CN114184780A - 免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莱克多巴胺的方法及其单链抗体 - Google Patents

免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莱克多巴胺的方法及其单链抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了免疫磁珠净化‑酶联免疫试验检测莱克多巴胺的方法及其单链抗体。所述方法包括(1)采用免疫磁珠处理样品获得icELISA待检样品，实现所述样品中莱克多巴胺富集；(2)采用莱克多巴胺为包被原，采用所述的单链抗体或其抗原结合部分为一抗，通过间接酶联免疫反应检测步骤(1)获得的icELISA待检样品，确定所述样品是否含有莱克多巴胺或所述样品中莱克多巴胺含量。本发明提供的方法分离效率高，检测限为4.57μg/kg，方法简便、稳定性好，可以提高工作效率。

Description

免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莱克多巴胺的方法及其单 链抗体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莱克多巴胺的方法及其单链抗体。
背景技术
莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)是一种β-肾上腺素受体兴奋剂类药物，一类毒性低于盐酸克伦特罗的新型“瘦肉精”，代谢较快，检测相对困难，曾在畜牧生产上被用来代替盐酸克伦特罗使用。莱克多巴胺能促进动物机体营养再分配，加速蛋白质沉积及肌肉生长，抑制脂肪的合成，促进胴体生长与改善品质。莱克多巴胺化学性质稳定，在烹饪动物性食品时，并不破坏莱克多巴胺结构，食用含有莱克多巴胺动物性食品时可能会引起急性中毒及四肢肌肉颤动，心律失常，血压升高，长期食用可能诱发恶性肿瘤。世界各国在养殖业中对莱克多巴胺的使用有不同的规定，我国禁止生产、销售和在动物养殖中使用莱克多巴胺，国际食品法典委员会规定猪、牛的肾脏、肝脏、肌肉及脂肪中残留限量分别为0.09、0.04、0.01mg/kg。
目前莱克多巴胺的检测方法很多，常用RAC检测方法有高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附法、免疫层析法、化学发光法、电化学免疫传感器检测法等。为了极大简化样品前处理步骤以及节约成本，避免造成资源浪费，有必要开发一种可重复、低成本、高效率的检测方法。
免疫磁珠(immunomagnctic beads，IMB)是由免疫配基和载体微球结合而成的一种纳米级材料，中心是载体微球，由高磁性、强稳定性和特异吸附性能的金属小颗粒组成。以免疫学为基础，将磁珠的磁响应性与特异性免疫反应相结合，形成了抗原抗体磁珠免疫复合物，磁响应较高，在存在有磁场的地方可定向移动，达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的，能极大简化样品前处理步骤，避免造成资源浪费。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种莱克多巴胺或莱克多巴胺含量的检测方法。
本发明提供了莱克多巴胺或莱克多巴胺含量的检测方法，包括
(1)采用下述的免疫磁珠处理样品获得icELISA待检样品，实现所述样品中莱克多巴胺富集；
(2)采用莱克多巴胺为包被原，采用下述的单链抗体或其抗原结合部分为一抗，通过间接酶联免疫反应检测步骤(1)获得的icELISA待检样品，确定所述样品是否含有莱克多巴胺或所述样品中莱克多巴胺含量。
可选地，根据上述的检测方法，
步骤(1)包括混合样品和5％氨化甲醇，离心后收集上清液，吹干上清液，用PBS复溶，加入正己烷除脂，除去正己烷层，收集下层提取液；混合稀释后的下层提取液与下述的免疫磁珠反应获得富集莱克多巴胺的免疫磁珠；采用纯甲醇洗脱富集莱克多巴胺的免疫磁珠获得提取液，即为icELISA待检样品。
例如，步骤(1)包括混合样品和5％(体积百分比)氨化甲醇，离心后收集上清液和沉淀；混合所述沉淀和5％氨化甲醇，离心后收集上清液；合并两步上清液吹干，用PBS复溶，加入正己烷除脂，除去正己烷层，收集下层提取液；用PBS稀释获得稀释后的下层提取液；混合稀释后的下层提取液与下述的免疫磁珠反应获得富集莱克多巴胺的免疫磁珠；采用纯甲醇洗脱富集莱克多巴胺的免疫磁珠获得提取液；蒸干提取液后用PBS缓冲液溶解获得icELISA待检样品。
可选地，根据上述的检测方法，
步骤(2)包括以RAC-OVA作为包被原(例如，RAC-OVA OD450值在1.5-2.0)，以含0.25％酪蛋白、5％小牛血清的PBS缓冲液(溶剂为10mM(pH为7)PBS，溶质及其在所述封闭液中的浓度分别为酪蛋白0.25g/ml和小牛血清5g/ml)作为封闭液，以pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液做缓冲液稀释单链抗体或其抗原结合部分，依次进行包被原的包被、封闭、单链抗体或其抗原结合部分与待检样品的结合、与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体的结合、显色、终止和读反应体系的OD450nm值。
包被条件可为37℃孵育2h。封闭条件可为37℃孵育1h。单链抗体或其抗原结合部分稀释倍数可为1000倍体积。单链抗体或其抗原结合部分与待检样品的结合条件可为37℃恒温孵育30min。与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体的结合条件可为37℃恒温孵育30min。
本发明还提供了莱克多巴胺的单链抗体或其抗原结合部分，所述单链抗体或其抗原结合部分含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2第153-159位所示；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQID No.2第179-183位所示；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2第225-234位所示；所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2第24-39位所示；所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2第55-61位所示；所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2第94-102位所示。
可选地，根据上述的单链抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2第128-245位所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2第1-112位所示。
所述的单链抗体或其抗原结合部分的氨基酸序列可如SEQ ID No.2第1-245位所示。
莱克多巴胺的单链抗体或其抗原结合部分可还含有蛋白标签。所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。例如，莱克多巴胺的单链抗体或其抗原结合部分的氨基酸序列为在SEQ ID No.2第1-245位所示序列末端连接蛋白标签编码基因后得到的序列。
本发明还提供了与上述的单链抗体或其抗原结合部分相关的生物材料，所述生物材料为如下任一种：
B1)编码上述的单链抗体或其抗原结合部分的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
B1)所述核酸分子可为编码权利要求1-3任一所述的单链抗体或其抗原结合部分的基因，所述基因为如下A)或B)所述的DNA分子：
A)所述重链可变区的CDR1的编码基因序列如SEQ ID No.1中第457-477位所示；所述重链可变区的CDR2的编码基因序列如SEQ ID No.1中第535-549位所示；所述重链可变区的CDR3的编码基因序列如SEQ ID No.1中第673-702位所示；所述轻链可变区的CDR1的编码基因序列如SEQ ID No.1中第70-117位所示；所述轻链可变区的CDR2的编码基因序列如SEQID No.1中第163-183位所示；所述轻链可变区的CDR3的编码基因序列如SEQ ID No.1中第280-306位所示；
B)与A)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述单链抗体或其抗原结合部分的DNA。
本文中，术语“同一性”指与天然序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还提供了免疫磁珠，所述免疫磁珠的磁珠表面偶联有上述的单链抗体或其抗原结合部分。磁珠具体可为链霉亲和素磁珠，例如北京索莱宝生物技术公司，货号M2421的磁珠。
所述免疫磁珠的制备方法可包括(1)利用化学生物素法标记上述单链抗体或其抗原结合部分；(2)将磁珠与生物素标记的单链抗体或其抗原结合部分混合，孵育后磁性分离获得免疫磁珠。
本发明还提供用于富集莱克多巴胺的产品，包括上述的免疫磁珠。
本发明还提供用于检测莱克多巴胺或莱克多巴胺含量的产品，包括上述的单链抗体或其抗原结合部分。
可选地，根据上述用于检测莱克多巴胺或莱克多巴胺含量的产品，还包括上述的免疫磁珠。
可选地，根据上述用于检测莱克多巴胺或莱克多巴胺含量的产品，还包括记载如下方法的可读载体：
(1)采用所述的免疫磁珠处理样品获得icELISA待检样品，实现所述样品中莱克多巴胺富集；
(2)采用莱克多巴胺为包被原，采用所述的单链抗体或其抗原结合部分为一抗，通过间接酶联免疫反应检测步骤(1)获得的icELISA待检样品，确定所述样品是否含有莱克多巴胺或所述样品中莱克多巴胺含量。
上述的单链抗体或其抗原结合部分、上述的生物材料、上述的免疫磁珠、上述的产品的应用也属于本发明保护范围之内。
所述应用为在如下任一中的应用：
(1)制备检测莱克多巴胺的产品；
(2)检测莱克多巴胺；
(3)制备检测莱克多巴胺含量的产品；
(4)检测莱克多巴胺含量；
(5)制备富集莱克多巴胺的产品；
(6)富集莱克多巴胺。
在本发明中，免疫磁珠的作用是富集净化样品中的RAC分子，进一步通过磁性分离技术分离出RAC分子，甲醇溶液的作用是将RAC从免疫磁珠上提取出来，然后用水浴加热去除甲醇，此时提取液中的RAC并没有随甲醇挥发掉，而是滞留在离心管中，在离心管内加入一定量的PBS缓冲液溶解RAC，制成浓缩后的待检样品。最后通过间接竞争ELISA(icELISA)检测浓缩后的样品，推算出待检样品中RAC含量。
免疫磁珠可以在短时间内富集纯净抗原靶物质，这不仅显著缩短样品检测时间，消除免疫分析过程中免疫复合物与本底溶液分离困难的缺点，同时提高了检测效益和方法的灵敏度。
icELISA方法具有灵敏度高，特异性强，仪器设备要求低和样本处理相对简单等优点，适合于现场监控和大量样本的筛选。
本发明提供的检测方法分离效率高，检测限为4.57μg/kg，方法简便、稳定性好，可以提高工作效率。
附图说明
图1为pET22b(+)及其酶切琼脂糖凝胶电泳图。
图2为单克隆菌落的PCR鉴定。
图3为RAC-scFv SDS-PAGE及Western-blotting鉴定结果。
图4为实施例2绘制的标准曲线。
图5为实施例4绘制的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
莱克多巴胺(RAC)：Sigma公司，CAS号97825-25-7。链霉亲和素磁珠：北京索莱宝生物技术公司货号：M2421。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体：Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，产品编号115-035-003。
TMB显色液：美国Sigma公司，货号T0565。
终止液：浓硫酸22.2mL：国药集团化学试剂公司，超纯水177.8mL。
pET22b(+)质粒：南京金斯瑞生物技术有限公司。
2×YT培养基：胰蛋白胨1.7g，酵母提取物1g和NaCl 0.5g用Milli-Q超纯水定容至100mL，高温灭菌后储存于37℃恒温箱。
6×Protein loading buffer：北京全式金生物技术有限公司。
CB液(0.05M)：Na2CO3 0.15g和NaHCO3 0.29g，用Milli-Q超纯水定容至100mL。
RAC-OVA包被原：北京维德维康生物技术有限公司。
PEG化生物素：美国阿拉丁公司。
超纯水是来自Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。
实施例1、单链抗体的制备
1、重组表达载体pET22b(+)-RAC-scFv的构建
(1)RAC-scFv的密码子优化
在RAC-scFv的VL、VH氨基酸序列基础上，利用OptimumGeneTM密码子优化技术，优化RAC-scFv的密码子。
(2)RAC-scFv全基因设计
按照VL-Linker-VH的顺序设计RAC-scFv全基因，并在C端加入myc标签用于识别蛋白特异性，在myc标签后添加标签6×His，利用镍柱对His的亲和力对表达后蛋白进行纯化。选择自带6×His标签的pET22b(+)质粒和高表达的BL21(DE3)大肠杆菌作为宿主，将VL-Linker-VH-myc基因序列发送至金斯瑞公司，合成RAC-scFv基因。RAC-scFv基因序列如SEQID No.1所示，第1-336位为VL基因序列，第337-381位为Linker基因序列，第382-736位为VH基因序列，第737-774为myc基因序列，第70-117位为VL的CDR1编码序列，第163-183位为VL的CDR2编码序列，第280-306位为VL的CDR3编码序列，第457-477位为VH的CDR1编码序列，第535-549位为VH的CDR2编码序列，第673-702位为VH的CDR3编码序列。
(3)pET22b(+)质粒的双酶切
用Xhol和EcoRI酶对pET22b(+)质粒酶切，酶切后的浓度约为30.5ng/μL，pET22b(+)酶切后的凝胶电泳图如图1所示，其中，泳道M为KB Ladder；泳道1为pET22b(+)质粒；泳道2为pET22b(+)的EcoRI和XhoI酶切产物，酶切后片段大小约为5000bp。
(4)重组表达载体pET22b(+)-RAC-scFv的构建
用T4DNA连接酶将RAC-scFv基因与酶切后的质粒连接，构建表达载体pET22b(+)-RAC-scFv，插入片段与载体摩尔比约为3∶1。pET22b(+)-RAC-scFv是将pET22b(+)的Xhol和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为RAC-scFv基因，保持其它序列不变获得的载体。
(5)RAC-scFv的pET22b(+)表达系统的构建
取2μL上述连接产物pET22b(+)-RAC-scFv加入至50μL BL21(DE3)化学感受态细胞中(细胞处于刚刚融化状态时最佳)，轻轻混匀(用手指轻轻弹拨)，冰浴条件下静置30min，提前打开金属浴，设置温度为42℃，冰浴后热激45s，立即冰浴2min(该过程尽量不摇动离心管)。向离心管中加入500μL无菌的2×YT培养基(不含AMP)，混匀后置于37℃、200rpm培养1h使细菌复苏。经3000rpm离心5min后，将菌体涂布于含有AMP(100μg/mL)的2×YT平板培养基上，将细菌均匀涂开，倒置平板，37℃培养过夜。
2、转化子的鉴定
挑取上述培养过夜的单克隆菌落接种到16管(每管1mL)含AMP抗生素(100μg/mL)的2×YT液体培养基中，37℃、250rpm震荡培养1h。以T7和T7ter为引物对菌液PCR鉴定，筛选阳性克隆株。用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，结果如图2所示，其中，泳道M为DNA 5000ladder marker；泳道1-16为随机挑取的单克隆菌落。PCR扩增产物的分子量为1200bp，其中包括全长RAC-scFv基因、酶切位点、T7启动子、pelB前导肽序列、6×His标签等碱基，符合预期的大小，选取PCR阳性菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。经鉴定正确的阳性克隆菌分别接种于2mL含AMP(100μg/mL)的2×YT培养基中，37℃、200rpm培养至OD600＝0.3-0.4，向培养基中加入经高压灭菌冷却至室温的甘油，使甘油终浓度为20％，放置于-70℃冰箱中保存。
T7：TAATACGACTCACTATAGGG；
T7ter：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。
3、RAC-scFv目的蛋白的表达纯化
(1)RAC-scFv目的蛋白的诱导表达
将上述甘油菌按1∶100比例接种于含AMP(100μg/mL)的4mL 2×YT培养基中，37℃、200rpm过夜培养。将菌液转移至400mL含AMP(100μg/mL)的2×YT培养基中培养至OD600＝0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.25mM，37℃、150rpm培养4h。培养瓶冰浴5min，然后4℃、10000rpm离心10min，收集菌体，用预冷的PBS磷酸盐缓冲液(过0.22μm滤膜)洗涤菌体后，4℃、10000rpm离心10min收集菌体，菌体保存于-70℃冰箱。
(2)RAC-scFv蛋白样品的制备
用预冷的Binding buffer(0.69％50mM一水合磷酸二氢钠，1.754％300mM氯化钠，0.068％10mM咪唑，PH＝7.4)重悬步骤(1)获得的菌体，每克湿重菌体加入10mL的Bindingbuffer，置于冰水混合物中超声粉碎细胞(200W，2s/2s)，使菌体破碎成均一的悬液(20mL混合物大约超声30-40min)，4℃、10000rpm离心10min后，收集上清液，即为RAC-scFv蛋白提取液。取RAC-scFv蛋白提取液20μL，加入4μL的6×Protein loading buffer，混匀后于100℃中金属浴5min，10000rpm离心3min，取上清备用。
4、RAC-scFv纯化
RAC-scFv上含有6×His标签，此标签能与镍离子结合，因此采用镍离子亲和层析纯化蛋白。
(1)首先根据蛋白表达量，用合适体积的Ni-NTA填充纯化柱，约1h左右，Ni-NTA填充均匀，接着用10倍柱体积超纯水洗涤镍柱，再用10倍柱体积的Binding buffer(10mM咪唑)平衡柱子。
(2)用0.45μm滤膜过滤步骤3获得的上清，与镍填料混匀后4℃晃动结合2h，缓慢过柱，收集穿流液。
(3)全部上样液流出后，用Washing buffer(50mM咪唑)洗涤柱子，除去黏附在柱子上的杂蛋白，洗涤的同时用Bradford测定蛋白浓度，直到无蛋白流出为止。
(4)最后用Elution buffer(300mM咪唑)洗脱结合在柱子上的目的蛋白，收集洗脱液，洗脱的同时用Bradford测定蛋白浓度，直到无蛋白流出为止。
(5)洗脱蛋白在30kDa超滤管中洗涤4-5次除去盐及咪唑，浓缩后即为目的蛋白(即纯化后的蛋白)，测定其浓度，储存时加入等体积的甘油保护蛋白不变性，置于-20℃。
(6)镍柱再生：用10倍柱体积的超纯水洗涤，然后用20％乙醇封存置于4℃。
使用蛋白电泳结合Western-blotting的方法鉴定目的蛋白，并对目的蛋白的纯度作出分析。
ScFv的SDS-PAGE鉴定：
配置所需凝胶和溶液，清洗电泳槽和玻璃板，固定玻璃板后开始灌胶，灌胶时先快后慢，防止气泡出现。等胶块彻底凝固后，垂直方向小心拔出齿梳，即形成加样孔；取纯化后的蛋白100℃加热变性样品20μL；加入电泳液至没过玻璃板，确定无漏液后准备上样，加样结束后连接电源开始电泳，首先是低电压约80V电泳，约30min后样品已电泳至分离胶时，调整电压至120V，约1h电泳结束后关闭电源；小心取出玻璃板，撬开玻璃板取出胶块，将其浸泡在0.25％的考马斯亮蓝染色液中进行振荡染色2h，若染色不均匀，可适当延长染色时间；染色结束后，取出胶块，用蒸馏水清洗掉染色液，然后将其放入脱色液中浸泡，进行扩散脱色，脱色时要随时更换脱色液，直至使蛋白条带清晰。
ScFv的Western-blotting鉴定：
(1)蛋白条带清晰可见时，切去胶孔和浓缩胶后将分离胶浸泡在转移缓冲液中，剪同等大小的PVDF膜和6张滤纸，也浸泡在转移缓冲液中，使其充分湿润；按照从负极到正极，顺序依次为纤维素垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维素垫，进行放置。每一步都要随时赶走气泡，气泡会影响电转。
(2)放置好之后将转膜夹子固定在电泳槽中，安装完成后在110V电压下转移2h，整个转膜过程须在并与条件下进行，且要随时加冰以降温，转移结束后取膜。
(3)将膜正面朝上，在1×PBST溶液中晃动洗膜3次，每次洗10min。转移至5％脱脂奶中，室温晃动2h。
(4)封闭完全后取出膜，用1×PBST缓冲液洗涤，洗膜3次，每次洗10min。
(5)加入抗His抗体(用PBST以1∶5000稀释)，室温晃动结合约1h。接着洗膜，同第(4)步。
(6)加入HRP标记的羊抗鼠IgG(用PBST以1∶8000稀释)，室温晃动结合1h。弃去液体后，洗膜，同第(4)步。
(7)NC膜的正面朝上滴加显色液，避光显色后，在凝胶成像仪中，设定不同的曝光时间成像，保存清晰明亮的图片。
鉴定标准：实验结果出现的特异性蛋白条带大小与目的蛋白大小相符，且目的条带附近的杂带较少，即证明纯化后的蛋白代表为目的蛋白。
重组表达载体pET22b(+)-scFv经IPTG诱导后表达的目的蛋白RAC-scFv的C端有6×His标签，能通过镍纯化柱将其纯化出来。纯化后获得目的蛋白分子量约为33.7kDa，SDS-PAGE及Western-blotting鉴定结果见图3，其中，泳道M为10-180kDa protein marker，泳道1为SDS-PAGE鉴定结果，泳道2为Western-blotting鉴定结果，结果表明37℃、0.25mM IPTG、150rpm诱导4h后，表达载体在大肠杆菌中实现了目的蛋白的高效表达，分子量与预期大小相符合，400mL菌液诱导表达RAC-ScFv基因片段，纯化后的蛋白中含有单链抗体RAC-ScFv，其纯化后目的蛋白中单链抗体RAC-scFv总量为1.05mg(BCA试剂盒检测)，浓度为1.05mg/mL，纯度大于90％，纯化效果良好，可以用于后续试验。
RAC-ScFv的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2中，第1-112位为VL序列，第113-127位为Linker序列，第128-245位为VH序列，第128-258位为myc标签序列，第24-39位为VL的CDR1序列，第55-61位为VL的CDR2序列，第94-102位为VL的CDR3序列，第153-159位为VH的CDR1序列，第179-183位为VH的CDR2序列，第225-234位为VH的CDR3序列。由于pET22b(+)质粒自带6×His标签，因此pET22b(+)-RAC-scFv表达的RAC-ScFv末端还连接有6×His标签。
实施例2、制作ELISA标准曲线
(1)选择OD450值在1.5-2.0的抗原抗体稀释浓度为最佳工作浓度，以PBS稀释制备1、3、9、27、81ng/mL浓度的RAC标准品，同时将pH7.4、0.01M的PBS缓冲液作为空白对照。用CB液将RAC-OVA包被原稀释3000倍，每孔100μL，37℃避光孵育2h；然后弃上清，用PBST溶液洗涤一遍，拍干。
(2)加入封闭液(含0.25％(质量体积百分比)酪蛋白、5％(质量体积百分比)小牛血清的PBS缓冲液)，200μL/孔，37℃孵育1h，弃上清，拍干。
(3)每孔加入50μL不同浓度的标准品和50μL单链抗体稀释液(采用pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液将实施例1得到的纯化后的蛋白稀释至1000倍体积，稀释后单链抗体RAC-ScFv浓度为1.05mg/L)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。
(4)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(5000倍稀释)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。
(5)每孔加入100μLTMB显色液，37℃恒温显色10min，然后每孔加入50μL终止液，放入酶标仪读数。以标准品浓度的对数为横坐标，OD450值为纵坐标，用Origin软件绘制标准曲线，计算IC值，计算公式为：IC值＝B/B0，其中，B为标准品样本的OD值，B0为零标OD值，IC50表示IC值为50％，线性范围为3.8～19.6ng/mL。绘制RAC-scFv抑制标准曲线见图4，其IC50为8.7ng/mL。
实施例3、免疫磁珠制备
1、免疫磁珠制备
该过程为磁珠与生物素化莱克多巴胺单链抗体偶联。具体步骤如下：
(1)利用化学生物素法标记scFv。用CB液稀释实施例1得到的纯化后的蛋白使其单链抗体RAC-ScFv浓度为0.1mg/mL，分别取1mL置于3个1.5mL离心管中；边涡旋边迅速加入2μLPEG化生物素(1mg/mL)；混匀上述溶液，在37℃避光孵育1h(可用摇床加速反应)；反应结束，用10kDa的超滤管10min、3000rpm条件下超滤4次，PBS重悬，除去未偶联的生物素，即得到了生物素标记的scFv。
(2)利用生物素-链霉亲和素标记体系制备免疫磁珠，形成抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠多级放大的免疫磁珠。将1mg链霉亲和素磁珠(100μL)与100μL(300μg/mL)的生物素标记的scFv混合，于120rpm室温条件下孵育45min，待反应结束，磁分离上清，用400μLPBST清洗3次，磁力架分离获得免疫磁珠，并保留上清液，使用BCA试剂盒测定上清液中scFv的浓度，做3份平行，取浓度的平均值，并根据体积100μL，算出上清液中的抗体剩余量，计算出在添加30μg的生物素标记的scFv时磁珠偶联率为85.7％。最后用100μL磁珠保存液(含0.02g/100mL NaN3、0.1g/100mL BSA的PBST溶液)，重悬免疫磁珠，4℃保存备用。
实施例4、肝脏基质加标标准曲线制备
1、免疫磁珠富集分离样品中的RAC
准确称取2.0g(±0.02g)搅碎的空白猪肝脏样品(即没有额外添加RAC的猪肝脏样品)于10mL离心管中，加入5mL5％(体积百分比)氨化甲醇，于匀质仪中20000rpm混合10s，旋涡振荡器中震荡5min，4℃、4000rpm离心10min，收集上清液，向沉淀中再加入3mL 5％氨化甲醇，旋涡振荡器中震荡5min，4℃、4000rpm离心10min，合并两步上清液于40℃下氮气吹干，用10mLPBS复溶，加入10mL正己烷除脂10min，除去正己烷层，收集下层提取液，用5mLPBS稀释获得稀释后的下层提取液。
用稀释后的下层提取液倍比稀释RAC标准品获得待检样品，RAC在待检样品中的浓度分别为0、1、3、9、27、81ng/mL。
吸取500μL待检样品与0.4mg实施例3制备的免疫磁珠加入1.5mL离心管中，涡旋混匀，37℃摇床上120rpm反应15min，磁分离，用500μLPBS洗涤3次，磁分离并弃除上清，接下来进行洗脱。向上述离心管中加入100μL纯甲醇，重悬磁珠，涡旋混匀，37℃摇床上反应10min洗脱抗原，磁性分离并取液相，即为提取液，将提取液在60℃水浴中蒸干，用100uLpH7.4、0.01M的PBS缓冲液溶解得到的干物质，得到icELISA待检样品。
2、间接竞争ELISA检测磁珠富集的样品中RAC
(1)用CB液将RAC-OVA包被原稀释3000倍，每孔100μL，37℃避光孵育2h；然后弃上清，用PBST溶液洗涤一遍，拍干。
(2)加入封闭液(含0.25％酪蛋白、5％小牛血清的PBS缓冲液)，200μL/孔，37℃孵育1h，弃上清，拍干。
(3)每孔加入50μL步骤1得到的icELISA待检样品和50μL单链抗体稀释液(采用pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液将实施例1得到的纯化后蛋白稀释至1000倍体积，稀释后单链抗体RAC-ScFv浓度为1.05mg/L)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。
(4)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(5000倍稀释)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。
(5)每孔加入100μLTMB显色液，37℃恒温显色10min，然后每孔加入50μL终止液，放入酶标仪读数。
(6)以待检样品中标准品浓度的对数为横坐标，OD450值为纵坐标，用Origin软件绘制肝脏基质加标标准曲线，计算IC值。
对猪肝脏组织样品经前处理后，用提取液倍比稀释标准品，经多次重复实验，得到肝脏基质加标标准曲线，如图5。肝脏基质加标IC50为9.15ng/mL，线性范围为4.8～17.4ng/mL。根据实施例2得到RAC-scFv的标准曲线IC50为8.7ng/mL，线性范围为3.8～19.6ng/mL，说明猪肝脏基质对RAC的icELISA检测影响较小，免疫磁珠具有良好的净化效果，可以忽略基质效应的影响。
实施例5、莱克多巴胺含量的检测方法
1、免疫磁珠富集分离样品中的RAC
准确称取2.0g(±0.02g)搅碎的样品于10mL离心管中，加入5mL5％氨化甲醇，于匀质仪中20000rpm混合10s，旋涡振荡器中震荡5min，4℃、4000rpm离心10min，收集上清液，向沉淀中再加入3mL 5％氨化甲醇，旋涡振荡器中震荡5min，4℃、4000rpm离心10min，合并两步上清液于40℃下氮气吹干，用10mLPBS复溶，加入10mL正己烷除脂10min，除去正己烷层，收集下层提取液，用5mLPBS稀释获得稀释后的下层提取液。
吸取500μL稀释后的下层提取液与0.4mg实施例3制备的免疫磁珠加入1.5mL离心管中，涡旋混匀，37℃摇床上120rpm反应15min，磁分离，用500μLPBS洗涤3次，磁分离并弃除上清，接下来进行洗脱。向上述离心管中加入100μL纯甲醇，重悬磁珠，涡旋混匀，37℃摇床上反应10min洗脱抗原，磁性分离并取液相，即为提取液，将提取液在60℃水浴中蒸干，用100uLpH7.4、0.01M的PBS缓冲液溶解得到的干物质，得到icELISA待检样品。
2、间接竞争ELISA检测磁珠富集的样品中RAC
(1)用CB液将RAC-OVA包被原稀释3000倍，每孔100μL，37℃避光孵育2h；然后弃上清，用PBST溶液洗涤一遍，拍干。
(2)加入封闭液(含0.25％酪蛋白、5％小牛血清的PBS缓冲液)，200μL/孔，37℃孵育1h，弃上清，拍干。
(3)每孔加入50μL步骤1得到的icELISA待检样品和50μL单链抗体稀释液(采用pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液将实施例1得到的纯化后蛋白稀释至1000倍体积，稀释后单链抗体RAC-ScFv浓度为1.05mg/L)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。
(4)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(5000倍稀释)，37℃恒温孵育30min，用PBST溶液洗板三次，用吸水纸拍干。
(5)每孔加入100μLTMB显色液，37℃恒温显色10min，然后每孔加入50μL终止液，放入酶标仪读数。
(6)据实施例4制备的肝脏基质加标标准曲线和上述获得的酶标仪读数获得样品中RAC含量。
3、方法准确度和精密度测定
将RAC标准品添加至空白猪肝脏混匀作为样品，添加浓度分别为10、20、30μg/kg。按照上述步骤1和2获得样品中RAC的实测浓度。按下式计算回收率和变异系数：回收率(100％)＝实测浓度/添加浓度×100％；变异系数＝回收率标准差/平均值。检测结果表明添加回收率大于72.65％，变异系数RSD小于15％。
利用上述建立的方法对猪肝脏样品进行检测，取20份空白猪肝脏样品，取OD450的平均值减3倍标准偏差，对应肝脏基质加标标准曲线上的浓度即为检测限(LOD)。结果表明检测限LOD为4.57μg/kg。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莱克多巴胺的方法及其单链抗体
<130> GNCYZ212200
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgttctga tgacccaaac cccgctgagc ctgccggtta gcctgggcga ccaagcgagc 60
attagctgca agagcagcca aagcattatt tacagcgacg gtaacaccta cctggagtgg 120
tatctgcagc gtccgggcca aagcccgaag ctgctgatct ataaagtgag caaccgtttc 180
agcggtgttc cggaccgttt tagcggcagc ggtagcggca ccgatttcac cctgaagatt 240
agccgtgtgg aggcggaaga tctgggtatc tactattgct ttcagggcag ccacgcgccg 300
ttcacctttg gtagcggcac caagctggag attaaaggtg gcggtggcag cggtggcggt 360
ggcagcggtg gcggtggcag cgaggtggaa ctggttgaaa gcggtggcgg tctggttcgt 420
ccgccgggta gcctgaagct gagctgcgcg gcgagcggtt tcacctttag cggctacgcg 480
atgagctggg tgcgtcagac cccggagcaa cgtctggaat gggttgcgta cattaccagc 540
ggcggtaaca ccggttatcc ggacagcgtg aaaggccgtt tcaccatcag ccgtgatatt 600
gttcgtaaca tcctgtacct gcaaatgaac agcctgcgta gcgacgatac cgcgatctac 660
tattgcaccc gtggttattt cgtgagcccg agctttgaag tttggggtgc gggcaccacc 720
gtgaccgtga gcagcgcggc ggcggagcag aaactgatta gcgaagaaga cctg 774
<210> 2
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Pro Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Tyr Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Gly Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Val Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg
210 215 220
Gly Tyr Phe Val Ser Pro Ser Phe Glu Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
245 250 255
Asp Leu

Claims (10)

1.莱克多巴胺或莱克多巴胺含量的检测方法，其特征在于：包括
(1)采用权利要求7所述的免疫磁珠处理样品获得icELISA待检样品，实现所述样品中莱克多巴胺富集；
(2)采用莱克多巴胺为包被原，采用权利要求4或5所述的单链抗体或其抗原结合部分为一抗，通过间接酶联免疫反应检测步骤(1)获得的icELISA待检样品，确定所述样品是否含有莱克多巴胺或所述样品中莱克多巴胺含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(1)包括混合样品和5％氨化甲醇，离心后收集上清液，吹干上清液，用PBS复溶，加入正己烷除脂，除去正己烷层，收集下层提取液；混合下层提取液与权利要求7所述的免疫磁珠反应获得富集莱克多巴胺的免疫磁珠；采用纯甲醇洗脱富集莱克多巴胺的免疫磁珠获得提取液，即为icELISA待检样品。
3.莱克多巴胺的单链抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述单链抗体或其抗原结合部分含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2第153-159位所示；
所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2第179-183位所示；
所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2第225-234位所示；
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2第24-39位所示；
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2第55-61位所示；
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2第94-102位所示。
4.根据权利要求3所述的单链抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2第128-245位所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.2第1-112位所示。
5.与权利要求3或4所述的单链抗体或其抗原结合部分相关的生物材料，所述生物材料为如下任一种：
B1)编码权利要求3或4所述的单链抗体或其抗原结合部分的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
6.免疫磁珠，其特征在于：所述免疫磁珠的磁珠表面偶联有权利要求3或4所述的单链抗体或其抗原结合部分。
7.用于富集莱克多巴胺的产品，其特征在于：包括权利要求6所述的免疫磁珠。
8.用于检测或辅助检测莱克多巴胺或莱克多巴胺含量的产品，其特征在于：包括权利要求4或5所述的单链抗体或其抗原结合部分。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：还包括权利要求6所述的免疫磁珠。
10.权利要求3或4所述的单链抗体或其抗原结合部分、权利要求5所述的生物材料、权利要求6所述的免疫磁珠或权利要求7-9任一所述的产品在如下任一中的应用：
(1)制备检测莱克多巴胺的产品；
(2)检测莱克多巴胺；
(3)制备检测莱克多巴胺含量的产品；
(4)检测莱克多巴胺含量；
(5)制备富集莱克多巴胺的产品；
(6)富集莱克多巴胺。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101915845A (zh) * 2010-08-03 2010-12-15 中国农业大学 一种检测莱克多巴胺的方法及其专用化学发光免疫试剂盒
CN104031886A (zh) * 2014-03-19 2014-09-10 中国农业大学 一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体
CN105440137A (zh) * 2015-01-29 2016-03-30 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗莱克多巴胺的抗体及其应用
CN111024952A (zh) * 2020-01-13 2020-04-17 沭阳康源泰博生物科技有限公司 一种莱克多巴胺、沙丁胺醇的复合免疫磁珠净化试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101915845A (zh) * 2010-08-03 2010-12-15 中国农业大学 一种检测莱克多巴胺的方法及其专用化学发光免疫试剂盒
CN104031886A (zh) * 2014-03-19 2014-09-10 中国农业大学 一种免疫磁珠净化-酶联免疫试验检测莫能菌素的方法及其专用单克隆抗体
CN105440137A (zh) * 2015-01-29 2016-03-30 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗莱克多巴胺的抗体及其应用
CN111024952A (zh) * 2020-01-13 2020-04-17 沭阳康源泰博生物科技有限公司 一种莱克多巴胺、沙丁胺醇的复合免疫磁珠净化试剂盒

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