CN103706331B - 快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱，由抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管所得，所述抗西马特罗免疫亲和填料由固相载体和与其偶联的西马特罗特异性多克隆抗体组成；所述的西马特罗特异性多克隆抗体是由西马特罗经重氮法重氮化后与载体蛋白偶联所得的偶联物为免疫原制备抗血清，再用免疫亲和法从抗血清中提纯得到的。本发明还公开了该免疫亲和柱的制备方法和用途。本发明的免疫亲和柱所用抗体特异性高，使用本发明的免疫亲和柱对样品进行前处理，再与色谱法、胶体金试纸条联合使用，可高效、准确检测西马特罗的含量。
Description
技术领域
本发明属于免疫学分离、纯化富集技术领域，涉及一种快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱及其制备方法和用途。
背景技术
西马特罗（CIM）属于苯乙胺类药物的一种，属于β-兴奋剂，在医学和兽医临床上主要用于扩张气管和增加肺通气量，可以用于哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痉挛和休克等症。研究显示，CIM可以提高瘦肉率、促进动物生长。因其经济效益明显，利益驱使养殖户或养殖企业大量使用，导致畜产品中西马特罗大量残留，人食用这类畜产品后，可引发肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心等中毒症状，特别是对血压、心脏病患者危害更大，长期使用可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。西马特罗在许多国家，特别是欧盟和中国，被禁止用做家畜促生长剂。所以，对动物来源的食品中西马特罗残留进行严格地检测是非常重要。
由于生物样本成分复杂，待测物浓度低，大多数取样量少，而我国明确规定禁止西马特罗及其衍生物在动物的饲养过程中使用，这就对分析方法的灵敏度、准确度有更高的要求。目前检测西马特罗的方法主要有高效液相色谱（HPLC-UV)、液相串联质谱法（LC-MS/MS）、气-质联机法（GC-MS），这些方法的样品前处理都在不同程度上存在过程繁琐、费时长、有机溶剂浪费多等缺点。
免疫亲和色谱是一种将免疫反应和色谱分析方法相结合的分析方法。采用高特异性抗体偶联于琼脂糖上制成的抗体免疫亲和填料，再装载成亲和柱。样品流过该亲和柱可以快速特异性纯化富集样品中的抗原待检物，样品经过这样的前处理，可以消除基体干扰，提高检测方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度，经处理后的样品再经高效液相色谱法（HPLC-UV)、液相串联质谱法（LC-MS/MS）、气-质联机法（GC-MS）、胶体金法检测，达到快速、灵敏、准确检测样品的目的。目前用免疫亲和色谱技术检测西马特罗未见报道，因此，急需开发一种西马特罗的免疫亲和色谱检测检测技术。
发明内容
针对上述技术问题，本发明公开了一种快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱，本发明还公开了该免疫亲和柱的制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱，由抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管所得，所述抗西马特罗免疫亲和填料由固相载体和与其偶联的经免疫亲和纯化的西马特罗特异性多克隆抗体组成；所述的经免疫亲和纯化的西马特罗特异性多克隆抗体是由西马特罗经重氮法重氮化后与载体蛋白偶联所得的偶联物为免疫原制备抗血清，再用免疫亲和法从抗血清中提纯得到的。
其中，所述固相载体为琼脂糖珠，优选地，所述琼脂糖珠为经过过碘酸钠氧化的琼脂糖珠。
其中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白；优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
制备上述快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱的方法，包括以下步骤：
（1）将西马特罗采用重氮法重氮化后偶联于载体蛋白上，制得免疫原，将免疫原免疫动物产生抗血清；
（2）将西马特罗偶联到固相载体上制得西马特罗免疫亲和柱，用于从抗血清中纯化提取西马特罗特异性多克隆抗体；
（3）将经免疫亲和纯化的西马特罗特异性多克隆抗体与固相载体偶联，制得抗西马特罗免疫亲和填料，将抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管，即得快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱。
其中，步骤（2）中所述的固相载体为琼脂糖琼脂糖珠，所述西马特罗免疫亲和柱的制备方法为：将被过碘酸钠氧化后的琼脂糖珠悬浮于碳酸钠溶液中，再将西马特罗溶解后快速与氧化后的琼脂糖珠混匀，室温反应过夜后，加入硼氢化钠稳定过夜，即得西马特罗偶联到琼脂糖珠上的填料，将填料装柱，洗去杂质，得到西马特罗免疫亲和柱。
其中，步骤（3）中所述的固相载体为琼脂糖珠，所述快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱的制备方法为：将经免疫亲和纯化的西马特罗特异性多克隆抗体和被过碘酸氧化的琼脂糖珠混匀，在室温反应30分钟，然后加入硼氢化钠在4℃静置30分钟后，得到西马特罗特异性多克隆抗体与琼脂糖珠偶联的填料，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液清洗填料，清洗4次，每次使用10倍填料体积的磷酸缓冲液，滴干磷酸缓冲液后加入等体积甘油，混匀，得到抗西马特罗免疫亲和填料，将抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管，每即得快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱。
通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：
（1）本发明所用西马特罗特异性多克隆抗体为经过免疫亲和一步法提纯的，抗体特异性高；采用高密度、大容量将特异性抗体偶联于活化的琼脂糖填料，使得特异性抗体和填料结合稳定，柱容量、回收率明显优于当前同类产品，达到排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性；
（2）本亲和纯化富集柱装载填料的微型化，填料装柱体积仅需25μL/柱，能使洗脱体积缩小，非常明显地提高检测的灵敏度；
（3）在使用本发明的免疫亲和柱检测西马特罗时，检测过程步骤简单，且检测准确性高。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例中使用的琼脂糖珠购自Sigma-Aldrich，型号为：含氨基琼脂糖（GBios，786-066）；其余试剂和仪器均可从市场上购买得到。
实施例快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱的制备
1.将西马特罗采用重氮法重氮化后偶联于载体蛋白上，制得免疫原，将免疫原免疫动物产生抗血清；具体步骤如下：
（1）西马特罗免疫原的制备
①称取10mg西马特罗标准品，溶于100uL四氢呋喃中，加入900μL1mol/LHCl，冷冻5分钟；加入50mg固体亚硝酸钠，冷冻2分钟后再摇匀，4℃继续反应30分钟，得到重氮化后的西马特罗；
②称取100mg牛血清白蛋白，溶于5mL0.1mol/LNa2CO3中，冷冻2分钟后再加入0.5mL饱和Na2CO3；
③将步骤①得到的西马特罗加到步骤②的牛血清蛋白溶液中室温摇床反应过夜；经SephadexG25脱盐得到西马特罗免疫原，分装保存待用；
（2）西马特罗多克隆抗血清制备
用新西兰大白兔为免疫动物，西马特罗免疫原浓度为1mg/mL,首次免疫用0.5mL，西马特罗免疫原加0.5mL磷酸缓冲液加1mL完全佐剂混匀多点注射，加强免疫用0.25mL疫苗加0.75mL磷酸缓冲液加1mL不完全佐剂混匀分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫一次，35～40天采集0.5mL血清检测滴度，用配对检测抗原包被做血清的间接ELISA检测，血清滴度达到1：6400后进行大量血清制备。
2.将西马特罗偶联到固相载体上制得西马特罗免疫亲和柱，用于从抗血清中纯化提取西马特罗特异性多克隆抗体；
（1）西马特罗免疫亲和填料和西马特罗免疫亲和柱的制备：
将100mg西马特罗溶于10mL四氢呋喃，和50mL被过碘酸钠氧化的琼脂糖珠混合，加入2ml饱和碳酸钠溶液反应，再加入100mg磞氢化钠稳定过夜，清洗后置4℃冰箱，用前将填料装柱，洗去杂质，得到西马特罗免疫亲和柱。
（2）西马特罗特异性多克隆抗体制备：
将150mL的抗血清流过步骤（1）所制的亲和柱。依次用10倍填料体积的PBSt（含0.05%吐温20的磷酸缓冲液）、10倍填料体积的1mol/L氯化钠清洗掉杂质后，柱上的特异性抗西马特罗抗体用2%乙酸洗脱。洗脱的抗体用透析袋透析或SephadexG25脱盐去掉乙酸，得到西马特罗特异性抗体，冻干备用。
3.将经免疫亲和纯化的西马特罗特异性多克隆抗体与固相载体偶联，制得抗西马特罗免疫亲和填料，将抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管，即得快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱，具体步骤如下：
（1）取经过碘酸钠活化的琼脂糖珠12mL转入空柱子中，用400mL蒸馏水洗，滴干，再过琼脂糖珠2倍体积的0.1mol/LNa2CO3，滴干备用；
（2）将1200mg经免疫亲和纯化的西马特罗特异性多克隆抗体用0.1mol/LNa2CO3溶解使浓度达20mg/mL，完全溶解后离心取上清；
（3）将步骤（2）所得的上清加入步骤（1）的柱中，收集流出液再次过柱，反复3～5次；用80mL蒸馏水把未结合的抗体洗出来，收集在一起；
（4）用蒸馏水配制浓度为10mg/mL的硼氢化钠溶液4.8mL，加入柱子中，振荡混匀，4℃反应30分钟；
（5）用10倍填料体积的磷酸缓冲液洗填料，滴干磷酸缓冲液，将填料移入干净的试管中，加入与填料体积相等的甘油，即得西抗马特罗免疫亲和填料。
（6）在空柱管内下端装上过滤膜，将抗马特罗免疫亲和填料装载入柱中，25μl/柱，然后填料上层盖上过滤膜，即得快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱，该免疫亲和纯化富集柱保存条件为：-20℃。
在使用该快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱检测西马特罗时，可将待测样品过柱、洗脱，纯化富集样品中的抗原待检物，再用胶体金法检测富集样品，可大大提高检测的准确度，并且整个检测过程步骤简单，易于在实验条件简单的地区广泛推广应用。
Claims (3)
1.一种快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱，由抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管所得，其特征在于：所述抗西马特罗免疫亲和填料由固相载体和与其偶联的西马特罗特异性多克隆抗体组成；所述的西马特罗特异性多克隆抗体是由西马特罗经重氮法重氮化后与载体蛋白偶联所得的偶联物为免疫原制备抗血清，再用免疫亲和法从抗血清中提纯得到的；
所述固相载体为经过过碘酸钠氧化的琼脂糖珠；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
2.制备权利要求1所述的快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将西马特罗采用重氮法重氮化后偶联于载体蛋白上，制得免疫原，将免疫原免疫动物产生抗血清；
(2)将西马特罗偶联到固相载体上制得西马特罗免疫亲和柱，用于从抗血清中纯化提取西马特罗特异性多克隆抗体；
(3)将经免疫亲和纯化的西马特罗特异性多克隆抗体与固相载体偶联，制得抗西马特罗免疫亲和填料，将抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管，即得快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱；
步骤(2)中所述的固相载体为琼脂糖珠，所述西马特罗免疫亲和柱的制备方法为：将被过碘酸钠氧化后的琼脂糖珠悬浮于碳酸钠溶液中，再将西马特罗溶解后快速与氧化后的琼脂糖珠混匀，室温反应过夜后，再加入硼氢化钠稳定过夜，即得西马特罗偶联到琼脂糖珠上的填料，将填料装柱，洗去杂质，得到西马特罗免疫亲和柱；
步骤(3)中所述的固相载体为琼脂糖珠，所述快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱的制备方法为：将西马特罗特异性多克隆抗体溶解后和被过碘酸氧化的琼脂糖珠混匀，在室温反应30分钟，然后加入硼氢化钠混匀，在4℃静置30分钟，得到西马特罗特异性多克隆抗体与琼脂糖珠偶联的填料，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液清洗填料，清洗4次，每次使用10倍填料体积的磷酸缓冲液，滴干磷酸缓冲液后加入等体积甘油，混匀，得到抗 西马特罗免疫亲和填料，将抗西马特罗免疫亲和填料装载入空柱管，即得快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱。
3.权利要求1所述的快速纯化富集西马特罗的免疫亲和柱用于从生物样本中纯化富集西马特罗的用途。
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