CN104031886A

CN104031886A - 一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体

Info

Publication number: CN104031886A
Application number: CN201410103273.9A
Authority: CN
Inventors: 沈建忠; 李建成; 张筱筱; 郭燕; 刘爽
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2034-03-19
Also published as: CN104031886B

Abstract

本发明公开了一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体。本发明提供的莫能菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株MON（简称杂交瘤细胞株MON），保藏号为CGMCC No.8952。杂交瘤细胞株MON分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。所述单克隆抗体与磁珠偶联得到的免疫磁珠也属于本发明的保护范围。在本发明中，免疫磁珠的作用是富集净化样品中的MON分子，最后通过间接竞争ELISA检测浓缩后的样品，推算出待检MON含量。此法实现了对超出常规免疫检测方法检测限（1ng/mL）的MON样品进行检测，有效提高了检测灵敏度。

Description

一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体。

背景技术

莫能菌素(monensin，MON)别名瘤胃素、莫能菌酸、欲可胖，于1967年首先由Haney等人从肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)的发酵液中分离得到，莫能菌素抗球虫谱广，对各种艾美耳球虫均有较强的抑杀作用，是二十世纪后期使用的主导抗球虫药物。另外莫能菌素还可用作牛和猪的促生长剂，提高饲料利用率与增重速度。由于莫能菌素的毒性较大，对人畜具有潜在危害性，其在动物组织中的残留问题日渐受到重视。我国已批准的动物性食品中莫能菌素最高残留限量为：牛羊可食用组织0.05μg/mL、鸡火鸡肌肉1.5μg/mL、鸡皮加脂肪3.0μg/mL、鸡肝脏4.5μg/mL。

目前莫能菌素的检测方法很多。微生物法经济、简单，但是灵敏度有限。因为莫能菌素缺乏紫外、荧光和电化学特征，因此基于HPLC都要对其衍生化引入发色团，尽管灵敏度高，但是前处理过程繁琐。液相色谱串联质谱技术的出现，避免了前处理中衍生化的过程，且灵敏度进一步提高，是各种兽药残留检测的确征方法，其检测限达0.05～0.2μg/kg，但仪器化程度高且价格昂贵，同时要求有专业的操作人员，不利于在基层推广及大量样本的筛选。

免疫磁珠(immunomagnctic beads,IMB)是免疫学与磁性载体技术结合而发展起来的一类新型材料。免疫磁珠是带有活性基团的磁性微球，与单克隆抗体偶联后，与相应的抗原靶物质特异地结合形成复合物。在没有外加磁场的情况下，免疫磁珠可以发生反应并将特异地吸附在其表面的靶物质稳定的悬浮在溶液中；在有外加磁场的情况下，可以迅速的分离免疫复合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体。

本发明提供的莫能菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株MON(简称杂交瘤细胞株MON)，已于2014年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.8952。

杂交瘤细胞株MON分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

所述单克隆抗体与磁珠偶联得到的免疫磁珠也属于本发明的保护范围。所述磁珠具体可为羧基磁珠。

本发明还保护杂交瘤细胞株MON或所述单克隆抗体在制备用于检测莫能菌素的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述单克隆抗体在检测莫能菌素中的应用。

本发明还保护所述免疫磁珠在制备用于富集莫能菌素的试剂盒中的应用。

本发明还保护所述免疫磁珠在富集莫能菌素中的应用。

本发明还保护式(Ⅰ)所示化合物；

R代表载体蛋白。

所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)。

本发明还保护一种用于检测待测样本中是否含有莫能菌素的试剂盒，包括所述免疫磁珠和所述单克隆抗体。所述试剂盒还可包括式(Ⅰ)所示化合物。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有莫能菌素的方法，依次包括如下步骤：(1)采用所述免疫磁珠富集待测样本中的莫能菌素，得到富集物；(2)采用式(Ⅰ)所示化合物为包被原，采用所述单克隆抗体为一抗，通过酶联免疫反应检测富集物中是否含有莫能菌素。

ELISA方法具有灵敏度高，特异性强，仪器设备要求低和样本处理相对简单等优点，适合于现场监控和大量样本的筛选。IMB可以在短时间内富集纯净抗原靶物质，这不仅显著缩短样品检测时间，消除免疫分析过程中免疫复合物与本底溶液分离困难的缺点，同时提高了检测效益和方法的灵敏度。

在本发明中，免疫磁珠的作用是富集净化样品中的MON分子，进一步通过磁性分离技术分离出MON分子，甲醇溶液的作用是将MON从免疫磁珠上提取出来，然后用水浴加热去除甲醇，此时提取液中的微量MON并没有随甲醇挥发掉，而是滞留在离心管中，在离心管内加入一定量的PBS缓冲液溶解MON，制成浓缩后的待检样品。最后通过间接竞争ELISA检测浓缩后的样品，推算出待检MON含量。此法实现了对超出常规免疫检测方法检测限(1ng/mL)的MON样品进行检测，有效提高了检测灵敏度。本发明的检测限可以提高5倍左右(0.2ng/mL)。并且，本方法分离效率高，方法的稳定性好，可以提高工作效率。

附图说明

图1为ELISA标准曲线。

图2为紫外-分光光度计检测偶联效果的结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

莫能菌素(MON)：湖北盛天恒创生物科技有限公司CAS号17090-79-8。羧基磁珠：天津市倍思乐色谱技术开发中心目录号3442。牛血清白蛋白(BSA)：Sigma公司，CAS号9048-46-8。鸡卵白蛋白(OVA)：Sigma公司，CAS号9006-50-1。Balb/c小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体：Jackson Immuno Research Laboratories公司，产品编号115-035-003。

莫能菌素的结构式如下：

实施例1、免疫原和包被原的制备

1、免疫原的制备

(1)取20mg莫能菌素，溶于2mL DMF，然后加入20μL三正丁胺，然后加入10μL氯甲酸异丁酯，120rpm室温振荡30min，得到反应液Ⅰ。

(2)取50mg BSA，溶于3mL pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液，得到反应液Ⅱ。

(3)将反应液Ⅰ逐滴加到反应液Ⅱ中，然后室温振荡24h。

(4)将步骤(3)得到的溶液装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液中透析3d(每天换液两次)，然后10000rpm离心10min，收集上清液，即为免疫原溶液，分装后于-20℃保存。

2、包被原的制备

(1)取20mg莫能菌素，溶于1.5mL DMF，然后依次加入25mg EDC和20mg NHS，室温振荡至溶液完全澄清(4-5h)，得到反应液Ⅰ。

(2)取35mg OVA,溶于4.5mL pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲溶液，得到反应液Ⅱ。

(3)将反应液Ⅰ逐滴加到反应液Ⅱ中，然后室温振荡24h。

(4)将步骤(3)得到的溶液装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液中透析3d(每天换液两次)，然后10000rpm离心10min，收集上清液，即为包被原溶液，分装后于-20℃保存。

免疫原和包被原的结构式如下：

R代表BSA或OVA。

实施例2、杂交瘤细胞的获得

首次免疫：将免疫原溶液与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2mL；

加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；

最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合。

将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为MON。莫能菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株MON已于2014年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.8952。

实施例3、莫能菌素单克隆抗体的制备

细胞培养基(7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)。

将莫能菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株MON置于细胞培养基中，37℃培养2天，采用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的细胞培养上清液进行纯化，得到莫能菌素单克隆抗体溶液(-20℃保存)。

单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

莫能菌素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度＝3.209mg/ml。

实施例4、单克隆抗体的应用

一、制作ELISA标准曲线

用莫能菌素和pH7.4、0.01M的PBS缓冲液制备不同浓度的莫能菌素溶液。莫能菌素浓度分别为640ng/mL、320ng/mL、160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL或2.5ng/mL。将pH7.4、0.01M的PBS缓冲液作为空白对照。

1、取实施例1制备的包被原溶液，用pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释，得到包被原浓度为1.5μg/mL(以蛋白量计)的包被液，将包被液加至酶标板，100μL/孔，37℃孵育2h，然后弃上清，用PBST溶液洗涤一遍，拍干。

2、加入封闭液(含0.25％酪蛋白、5％小牛血清的PBS缓冲液)，150μL/孔，37℃孵育1h，弃上清，拍干。

3、试验孔加入50μL莫能菌素溶液(或空白对照)和50μL单克隆抗体稀释液(采用pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液将实施例3得到的莫能菌素单克隆抗体溶液稀释至100000倍体积)；4℃孵育1h，弃上清，用PBST溶液洗涤4次，拍干。

4、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(5000倍稀释)，100μL/孔，37℃孵育30min，弃上清，用PBST溶液洗涤4次，拍干。

5、加DAB显色液(100μL/孔)，37℃孵育15min，然后加2M硫酸溶液(50μL/孔)，然后在酶标仪上于450nm测定各孔OD值。

采用Origin8.5作图，以莫能菌素浓度以10为底的对数为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制曲线，见图1。

抑制率(％)＝[(B₀-B)/B₀]×100％。B代表试验孔的OD值，B₀代表空白对照孔的OD值。抑制率为50％时的莫能菌素浓度即为该单抗的IC₅₀值。IC₅₀＝13.04ng/mL。

二、免疫磁珠制备

该过程把含有羧基的免疫磁珠与莫能菌素单克隆抗体偶联。具体步骤如下：

1、磁珠的活化

将200μL羧基磁珠加入2mL离心管中，经磁性分离去除上清，然后加入500μL活化缓冲溶液(含0.05％Tween-20的pH6.0、0.01M的MES缓冲液)，120rpm室温振荡20min，磁性分离后再用活化缓冲溶液洗涤两次。

2、磁珠与抗体的偶联(制备免疫磁珠)

(1)采用PBST溶液(含0.05％Tween-20的pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液)将实施例3得到的莫能菌素单克隆抗体溶液稀释，得到蛋白浓度为1.0mg/mL的单克隆抗体稀释液。

(2)将10μL步骤(1)得到的单克隆抗体稀释液与步骤1得到的活化后磁珠混合，37℃、200rpm振荡2h，磁性分离，收集磁珠。

(3)取步骤(2)得到的磁珠，加入500μL PBST溶液，轻摇重悬后，磁性分离并去除上清，再次加入500μL PBST溶液，轻摇重悬后，磁性分离并去除上清。

(4)取步骤(3)得到的磁珠，加入500μL封闭液(含0.1g/100mL BSA的pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液)，室温孵育30min。

(5)取步骤(4)得到的磁珠，加入500μL PBST溶液，轻摇重悬磁珠后，经磁性分离后去除上清，再次加入500μL PBST溶液，轻摇重悬后，磁性分离并去除上清。

(6)取步骤(5)得到的磁珠，加入500μL含0.02g/100mL NaN₃、0.1g/100mL BSA的PBST溶液，4℃保存备用。

将步骤(1)得到的单克隆抗体稀释液标记为pre。将步骤(2)的磁性分离中得到的上清标记为post。将步骤(3)的第一次磁性分离中得到的上清标记为wash1，第二次磁性分离中得到的上清标记为wash2。应用紫外-分光光度计，以PBST溶液调零，分别测定pre、pos、wash1、wash2在280nm处的吸光值，并做记录，结果如图2和表1所示。

表1 偶联抗体浓度检测

样品	抗体浓度(mg/mL)	A(260)/A(280)
			Pre(偶联前抗体)	0.956	0.68
Post(偶联后上清)	0.140	0.77
			Wash1(第一次洗涤液)	0.029	1.64
Wash2(第二次洗涤液)	0.003	6.30

参照表1测得的数值并按照以下公式：偶联率＝[OD280(pre)－OD280(post)-OD280(wash1)-OD280(wash2)]/OD280(pre)，计算出莫能菌素单克隆抗体在磁性微球表面的偶联率为82.0％。

三、免疫磁珠富集分离样品中的MON

1、用莫能菌素和pH7.4、0.01M的PBS缓冲液制备3ng/mL的莫能菌素溶液。

2、取4只50mL离心管，每个离心管中加入14mL pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。其中3只各加入1mL3ng/mL莫能菌素溶液，混合均匀，即得到0.2ng/mL的莫能菌素溶液。同时设置一管空白对照，即加入1mL pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。

3、步骤2得到的4只离心管中分别加入200μL步骤2得到的免疫磁珠(200μL免疫磁珠可吸附MON量大于10ng)，37℃、200rpm振荡30min，磁性分离，去除上清后用PBST溶液洗涤免疫磁珠3次，用甲醇对免疫磁珠提取3次(2min/次)，磁性分离并取液相，即为提取液，将提取液在60℃水浴中蒸干。

4、用150μL pH7.4、0.01M的PBS缓冲液溶解步骤3得到的干物质，得到待检样品。

四、间接竞争ELISA检测磁珠富集的样品中MON

3、每孔加入50μL步骤三得到的待检样品和50μL单克隆抗体稀释液(采用pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液将实施例3得到的莫能菌素单克隆抗体溶液稀释至100000倍体积)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。

4、每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(5000倍稀释)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。

5、每孔加入100μL TMB显色液，37℃恒温显色10min,然后每孔加入50μL终止液，放入酶标仪读数。

将读出的数据对照步骤一得到的标准曲线，待检溶液中的莫能菌素浓度为18.86ng/mL。

用35mg OVA代替50mg BSA，其它共实施例1的步骤1，得到的溶液代替实施例1制备的包被原溶液进行实施例4的步骤一，IC₅₀为21.99ng/mL。

Claims

1.莫能菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株MON，其保藏编号为CGMCC No.8952。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.将权利要求2所述单克隆抗体与磁珠偶联得到的免疫磁珠。

4.权利要求1所述杂交瘤细胞株MON或权利要求2所述单克隆抗体在制备用于检测莫能菌素的试剂盒中的应用。

5.权利要求2所述单克隆抗体在检测莫能菌素中的应用。

6.权利要求3所述免疫磁珠在制备用于富集莫能菌素的试剂盒中的应用。

7.权利要求3所述免疫磁珠再富集莫能菌素中的应用。

8.式（Ⅰ）所示化合物；

R代表载体蛋白。

9.一种用于检测待测样本中是否含有莫能菌素的试剂盒，包括权利要求3或4所述免疫磁珠和权利要求2所述单克隆抗体。

10.一种检测待测样本中是否含有莫能菌素的方法，依次包括如下步骤：

（1）采用所述免疫磁珠富集待测样本中的莫能菌素，得到富集物；

（2）采用式（Ⅰ）所示化合物为包被原，采用所述单克隆抗体为一抗，通过酶联免疫反应检测富集物中是否含有莫能菌素。