11-05 检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109321681A true CN109321681A (zh) 2019-02-12

Family

ID=65260409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811307219.0A Pending CN109321681A (zh) 2018-11-05 2018-11-05 检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109321681A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102243238A (zh) * 2010-05-13 2011-11-16 蓝十字生物药业（北京）有限公司 病原体的核酸金标快速检测方法及试剂盒
CN102520172A (zh) * 2011-12-12 2012-06-27 北京陆桥技术有限责任公司 单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN103194536A (zh) * 2013-03-05 2013-07-10 北京陆桥技术有限责任公司 白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN103757139A (zh) * 2014-02-17 2014-04-30 河南省动物疫病预防控制中心 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN105203759A (zh) * 2015-10-12 2015-12-30 武汉中帜生物科技股份有限公司 一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒
CN106967843A (zh) * 2017-04-06 2017-07-21 苏州点晶生物科技有限公司 犬细小病毒核酸快速检测试剂盒
CN107254555A (zh) * 2017-07-25 2017-10-17 中国农业科学院特产研究所 用于检测不同亚型犬细小病毒的引物对和探针的组合产品
CN108165666A (zh) * 2016-12-07 2018-06-15 克雷多生物医学私人有限公司 检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102243238A (zh) * 2010-05-13 2011-11-16 蓝十字生物药业（北京）有限公司 病原体的核酸金标快速检测方法及试剂盒
CN102520172A (zh) * 2011-12-12 2012-06-27 北京陆桥技术有限责任公司 单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN103194536A (zh) * 2013-03-05 2013-07-10 北京陆桥技术有限责任公司 白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN103757139A (zh) * 2014-02-17 2014-04-30 河南省动物疫病预防控制中心 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN105203759A (zh) * 2015-10-12 2015-12-30 武汉中帜生物科技股份有限公司 一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒
CN108165666A (zh) * 2016-12-07 2018-06-15 克雷多生物医学私人有限公司 检测CPV2a、CPV2b与CPV2c并鉴别野生型与疫苗型的方法
CN106967843A (zh) * 2017-04-06 2017-07-21 苏州点晶生物科技有限公司 犬细小病毒核酸快速检测试剂盒
CN107254555A (zh) * 2017-07-25 2017-10-17 中国农业科学院特产研究所 用于检测不同亚型犬细小病毒的引物对和探针的组合产品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALI BINGGA等: "High resolution melting curve analysis as a new tool for rapid identification of canine parvovirus type 2 strains", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *
NICOLA DECARO等: "Characterisation of the canine parvovirus type 2 variants using minor groove binder probe technology", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104215756B (zh) 生物相关物质的测定系统
JP7250757B2 (ja) 逐次的ラテラルフローデバイス
CN109338015A (zh) 检测fhv-1病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用
EP3084441B1 (en) Improved diagnostic test for csfv antibodies
CN111378018B (zh) 一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用
US20100047766A1 (en) Analyte manipulation and detection
CN1920559A (zh) 一种细胞生物技术、试剂盒及制备装置
CN103597353A (zh) 使用磁性二氧化硅颗粒的测定方法和该测定方法用试剂
WO2005111620A1 (ja) Ｂ型肝炎ウィルスの検出方法
EP2051809A1 (en) Analyte manipulation and detection
JP2009098138A (ja) 高感度免疫測定方法
CN113533736B (zh) 肺炎支原体IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法
CN109457050A (zh) 检测乙型肝炎病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN111521784B (zh) 检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法
JPH06507475A (ja) 希釈緩衝液およびその使用法
CN106996976B (zh) 基于微流控技术的ctc蛋白质分型试剂盒
RU191660U1 (ru) Иммунохроматографическая тест-полоска для проведения экспресс-метода определения четырех групп антибиотиков в молоке с исключением возможной фальсификации образца
CN110346553A (zh) 一种pcr产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒及其检测方法
CN109321681A (zh) 检测CPV-2a病毒的引物、核酸捕获金标试纸条、试剂盒及应用
US9632086B2 (en) Method and kit for determining-antibody sensitivity and clone cell strain
Sheu et al. Biogenesis of the hepatitis B viral middle (M) surface protein in a human hepatoma cell line: demonstration of an alternative secretion pathway
CN114717345A (zh) CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核酸扩增方法、试纸条及其应用
CN109321677B (zh) 一种rpa结合免疫荧光层析特异性检测h1甲流亚型的方法
CN108426996A (zh) 一种3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的快速检测试剂盒及其制备方法和应用
CN109457051A (zh) 检测丙型肝炎病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190212