CN103257226B

CN103257226B - 莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN103257226B
Application number: CN201310121592.8A
Authority: CN
Inventors: 赖卫华; 彭涛; 杨万春; 陈媛; 刘文娟
Original assignee: ZHONGDE BIO-ENGRG Co Ltd JIANGXI
Current assignee: ZHONGDE BIO-ENGRG Co Ltd JIANGXI
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN103257226A

Abstract

本发明提出了一种莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条及其制备方法，其中莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述金标垫上是含有胶体金标记的抗莱克多巴胺单克隆抗体、胶体金标记的沙丁胺醇多克隆抗体和胶体金标记的西马特罗单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有三条检测线和一条质控线。利用该试纸配合胶体金读取仪能有效的定量检测莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗。

Description

莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于食品安全领域中涉及β₂-受体激动剂残留检测领域。具体而言，本发明涉及莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗二联胶体金试纸条及其制备方法与用途。

背景技术

莱克多巴胺(Ractopamine)、沙丁胺醇(Salbutamol)、西马特罗(Cimaterol)都属于β₂-受体激动剂，而且近年来它们都被用作盐酸克伦特罗的主要替代品。众所周知，β₂-受体激动剂类药物用于畜牧养殖业可促进饲料转化率、增加瘦肉产量。β₂-受体激动剂能导致心悸、头疼、目眩、恶心甚至损害肝肾，我国及世界上许多其他国家已将该类药物列为禁用药物然而，受经济利益驱动而且缺乏有效的检测体系，目前养殖领域仍存在β₂-受体激动剂类药物的非法使用现象。另外，在国家的高压态势下瘦肉精已得到了很好的控制，但一些不法分子为谋取经济利益，在养殖场非法使用莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗等代替瘦肉精作为促生长剂。

目前，国内外检测莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、液相色谱质谱联用技术(LC-MS)。但是上述方法所用的仪器设备昂贵复杂、成本高，同时需要对操作人员进行特殊培训，且实验结果不能立即显示，因此不适用于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象的快速在线检测和监控。

胶体金试纸条方法是一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法，具有快速方便、灵敏度高、检测时间短等优点，而且在食品检测领域也得到了较大的发展，但是胶体金试纸条仍有以下缺点：

(1)只有当金颗粒集聚到一定量(10⁷个/mm²)时，才出现肉眼可见的紫红条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。

(2)样品基质效应明显，背景干扰大。

(3)无法实现定量检测。

(4)一次只能检测单个污染物

此外，虽然现在也有能单独检测莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗的检测卡，但迄今为止，仍没有一种能同时定性且定量检测莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗的产品。

因此，目前对于同时定量检测莱克多巴胺、沙丁胺醇与西马特罗的检测手段仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能有效检测莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗的三联试纸条及其制备方法和用途。

在本发明的第一方面，参考图1，本发明提出了一种莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条，包括：

底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，

其中，所述金标垫上是含有胶体金标记的抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗沙丁胺醇多克隆抗体和胶体金标记的西马特罗单克隆抗体，

所述硝酸纤维素膜上进一步形成有三条检测线和一条质控线，

所述检测线依次由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原线状点样、能与抗沙丁胺醇多克隆抗体结合的沙丁胺醇检测抗原线状点样和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，

所述质控线由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合、能与抗沙丁胺醇多克隆抗体结合和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。

由此，可以有效地获得莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗三联胶体金试纸条，从而对样品中莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗进行定量检测。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条的方法，其包括下列步骤：

制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有三条检测线和一条质控线；

制备金标垫；以及

组装试纸条，

其中，

用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原、能与抗沙丁胺醇多克隆抗体结合的沙丁胺醇检测抗原和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样分别作为所述两条检测线；

用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合、能与沙丁胺醇多克隆抗体结合和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。

由此，通过本发明的方法，能有效制备前面所述的莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗三联胶体金试纸条，从而对样品中莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗进行定量检测。

将硝酸纤维素膜按20mm～30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2mg/mL～1.0mg/mL的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15mm～18mm，检测线之间相隔5mm；将经纯化浓度调整为0.5mg/mL～1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边11mm～13mm；将所述硝酸纤维素膜于37摄氏度烘干处理过夜后，在室温干燥的环境下保存。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备大小均一、位置固定并且分别具有特定浓度抗原、抗体的检测线和质控线，从而获得具有检测线和质控线的莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗三联胶体金试纸条，进而有效地对莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗进行定量检测。

根据本发明的实施例，金标垫是通过下列步骤获得的：分别选用能与莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗检测抗原结合的莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇多克隆抗体和西马特罗单克隆抗体用胶体金标记；把所述的用胶体金标记过的莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇多克隆抗体和西马特罗单克隆抗体混合后，喷在玻璃纤维膜上。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有能与莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗检测抗原结合的莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗抗体用胶体金标记的金标垫，从而获得具有金标垫的莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗三联胶体金试纸条，进而有效地对莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗进行定量检测。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条检测西马特罗的方法，包括以下步骤：配制已知系列浓度的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗混合标准品并加入所述胶体金读取仪的样本孔中，10分钟后检测对应的光密度数值并建立标准曲线，将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中，读取检测数值，以及通过所述标准曲线计算所述检测样品中莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗含量。由此，通过本发明所提供的方法，可以有效地制备采用该胶体金读取仪检测莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗的校准曲线，从而配合本发明提供的莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗三联胶体金试纸条有效地对莱克多巴胺、西马特罗进行定量检测。

有益效果

1、多残留监测：本发明采用莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条能根据T线和C线的显色情况同时监测样品中莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗的污染情况。

2、灵敏度高：本发明采用莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，能通过仪器替代肉眼观察实验结果，克服了肉眼判断带来的误差，从而提高了检测灵敏度，本方法检测莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗的灵敏度分别为0.5ppb、1ppb和1ppb。

3、定量：本发明采用莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，可以根据胶体金读取仪显示器上的显示数值，参照标准曲线即可分别得出被检样品中莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗的含量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸的结构图；

图2是根据本发明实施例的一种胶体金读取仪的示意图；

图3是根据本发明实施例的定量检测西马特罗、沙丁胺醇、西马特罗流程图。

具体实施方式

本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1免疫抗原的合成

1.1合成莱克多巴胺免疫抗原

采用混合酸酐法制备莱克多巴胺-BSA免疫抗原：称取莱克多巴胺34mg和10mg丁二酸酐在2mL吡啶中反应，室温下搅拌过夜，置于通风橱中将吡啶完全蒸发，此反应产物为莱克多巴胺-半丁二酸酐；将其溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺和2mL1,4-二氧六环混合物中，再加26.2μL的三正丁胺，在冰浴中搅拌10分钟，再加氯甲酸异丁酯15L，室温反应，搅拌1小时；将此混合物逐滴加入预冷的蛋白溶液(100mgBSA溶解于0.1M硼酸钠pH8.5)，室温反应过夜，在PBS中透析72小时以上，透析后即得到纯化的莱克多巴胺-BSA免疫抗原。

1.2合成沙丁胺醇免疫抗原

采用琥珀酸酐法制备沙丁胺醇免疫抗原：将150mg沙丁胺醇加到15mL甲醇中，使之溶解，旋转蒸发后，加入20mL无水乙醇，室温搅拌4h；充分溶解后加入80mg琥珀酸酐，磁力搅拌反应72小时，即得到沙丁胺醇琥珀酸衍生物(Sal-HS)；称取20mg上述制得的沙丁胺醇琥珀酸衍生物用2mLTris-HCl缓冲液中，充分溶解后缓缓加入40mg碳二亚胺，室温搅拌过夜；取10mgBSA充分溶解于Tris-HCl缓冲液中后，将BSA溶液逐滴加入上述反应液中，搅拌反应过夜。反应结束后，装入透析袋透析48小时，期间换液6～9次，即得沙丁胺醇免疫抗原(Sal-HS-BSA)。

1.3合成西马特罗免疫抗原

采用重氮化法合成西马特罗-BSA免疫抗原：称取西马特罗4.0mg于10mL锥形瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液1.5mL溶解，冰浴冷却；在避光条件下，边搅拌边逐滴加入用灭菌双蒸水溶解的1mol/LNaNO₂溶液适量(淀粉碘化钾试纸呈蓝黑色为宜)后，4摄氏度条件下反应6小时即得重氮化西马特罗；称取10mgBSA用1mLPBS(pH7.4)溶解，预冷后边搅拌边逐滴加入重氮化西马特罗，用1mol/L的NaOH溶液调pH至8.5左右后，4摄氏度条件下过夜反应；然后将反应产物在4摄氏度搅拌下用PBS透析3d，每天换液3次，透析后即得到纯化的西马特罗-BSA免疫抗原。

实施例2免疫原单克隆抗体的制备及效价检测

2.1莱克多巴胺单克隆抗体的制备

取8周龄雌性BALB/c小鼠，用0.1mL莱克多巴胺-BSA与等体积完全福氏佐剂制成的乳剂，腹腔注射法对每只小鼠进行初次免疫；此后取同样剂量免疫原加不完全福氏佐剂，同法每隔1个月加强免疫1次；第3、4次免疫后10～14天用间接ELISA测定抗体效价，最后选择抗体效价高者进行细胞融合。在无菌条件下取免疫小鼠的脾细胞，与SP2/O骨髓瘤细胞融合按5:1比例融合后，加入HAT培养基，37摄氏度、6%CO₂培养箱中培养；5天后用新鲜HAT培养基换出一半的培养基，10天后用HT培养基换出HAT培养基；每天观察杂交瘤细胞的生长情况，待其分布至孔底面积10%以上时，吸出上清液做抗体检测；用莱克多巴胺-BSA作为检测抗原，间接ELISA试验筛选出选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。

每只BALB/c小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL，7～14d后腹腔注射经克隆化后的杂交瘤细胞0.5mL(1～2×10⁶)，10天后抽取腹水，用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经核酸-蛋白分析仪测定抗莱克多巴胺单克隆抗体的含量。

2.2莱克多巴胺单克隆抗体效价的测定

采用间接ELISA方法测定抗莱克多巴胺单克隆抗体效价。用0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液稀释检测原至10μg/mL，再分别稀释至终浓度为2.5μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL、0.05μg/mL和0.01μg/mL，分别包被酶标板，每孔加入100μL，4摄氏度包被过夜。用0.01mol/LPBS250μL洗板两次。每孔加入1%明胶360μL，37摄氏度孵育1小时后，拍干。用0.01mol/LPBS将抗莱克多巴胺单克隆抗体效价稀释1000，再倍比稀释6个梯度至128000倍；将免疫前小鼠血清作为阴性对照；以0.01mol/LPBS作为空白对照。每孔各加入样本、阴性对照、空白对照各100μL，37摄氏度孵育0.5h。按9:1比例用0.01mol/LPBS稀释酶标记羊抗鼠二抗，取100μL加入孔内，37摄氏度孵育0.5小时。取0.01mol/LPBS250μL洗板五次后，加入100μLTMB显色液，37摄氏度孵育15分钟，再加入50μL2mol/L硫酸溶液，用酶标仪测定OD450值。以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.1且OD值大于0.3为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，结果表明，抗莱克多巴胺单克隆抗体效价大于1:256000。

2.3沙丁胺醇多克隆抗体的制备

取3只健康雄性新西兰大白兔，耳缘静脉取血后作为阴性对照。首次免疫，将弗氏完全佐剂与等体积免疫抗原Sal-HS-BSA混合，乳化后颈背部皮下多点注射；免疫间隔2周后，将弗氏不完全佐剂与等体积免疫抗原混合，乳化后颈背部皮下多点注射进行第2、3、4、5次免疫，免疫间隔时间为2周，第5次免疫两周后静脉取血，用间接ELISA法测定抗血清效价，并用正辛酸-硫酸铵沉淀法来分离纯化抗体，经SDS-PAGE凝胶电泳测定沙丁胺醇多克隆抗体的含量。

2.4抗沙丁胺醇多克隆抗体效价的测定

以1μg/mL浓度按每孔100μL包被酶标板，4摄氏度包被过夜，洗涤5次，拍干，按每孔200μL封闭液4摄氏度下封闭12h，洗涤3次，拍干。按每孔100μL加入抗血清稀释倍数为400、2000、10000、50000、250000、1250000，阴性血清及空白(不加抗血清，只加其稀释液)室温作用30分钟，洗涤五次，拍干。加入每孔100μL酶标二抗，室温作用30分钟，洗涤五次，拍干。加入每孔100μL显色液，37摄氏度避光作用15分钟。加入每孔50μL终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。以2.1倍于阴性血清OD值的血清OD值对应的抗血清稀释度为抗血清效价。结果表明，抗沙丁胺醇多克隆抗体效价大于1:250000。

2.5西马特罗单克隆抗体的制备

以重氮化法合成西马特罗-BSA人工抗原并鉴定后免疫4只6周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5分钟弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37摄氏度水浴中。把1mL50%PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1分钟后，前30秒沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30秒加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5分钟，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37摄氏度、体积分数5%的CO₂条件下培养。7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。

采用体内诱生腹水法生产抗西马特罗单克隆抗体。选4只经产BALB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×10⁶/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经核酸-蛋白分析仪测定抗西马特罗单克隆抗体的含量。

2.6西马特罗单克隆抗体效价的测定

采用间接ELISA方法测定抗西马特罗单克隆抗体效价。用0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液稀释检测原至10μg/mL，再分别稀释至终浓度为2.5μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL、0.05μg/mL和0.01μg/mL，分别包被酶标板，每孔加入100μL，4摄氏度包被过夜。用0.01mol/LPBS250μL洗板两次。每孔加入1%明胶360μL，37摄氏度孵育1小时后，拍干。用0.01mol/LPBS将抗西马特罗单克隆抗体效价稀释1000，再倍比稀释6个梯度至128000倍；将免疫前小鼠血清作为阴性对照；以0.01mol/LPBS作为空白对照。每孔各加入样本、阴性对照、空白对照各100μL，37摄氏度孵育0.5小时。按9:1比例用0.01mol/LPBS稀释酶标记羊抗鼠二抗，取100μL加入孔内，37摄氏度孵育0.5小时。取0.01mol/LPBS250μL洗板五次后，加入100μLTMB显色液，37摄氏度孵育15小时，再加入50μL2mol/L硫酸溶液，用酶标仪测定OD450值。以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.1且OD值大于0.3为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，结果表明，抗西马特罗单克隆抗体效价大于1:128000。

实施例3莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条的制备

3.1胶体金的制备

免疫胶体金制备的基本原理是，氯金酸在还原剂的作用下，聚合为一定大小的金颗粒，形成带负电荷的、由于静电作用而稳定的疏水胶溶液。本发明采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体过程如下：取0.01%氯金酸100mL水溶液加热至沸，搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液1.5mL，金黄色的氯金酸在2分钟内变为紫红色，关掉热源，继续高速搅拌10min后，调低转速至低档，继续搅拌1小时，冷却后用蒸馏水恢复原来的体积，即为制备的胶体金溶液。此胶体金溶液是否符合生产需求，除肉眼观察颜色需要为紫红色外，还需要采用紫外可见光分光光度计分析，胶体金溶液需在可见区525nm～527nm有最高吸收峰，同时，电镜图显示制备的胶体金颗粒均一性较好、颗粒大小约40nm。

3.2分别用胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇多克隆抗体和西马特罗单克隆抗体

用K₂CO₃溶液调节60mL胶体金溶液pH值至6.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入稀释浓度为1.6μg/mL的莱克多巴胺单克隆抗体6mL或稀释浓度为1.5μg/mL的沙丁胺醇多克隆抗体6mL或稀释浓度为1.5μg/mL的西马特罗单克隆抗体6mL，1小时后加入抗体量相当的PEG，充分反应30分钟后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30分钟。在9000rpm下离心30分钟获得均一性金标抗体沉淀，再加入6mLPNPB重悬备用。

3.3制备莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条快速检测卡

在PVC底板上，依次将滤纸、样品、喷有胶体金标记的莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇多克隆抗体和西马特罗单克隆抗体混合物的金标垫、喷有莱克多巴胺检测抗原、沙丁胺醇检测抗原和西马特罗检测抗原三条检测线和一条驴抗小鼠IgG抗体质控线的NC膜和吸水纸相互叠合固定，再切成试纸条，装在塑料模块中，制成胶体金快速检测卡。

实施例4样品中莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗残留的检测

4.1标准曲线的建立

以莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗混合标准品配制成已知的浓度系列，将标准品加入样本孔中，10分钟后在胶体金读取仪上检测，测出浓度对应的光密度值，然后以光密度值与阴性光密度值的比值为纵坐标，对应浓度为横坐标分别绘制出三条相应的标准曲线。

4.2样品检测

新鲜猪尿样恢复室温，直接加入样本孔，10分钟后，如果T线和C线同时显示紫红色条带，表示检测结果为阴性；如果C线显色而T线不显色，表示检测结果是阳性；如果T线和C线同时都不显色，表示试纸条失效。将被检样品的检测卡放入胶体金读取仪中检测，最后根据检测样本的数据输出的数值，参照标准曲线即可分别得出检测样本中莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗的含量。

实施例5莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条的灵敏度实验

通过实验得到，本发明中的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条检测莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗的灵敏度分别为0.5ppb、1ppb和1ppb，CV值小于15%。

实施例6莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条的特异性实验

在阴性的猪尿中（ELISA测定为阴性）分别加入去甲肾上腺素、肾上腺素、克伦特罗和特布他林，使其终浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL尿液。用试纸条检测的标准方法检测，判断试纸条检测的特异性，每种浓度的猪尿样做5次重复。检测结果都为阴性，说明检测卡特异性较强。

实施例7莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条的保质期实验

用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保存，每各一个月取出12个卡检测，用质控尿样检测，分别做阴性、0.5ppb、1ppb、2ppb样品，重复三次，扫描得出数据后和生产时的数据对照，观察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在一年时间内产品品质无变化，从而确定保质期为一年。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸条，其特征在于，包括：

其中，所述金标垫上是含有胶体金标记的抗莱克多巴胺单克隆抗体、胶体金标记的抗沙丁胺醇多克隆抗体和胶体金标记的西马特罗单克隆抗体，

所述质控线由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合、能与抗沙丁胺醇多克隆抗体结合和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成，

所述试纸条是通过下列方法制备获得，包括下列步骤：

制备金标垫；以及

组装试纸条，

其中，

用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原、能与抗沙丁胺醇多克隆抗体结合的沙丁胺醇检测抗原和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样分别作为所述三条检测线；

用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合、能与沙丁胺醇多克隆抗体结合和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线，

其中，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的：

将硝酸纤维素膜按20mm～30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2～1.0mg/mL的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15mm～18mm，检测线之间相隔5mm；

将经纯化浓度调整为0.5mg/mL～1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边11mm～13mm；

将所述硝酸纤维素膜于37摄氏度烘干处理过夜后，在室温干燥的环境下保存，

其中，金标垫是通过下列步骤获得的：

分别选用能与莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗检测抗原结合的莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇多克隆抗体和西马特罗单克隆抗体用胶体金标记；

把所述的用胶体金标记过的莱克多巴胺单克隆抗体、沙丁胺醇多克隆抗体和西马特罗单克隆抗体混合后，喷在玻璃纤维膜上；

所述的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗三联胶体金试纸配胶体金读取仪定量检测的方法，包括下列步骤：

配制已知系列浓度的莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗混合标准品并加入所述胶体金读取仪的样本孔中，

10分钟后检测对应的光密度数值并建立标准曲线，

将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中，

读取检测数值，以及

通过所述标准曲线计算所述检测样品中莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗含量。