CN111521784B - 检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜。使用本发明的胶体金试纸条检测卡氏住白细胞虫抗体，无需任何仪器和设备，肉眼就可判定结果。可在样品收集现场进行检测，特别适合野外或现场应用。检测步骤少，10‑15min出结果，特别适合大规模的检测和流行病学调查。

Description

检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术
卡氏住白细胞虫病又称“白冠病”，是由卡氏住白细胞虫寄生于鸡的红细胞、白细胞和内脏组织细胞内所引起的一种血孢子虫病。卡氏住白细胞虫病多发生于3～6周龄雏鸡，发病严重，死亡率高；青年鸡感染率比雏鸡高，但是死亡率不高；而成年鸡的感染率最高，但死亡率很低，症状较轻。主要临床症状表现为鸡冠苍白，消瘦，拉水样白色或绿色稀粪，鸡发育受阻，成年鸡产蛋下降甚至停止，会对养鸡行业造成较大经济损失。
目前，卡氏住白细胞虫病的检测方法主要分为病原检查、血清学试验和核酸检测等。病原检查主要通过血涂片检查法检查外周血液中有无裂殖子或配子体。血涂片检查方法虽然简单易行，但是在检测效率、检出率、虫种鉴别等方面具有很大的局限性，越来越不适应当前防治工作的需要，尤其不能适应大规模的流行病学调查。核酸检测主要通过普通PCR方法和荧光定量PCR方法，此类方法敏感性好且准确性相对较高，但是需要专业的仪器设备进行检测，对人员和设备的要求较高。血清学检测方法有琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、乳胶凝集试验等，这些方法存在着敏感性低或操作复杂、未标准化等问题。基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测方法具有良好的敏感性和特异性，但是需要专业的设备和操作人员，对试验条件要求较高，且检测耗时较长。
因此，亟需一种敏感、特异、快速、可靠，适用于各养殖场和基层兽医站的卡氏住白细胞虫病检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法，是应用试纸条来检测卡氏住白细胞虫的方法，比现有的涂片镜检法和琼脂扩散试验更加敏感，其检测效率和检出率更高。与间接ELISA方法相比，本发明建立的用胶体金试纸条检测卡氏住白细胞虫抗体的方法，操作简单，不需要专业的仪器设备，试验时间更短，成本低，更加适用于现场检测和大规模的流行病学调查，有利于该病的防控。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种检测卡氏住白细胞虫抗体胶体金试纸条，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜。
优选地，检测步骤与原理：将待测样本中的卡氏住白细胞虫抗体先与胶体金标记的重组R7蛋白抗原反应，再与硝酸纤维素膜上对应的重组R7蛋白抗原反应，形成重组R7蛋白抗原-卡氏住白细胞虫抗体-胶体金标记重组R7蛋白抗原夹心复合物，通过胶体金颗粒特有的颜色示踪而判断卡氏住白细胞虫抗体的有无。
优选地，所述底板为PVC底板。
优选地，所述重组R7蛋白(rR7蛋白)的制备方法：
(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；
(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coliTOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；
(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coli BL21表达菌，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；
(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。
一种检测卡氏住白细胞虫抗体胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、金标垫的制备：
(1)胶体金的制备：将氯金酸水溶液加入超纯水中，加热，再加入柠檬酸三钠水溶液搅拌，继续煮沸，冷却，定容，即获得胶体金溶液，避光保存备用；
(2)金标重组R7蛋白的制备：用K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调至6.0-6.5，向胶体金溶液中加入重组R7蛋白，搅拌后静置，再加入BSA溶液封闭，搅拌静置，离心，取上清液，再离心，收集紫红色絮状沉淀，加入金标复溶液，混合，即得纯化的金标重组R7蛋白溶液；
(3)金标垫的制备：将金标重组R7蛋白溶液稀释，再喷涂在玻璃纤维膜上，烘干，得到金标垫，密封保存；
B、反应垫的制备：
(1)将重组R7蛋白和兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体用稀释液分别稀释成1.0-3.5mg/mL的检测线溶液和0.2-1.2mg/mL的质控线溶液，将检测线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线，将质控线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线，密封干燥保存，备用；
C、试纸条的制备：
(1)将样品垫在预处理液中浸泡，再烘干，干燥保存；
(2)将底板、样品垫、金标垫、反应垫和为吸水垫组合，底板先粘上反应垫和吸水垫，反应垫与吸水垫相互交叠，且吸水垫在反应垫的上边，在反应垫的上边依次粘贴金标垫和样品垫，反应垫和金标垫之间以及金标垫与样品垫之间相互交叠，即得所述检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条。
优选地，所述金标垫的制备中：氯金酸水溶液的质量百分数为0.5-2％，柠檬酸三钠水溶液的质量百分数为0.5-2％，BSA溶液的质量百分数为5-10％。
优选地，所述氯金酸水溶液与超纯水的比值为1:(100-105)。
优选地，所述金标垫的制备中：金标复溶液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含4％蔗糖，1％海藻糖，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3。
优选地，所述金标复溶液和原胶体金溶液的体积比为1:(18-20)。
优选地，所述稀释所用的溶液为金标复溶液，所述金标重组R7蛋白溶液和金标复溶液的质量比为1:(1-4)。
优选地，所述金标垫的制备中：喷涂的量为2-4μL/cm2，烘干的温度为35℃-37℃，时间为10-12h。
优选地，所述离心的温度为4℃。
优选地，所述反应垫的制备中：喷涂的量为2-4μL/cm2，烘干的温度为35℃-37℃，时间为10-12h。
优选地，所述稀释液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含4％蔗糖和0.02％NaN3。
优选地，所述检测线与质控线相距0.65-0.7cm，距硝酸纤维素膜的边距为0.9-1.0cm。
优选地，所述预处理液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含2％PEG，2％PVP，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3。
本发明还提供更详细的一种检测卡氏住白细胞虫抗体胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、金标垫的制备：
(1)胶体金的制备：将1％氯金酸水溶液加入100ml超纯水中，加热煮沸1-2min，加入1％柠檬酸三钠水溶液1ml搅拌，继续煮沸10-15min，冷却，定容100ml，即获得胶体金溶液，避光保存备用；
(2)金标重组R7蛋白的制备：用0.1-1mol/L的K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调至6.0-6.5，向胶体金溶液中加入重组R7蛋白，搅拌后静置，再加入BSA溶液封闭，搅拌静置，离心，取上清液，再离心，收集紫红色絮状沉淀，加入金标复溶液，混合，即得纯化的金标重组R7蛋白溶液；
(3)金标垫的制备：将金标重组R7蛋白溶液喷涂在玻璃纤维膜上，喷涂量为4μL/cm2，37℃烘干12h，干燥后，密封4℃保存；
B、反应垫的制备：
(1)将重组R7蛋白和兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体用稀释液分别稀释成2.0mg/mL的检测线溶液和1.0mg/mL的质控线溶液，通过喷涂机将检测线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线，通过喷涂机将质控线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线，喷涂量为2μL/cm2，37℃烘干12h，4℃密封干燥保存，T线与C线相距0.7cm，距硝酸纤维素膜的边距为1.0cm；
C、试纸条的制备：
(1)将样品垫在预处理液中浸泡2-3h，再在37℃-40℃下烘干，干燥保存；
(2)将底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫组合，在底板先粘上反应垫和吸水垫，反应垫与吸水垫相互交叠0.2-0.3cm，且吸水垫在反应垫的上边，在反应垫的上边依次粘贴金标垫和样品垫，反应垫和金标垫之间以及金标垫与样品垫之间相互交叠0.2-0.3cm，即得所述检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金免疫层析试纸条。
本发明所用的金标复溶液可以提高金标蛋白的稳定性和减少非特异性吸附。
本发明所用的预处理液配方可以保护金标蛋白，还可以提高玻璃纤维膜的亲水性和润湿性，降低液体的表面张力，有助于样品垫和金标垫的再湿润，有利于待检血清抗体和金标抗原快速充分的反应。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)使用本发明的胶体金试纸条检测卡氏住白细胞虫抗体，无需任何仪器和设备，肉眼就可判定结果。可在样品收集现场进行检测，特别适合野外或现场应用。
(2)检测步骤少，耗时短，只需10-15min就出结果。节约了人力与时间，特别适合大批量时间紧的检测和大面积普查等。
(3)使用成本低。对仪器设备和检测人员无要求，硬件成本和人力成本大幅下降。
(4)制造成本低。试纸结构简单，耗材、生产设备等成本不高，易于大批量生产。
(5)本发明试纸条灵敏度高，稳定性好，安全，无污染。
附图说明
图1为重组R7蛋白纯化结果，图中参数：M为170kDa预染蛋白Maker，1为psYNO-1诱导后菌液，2为psYNO-R7诱导后上清，3为上样滤过液，4为洗杂液，5为洗脱液；
图2为重组R7蛋白Western blot检测结果，图中参数：1为psYNO-1空载体对照组；2为重组R7蛋白；
图3为胶体金试纸条的结构示意图，图中参数：1为PVC底板，2为样品垫，3为金标垫，4为反应垫，T为检测线，C为质控线，5为吸水垫。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种重组R7蛋白(rR7蛋白)的制备方法，包括以下步骤：
(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；
(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coli TOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；
(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coli BL21表达菌，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；
(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。
用12％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析，以及Western blot检测重组蛋白。
rR7蛋白使用MBP纯化树脂亲和层析，通过含有10mM麦芽糖的洗脱液洗脱下来，SDS-PAGE电泳分析纯化结果如图1所示，纯化后得到高纯度的rR7蛋白，没有杂带。
用鸡卡氏住白细胞虫阳性血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgG作为二抗，对纯化的rR7蛋白进行Western Blot检测，结果如图2所示，约在90kDa大小的位置出现特异性反应条带，与预期相符，表明rR7蛋白具有较好的反应原性。
实施例2
一种胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，将100mL超纯水置于洁净的锥形瓶中，加入1％氯金酸水溶液1mL，加热煮沸1-2min后，迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液1mL，继续煮沸10min，整个过程于磁力加热搅拌器上边加热边均匀搅动，自然冷却后加超纯水定容至100mL，即获得胶体金溶液，避光4℃保存备用。
实施例3
一种金标rR7蛋白的制备方法：
(1)rR7蛋白预处理
将rR7蛋白用0.015mol/L PBS(pH 7.4)稀释后，置于超滤离心管中，在4℃和5000r/min下离心25min，再在4℃和10000r/min下离心1h，稀释，得到1mg/mL的rR7蛋白溶液。
(2)最佳标记pH值的确定
用0.1mol/L K2CO3溶液或0.1mol/L HCl溶液调节胶体金溶液的pH值分别至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，取10个1.5mL离心管，分别加入1mL不同pH值的胶体金溶液，再每管加入50μL 1mg/mL的rR7蛋白，震荡混匀5min后室温静置15min，然后每管分别加入100μL 10％NaCl溶液，震荡混匀5min后室温静置2h，观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH值。
结果如表1所示，pH值从4.0到8.5，胶体金溶液颜色从蓝色过渡到红色，pH 6.0为溶液保持红色的最低pH值，即胶体金溶液的最佳标记pH值为6.0。
表1最佳标记pH值的确定结果
pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
溶液颜色 蓝色 蓝色 蓝色 淡蓝色 红色 红色 红色 红色 红色 红色
(3)最佳标记蛋白浓度的确定
用0.1mol/L的K2CO3溶液将胶体金溶液的pH值调至6.0，取12个1.5mL离心管，每管加1mL胶体金溶液，再分别加入0μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL、25μL、27.5μL、50μL rR7蛋白(浓度为1mg/mL)，震荡混匀5min后室温静置15min，然后每管加入100μL 10％NaCl溶液，震荡混匀5min后室温静置2h，同时设立1管1mL的胶体金溶液不加rR7蛋白和10％Na Cl的对照管，放置2h，观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低蛋白浓度。
结果如表2所示，对照管保持红色不变，加入蛋白量不足以稳定胶体金的离心管呈现由红色变成蓝色的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。其中15.0μg/mL的浓度为溶液保持红色的最低蛋白浓度，在此基础上加上20％的量即为最适浓度，即胶体金标记rR7蛋白的最佳标记浓度为18.0μg/mL。
表2最佳标记蛋白浓度的确定
Figure BDA0002440870310000071
(4)金标rR7蛋白的制备
用0.1mol/L的K2CO3溶液将胶体金溶液的pH值调至6.0，在磁力搅拌下，向100mL胶体金溶液中加入最佳标记量的rR7蛋白，使rR7蛋白终浓度为18.0μg/mL，搅拌5min后室温静置30min，再加入10％BSA溶液作为封闭液，当终浓度为1％，搅拌5min后室温静置30min，即得金标rR7蛋白。
(5)金标rR7蛋白的纯化
将封闭好的金标rR7蛋白溶液在4℃和2000r/min下离心15min，取上清液，再将上清液在4℃和8000r/min下离心45min，物质分为三层，弃掉上清液，收集中层紫红色絮状沉淀(胶体金标记rR7蛋白的复合物)；在紫红色絮状沉淀中加入原液量1/20体积的金标复溶液(即100mL胶体金加5mL金标复溶液)，涡旋混匀得到纯化的金标rR7蛋白溶液；上述金标复溶液是含4％蔗糖，1％海藻糖，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3的PBS(0.015mol/L，pH7.4)。
一种胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜(金标垫)的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备金标rR7蛋白溶液；
(2)将金标rR7蛋白溶液稀释后通过喷金机喷在玻璃纤维上，喷涂量为4μL/cm2，在37℃烘干12h，得到胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维，密封4℃保存。
包被有重组R7蛋白的检测线和包被有兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜(反应垫)的制备方法，包括以下步骤：
(1)将重组R7蛋白和兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体用含4％蔗糖和0.02％NaN3的PBS(0.015mol/L，pH 7.4)分别稀释成2.0mg/mL的检测线溶液和1.0mg/mL的质控线溶液，通过喷涂机将检测线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线(T线)，通过喷涂机将质控线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线(C线)，T线与C线相距0.7cm，距硝酸纤维素膜的边距分别为1.0cm，喷涂量为2μL/cm2，37℃烘干12h，4℃密封干燥保存，备用；
一种检测卡氏住白细胞虫抗体胶体金试纸条的制备方法：
(1)将样品垫在含2％PEG，2％PVP，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3的PBS(0.015mol/L，pH 7.4)中浸泡，3h后取出，37℃烘干，4℃干燥保存；
(2)将PVC底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫组合，PVC底板先粘上反应垫和吸水垫，反应垫与吸水垫相互交叠0.2-0.3cm，且吸水垫在反应垫的上边，在反应垫的上边依次粘贴金标垫和样品垫，反应垫和金标垫之间以及金标垫与样品垫之间相互交叠0.2-0.3cm，即得检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金免疫层析试纸条。
优化实验：试纸条最佳试验条件的优化
1.玻璃纤维膜的选择
将不同型号的玻璃纤维膜Ahlstrom 8964、GF-06和GF-08制成金标垫，其余步骤不变，分别组装试纸条。用卡氏住白细胞虫标准阳性血清和阴性血清进行测试，肉眼观察比较不同玻璃纤维膜上金标rR7蛋白的释放情况以及检测线和质控线的显示色情况。
结果如表3所示，Ahlstrom 8964比GF-06和GF-08显色深，金标蛋白释放较完全，无残留。因此选择玻璃纤维膜Ahlstrom 8964用于制备金标垫。
表3不用玻璃纤维膜的测定结果
玻璃纤维膜型号 Ahlstrom 8964 GF-06 GF-08
金标蛋白释放情况 较完全 有残留 有残留
T线/C线显色情况 较深 较浅 较浅
2.金标垫及样品垫的预处理
将玻璃纤维膜Ahlstrom 8964浸泡在pH为7.4，0.015mol/L的PBS(含2％PEG，2％PVP，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3)(预处理液)中，3h后取出，37℃烘干，4℃干燥保存，用未处理的玻璃纤维膜和预处理的玻璃纤维膜分别制作金标垫和样品垫，其余步骤不变，分别组装试纸条。用卡氏住白细胞虫标准阳性血清和阴性血清进行测试，肉眼观察比较不同玻璃纤维膜上金标rR7蛋白的释放情况以及检测线和质控线的显色情况。
测试结果显示，预处理的玻璃纤维膜制成的金标垫和样品垫亲水性更好，金标蛋白释放较完全且分布均匀，检测线和质控线显色清晰。
3.硝酸纤维素膜(NC膜)的选择
用玻璃纤维膜Ahlstrom 8964制备金标垫，将不同型号的硝酸纤维素膜WhatmanPrima 40、Millipore 135、Millipore 180制成反应垫，其余步骤不变，分别组装成试纸条。用卡氏住白细胞虫标准阳性血清和阴性血清进行测试，肉眼观察比较金标蛋白在不同NC膜上的层析速度和反应后NC膜的背景色。
结果如表4所示，NC膜Millipore 135反应后背景色较浅，层析速度适中，扩散均匀，因此选择NC膜Millipore 135用于制备反应垫。
表4不同NC膜的测定结果
NC膜型号 Whatman Prima 40 Millipore 135 Millipore 180
层析速度 较快 适中 较慢
背景色情况 较浅 适中 较深
4.金标rR7蛋白最佳稀释度的确定
将纯化的金标rR7蛋白用l/20原体积的金标复溶液溶解后，按照不同稀释度(1:1、1:2、1:3、1:4)喷涂于玻璃纤维膜Ahlstrom 8964上制成金标垫，分别将重组R7蛋白和兔抗R7多抗包被于NC膜Millipore 135上作为检测线和质控线，组装成试纸条。用卡氏住白细胞虫标准阳性血清和阴性血清进行测试，肉眼观察反应后检测线和质控线颜色的深浅、NC膜背景色的深浅，从而确定金标rR7蛋白的最佳稀释度。
结果如表5所示，当金标rR7蛋白的稀释度为1:3时，检测线和质控线显色清晰，背景色较浅，因此确定金标rR7蛋白的最佳稀释度为1:3。
表5金标rR7蛋白最佳稀释度的确定
金标蛋白稀释度 1:1 1:2 1:3 1:4
T线/C线显色情况 深 深 深 较浅
背景色情况 深 深 较浅 较浅
5.检测线抗原最佳包被浓度的确定
将rR7蛋白用T线/C线稀释液进行梯度稀释(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL)，分别包被于NC膜检测线处，在NC膜质控线处包被1.0mg/mL兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体，其他条件一致，组装成试纸条。用卡氏住白细胞虫标准阳性血清和阴性血清进行测试，根据肉眼观察检测线颜色的深浅来判定rR7蛋白的最佳包被浓度。
结果如表6所示，可确定rR7蛋白的最佳包被浓度为2.5mg/mL，此浓度的检测线处出现清晰的红线。
表6 rR7蛋白最佳包被浓度的确定
Figure BDA0002440870310000111
注：+表示显色浅；++表示显色深；+++表示显色很深。
6.质控线抗体最佳包被浓度的确定
将最佳包被浓度的rR7蛋白包被于NC膜检测线处，用T线/C线稀释液将兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体进行梯度稀释(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL)，分别包被于NC膜质控线处，其他条件一致，组装试纸条。用卡氏住白细胞虫标准阳性血清和阴性血清进行测试，根据肉眼观察检测线颜色的深浅来判定兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体的最佳包被浓度。
结果如表7所示，可确定兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体的最佳包被浓度为0.8mg/mL，此浓度的检测线处出现清晰的红线。
表7兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体最佳包被浓度的确定
Figure BDA0002440870310000112
注：+表示显色浅；++表示显色深；+++表示显色很深。
应用实验：试纸条特异性、敏感性和稳定性的测定
按照上述优化的条件进行胶体金检测试纸条的制备，用制备的试纸条进行特异性、敏感性和稳定性的测定。
1.特异性试验
将鸡球虫、鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒以及鸡痘病毒的标准阳性血清稀释后分别加到试纸条样品垫上，10min后观察结果。再将卡氏住白细胞虫阳性血清、阴性血清稀释后分别加到样品垫上作为对照组，10min后观察结果。
结果显示，只有检测卡氏住白细胞虫阳性血清的试纸条在T线、C线上均出现清晰的红线，为阳性结果。检测鸡球虫、鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒以及鸡痘病毒标准阳性血清的试纸条和检测卡氏住白细胞虫阴性血清的试纸条均只有C线处有红线，全为阴性结果。证明该胶体金检测试纸条的反应是特异的。
2.敏感性试验
将卡氏住白细胞虫阳性血清按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128稀释后，分别滴于试纸条样品垫上，10min后观察结果。
结果显示当样品稀释度为1:32时在T线、C线上可见浅浅的条带，说明其最高检测稀释倍数在1:32左右，表明其敏感性良好。
3.重复性试验
将3个不同批次的胶体金试纸条对相同的鸡卡氏住白细胞虫阳性血清和阴性血清进行检测，每个样品设3个重复，观察结果看其重复性是否稳定一致。
观察发现不同批次试纸条检测结果一致，说明该试纸条具有良好的重复性。
4.稳定性试验
将制备好的试纸条密闭包装，分别置于4℃、室温和37℃条件下保存，其中置于4℃和室温条件的试纸条每隔一周取出若干条，置于37℃的试纸条每天取出若干条，分别检测鸡卡氏住白细胞虫阳性血清和阴性血清。4℃和室温条件下的保存试验持续8个月，37℃条件下保存试验持续30d，观察其稳定性。
结果显示，试纸条在4℃保存6个月，室温保存60d，37℃保存7d，检测结果未发生改变。
实施例5
临床样品检测
实施例3制备的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条。
取出制备好的胶体金试纸条平铺在水平面上，将临床鸡血清样品用样品稀释液按1:2比例稀释，吸取50μL稀释后鸡血清样品缓慢加到样品垫上，等待10min，观察并记录结果。
对比例1
一种基于重组R7蛋白的间接ELISA方法，包括以下步骤：
(1)包被抗原：将卡氏住白细胞虫重组R7蛋白用pH为9.6、0.2mol/L NaHCO3稀释到0.65μg/mL，100μL/孔，在37℃下包被2h；
(2)洗涤：甩干孔内液体后拍干，加入PBST，300μL/孔，洗涤4次，再拍干；
(3)封闭：加入5％脱脂奶，200μL/孔，4℃封闭过夜，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(4)加入血清：用5％脱脂奶把待检血清稀释500倍，充分混匀，加入稀释好的血清，100μL/孔，37℃孵育1h，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(5)加入酶标二抗：加入1:4000稀释的山羊抗鸡IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育30min，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(6)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色15min；
(7)终止：加入2mol/L H2SO4终止显色，50μL/孔；
(8)读数：用酶标仪检测450nm波长OD值，并读取。
对比例2
一种血涂片法，包括以下步骤：
翅下抽血到抗凝管中，用抗凝血制作血液涂片，瑞氏染色，观察血涂片中是否有虫体出现。
将实施例5和对比例1-2的3种方法检测100份临床血清样品的结果如表8所示。
表8对比试验结果
Figure BDA0002440870310000131
在暴发过卡氏住白细胞虫病的养殖场随机抽取100只鸡，翅下静脉抽血，每只鸡抽取2份血液，一份分离出血清，用胶体金检测试剂盒和间接ELISA方法检测，另一份加入抗凝剂用血涂片法检查。用本发明的基于重组R7蛋白的胶体金检测试纸条检测100份临床血液样品的阳性率为61％，用基于重组R7蛋白的间接ELISA方法检测的阳性率74％，用传统的血涂片检查法的阳性率是28％；说明本发明的胶体金检测试剂盒的灵敏性稍低于间接ELISA方法，而远远高于传统的血涂片检查法。血涂片法需要光学显微镜，检测人员需要准确识别卡氏住白细胞虫各个阶段的虫体，检查1块血涂片用时约5min，检测数量越多越耗时，且检测效率和检出率低。间接ELISA方法可同时检测上百个样品，一次检测时间约3h，需要酶标仪、洗板机、恒温箱等仪器，对人员和硬件设备要求较高，成本大大增加。而胶体金检测试剂盒不需要任何仪器设备，操作非常简单，稀释血清加到样品垫上，10-15min后即可读出结果，大大节约了人力、物力和时间，特别适合大批量快速检测。

Claims (9)

1.一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜Ahlstrom 8964，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜Millipore 135；所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A、金标垫及样品垫的预处理：
分别将用于制备金标垫及样品垫的玻璃纤维膜Ahlstrom 8964浸泡在pH为7.4，0.015mol/L的PBS预处理液中，3h后取出，37℃烘干，4℃干燥保存，其中所述PBS预处理液含2％PEG，2％PVP，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3；
B、金标垫的制备：
(1)胶体金的制备：将氯金酸水溶液加入超纯水中，加热，再加入柠檬酸三钠水溶液搅拌，继续煮沸，冷却，定容，即获得胶体金溶液，避光保存备用；
(2)金标重组R7蛋白的制备：用K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调至6.0-6.5，向胶体金溶液中加入重组R7蛋白，搅拌后静置，再加入BSA溶液封闭，搅拌静置，离心，取上清液，再离心，收集紫红色絮状沉淀，加入金标复溶液，混合，即得金标重组R7蛋白溶液；
(3)金标垫的制备：将金标重组R7蛋白溶液稀释至稀释度为1:3，再喷涂在经过步骤A处理的玻璃纤维膜Ahlstrom 8964上，烘干，得到金标垫，密封保存；
C、反应垫的制备：
(1)将重组R7蛋白和兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体用稀释液分别稀释成2.5mg/mL的检测线溶液和0.8mg/mL的质控线溶液，将检测线溶液喷涂于硝酸纤维素膜Millipore 135上形成检测线，将质控线溶液喷涂于硝酸纤维素膜Millipore 135上形成质控线，得到反应垫，密封干燥保存，备用；
D、试纸条的制备：
(1)将底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫组合，在底板先粘上反应垫和吸水垫，反应垫与吸水垫相互交叠，且吸水垫在反应垫的上边，在反应垫的上边依次粘贴金标垫和样品垫，反应垫和金标垫之间以及金标垫与样品垫之间相互交叠，即得所述检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条。
2.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述重组R7蛋白由如下方法制备而成：
(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；
(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coli TOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；
(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coli BL21表达菌，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；
(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。
3.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫的制备中：所述氯金酸水溶液与超纯水的比值为1:(100-105)。
4.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫的制备中：所述氯金酸水溶液的质量百分数为0.5-2％，所述柠檬酸三钠水溶液的质量百分数为0.5-2％，所述BSA溶液的质量百分数为5-10％。
5.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫的制备中：所述金标复溶液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含4％蔗糖，1％海藻糖，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3；所述金标复溶液和原胶体金溶液的体积比为1:(18-20)；所述稀释所用的溶液为金标复溶液。
6.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫的制备中：喷涂的量为2-4μL/cm2，烘干的温度为35℃-37℃，时间为10-12h。
7.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述反应垫的制备中：所述稀释液为pH为7.4的0.015mol/L PBS；所述PBS，按质量分数计，含4％蔗糖和0.02％NaN3。
8.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述反应垫的制备中：所述检测线与质控线相距0.65-0.7cm，距硝酸纤维素膜的边距分别为0.9-1.0cm。
9.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述预处理液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含2％PEG，2％PVP，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3。
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