JP2009525725A - 血小板抗原特異抗体の結合を中和するペプチドアプタマー並びにそれを含む診断及び治療への応用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、血小板GPIIb/llla分子に存在するヒト血小板抗原HPA−Iaのエピトープを特に模倣し、且つHPA−Ia特異抗体(抗HPA−1a)の結合を中和可能なペプチドアプタマーに関する。このペプチドアプタマーは、ヒト血清中のHPA−Ia特異抗体を検出及び同定する方法、抗体のスクリーニング及び同定のための診断キット、イムノアッセイ及び薬学的組成物に有利に使用される。
【選択図】なし

Description

本発明は、血小板GPIIb/IIIa分子に存在するヒト血小板抗原HPA−1aエピトープを特に模倣し、且つHPA−1a特異抗体(抗HPA−1a)の結合を中和可能なペプチドアプタマーに関する。このペプチドアプタマーは、ヒト血清中のHPA−1a特異抗体を検出及び同定する方法、抗体のスクリーニング及び同定のための診断キット、イムノアッセイ及び薬学的組成物に有利に使用される。
血小板はヒト血液の主成分の1つであり、血液凝固系の細胞成分である。血液は基本的に、血漿、赤血球(red blood cell/erythrocyte)、白血球(white blood cell/leukocyte)、及び血小板(platelet/thrombocyte)から構成されている。血小板は骨髄において巨核球により産生される。血小板は実際は真の細胞ではなく、顆粒を含む膜及び細胞質の断片であることが一般に認識されている。より詳細には、血小板は巨核球由来の外膜及び細胞質から成り、これらは顆粒、濃密体、暗調小管系、及びミトコンドリアを含む。
血小板糖タンパク質GPIIb/IIIa、GPIa/IX、GPIa/IIa又はGPIVの他に、血小板はグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーにより連結される少なくとも5つの糖タンパク質を含む。これらの一つに、CD109に分類される170kDaの糖タンパク質がある。CD109は中でも、Gov同種抗原を保有することを特徴とする。
免疫性血小板減少症は、血小板が抗体により破壊される臨床状態である。特発性血小板減少性紫斑病(ITP)は、GPIIb/IIIa、GPIa/IX、GPIa/IIa又はGPIV血小板糖タンパク質を標的とする、IgG抗血小板自己抗体により引き起こされる自己免疫性血小板破壊を特徴とする、ありふれた疾患である。新生児/胎児同種免疫性血小板減少症(NAIT)は、胎児血小板を破壊し、重症血小板減少症を誘発する、母系ヒト血小板同種抗原(HPA)同種抗体(抗HPA)により引き起こされる。NAITは妊娠例の1/1000の推定発症率を有し、in uteroで脳出血又は脳室拡大をもたらす。同種抗体のスクリーニング及び同定は、この疾病の予防及び治療に必須の工程である。輸血後紫斑病(PTP)は、抗HPA同種抗体に起因する、血小板の別の免疫介在性破壊である。血小板不応状態は、レシピエントが産生した同種抗体により輸血血小板が破壊される臨床状態である。これらの抗体の特性決定は、効果的な血小板輸血の提供に必要とされる工程である。
イムノブロット法、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板免疫蛍光試験、又はモノクローナル抗体固定化血小板検定(MAIPA)等の血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、又は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)において、これまでの血小板を対象とする自己抗体又は同種抗体の検出方法は全て、新鮮血小板を使用する。これらの測定法は全て、事前にHPA系で分類された血小板の採取を要する。さらに、当該技術分野で既知のこれらの測定法は、上述したように、新鮮血小板を使用する。しかしながら、4℃又は−20℃での保存の間、血小板の糖タンパク質は脱離する過程をたどるため、血小板製剤は幾つかの血小板抗体の検出に不適切となる。一週間を超えるような長い期間にわたって正常なレベルの血小板糖タンパク質発現を保つ試みは全て成功(succesful)しなかった。これらの要因のために、毎週新たなバッチの血小板をドナーから採取する必要がある。したがって、血小板免疫学の分野において、正常なレベルの血小板糖タンパク質発現を、(例えば一ヶ月を超えるような)長期間保つ方法が常に必要とされている。
したがって、本発明の根底にある技術上の問題は、ヒト血清中のヒト血小板抗原特異抗体の検出及び/又は同定を可能にする新規のシステムを提供することにある。本発明は特に、(i)血小板糖タンパク質に存在する血小板同種抗原のエピトープ発現、すなわち正常なレベル、また好ましくは正常なパターンでの発現を、保存下で安定に維持するアプタマー、(ii)かかる安定なアプタマーを産生するプロセス、及び(iii)かかる安定なアプタマーの分析的な、殊に免疫学的な用途を提供するであろう。
上記の技術上の問題に対する解決策は、特許請求の範囲に特徴付けられる実施形態を提供することにより達成される。
特に、(A)N末端からC末端の方向に、
(i)バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及びグリシンから成る群から選択される4つの脂肪族アミノ酸、
(ii)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
(iii)1つのプロリン、
(iv)アルギニン、リシン及びヒスチジンから成る群から選択される1つの塩基性アミノ酸、
(v)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
(vi)トレオニン及びセリンから成る群から選択される1つのアルコールアミノ酸、及び、
(vii)トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから成る群から選択される1つの芳香族アミノ酸、
の配列を有する、少なくとも1つのドデカペプチド、
(B)少なくとも1つのポリペプチド、及び必要に応じて、
(C)1つ又は複数の検出可能なマーカー、
を含む、ペプチドアプタマーが提供される。
「ペプチドアプタマー」という用語は本明細書中で用いられる場合、ドデカペプチドがハプテンとして機能する、上記の任意の化合物も包含する。さらに、本発明によるペプチドアプタマーは、血小板糖タンパク質GPIIb/IIIaに存在するHPA−1aエピトープを模倣することができる。
本発明によると、「ドデカペプチド」という用語は、上記の又は図1a及び図1bに記載のアミノ酸配列を有する任意のドデカペプチドを包含する。特に、ドデカペプチドは任意の結合様式、例えば共有結合、水素架橋、ファンデルワールス結合又は静電結合を介して、1つ又は複数のポリペプチドに結合し得る。本発明の好適な実施形態では、ドデカペプチドはポリペプチドに共有結合する。
本発明の一実施形態では、上記のペプチドアプタマーはVVAGDDPREDTW(配列番号1)の配列を有するドデカペプチドを含む。
さらに、本明細書中で、「ポリペプチド」という用語は配列の長さ又は種類に関して限定されず、骨格タンパク質又は融合タンパク質の配列等の、任意の適切なアミノ酸配列を含む。本発明によると、当該ポリペプチド(複数可)は、本発明においてそれらの断片の形でも使用され得るし、検出に又は任意の精製工程で使用される標識等の、それらの調製に由来する任意の残基を含有し得る。本発明によるポリペプチド(複数可)は、グリコシル化(glycolysation)、核酸の付着又は任意の他の化学修飾等の、生物環境に接触することに由来する変化を有するポリペプチド(複数可)も包含する。
本発明の別の実施形態では、上記のペプチドアプタマーはチオレドキシン(Trx)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、コイルドコイルポリペプチド及びジスルフィド架橋を形成可能なシステイン含有ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドを含む。
本発明によるポリペプチド(複数可)は、不活性担体、ドデカペプチドによる抗体への提示に有用な骨格タンパク質、ペプチドアプタマーの精製に有用な精製助剤又はペプチドアプタマーの検出において有用な検出手段として機能し得る。
本発明によると、上記のドデカペプチド(複数可)は、ポリペプチド(複数可)の任意の位置に結合し得る。例えば、ドデカペプチド(複数可)はポリペプチド(複数可)のN末端又はC末端に結合し得、又はポリペプチド内に組み込まれて、当該ドデカペプチドのN末端及びC末端に隣接する2つの断片を生じ得る。本発明によるペプチドアプタマーが2つ以上のドデカペプチドを含有することがさらに考えられるが、これらは当該ポリペプチド(複数可)の同じ位置若しくは異なる位置又はその断片に結合し得る。本発明のさらなる実施形態では、ペプチドアプタマーは、直接又はペプチドスペーサーを介して互いに結合する、2つ以上のドデカペプチドを含有する。
「検出可能なマーカー」という用語は、本明細書で用いられる場合、生化学的検出マーカー等の特別な種類の検出マーカーに限られず、検出に好適な当該技術分野で既知の任意の残基を包含する。
本発明の一実施形態では、上記のペプチドアプタマーは、蛍光マーカー、放射性マーカー、Hisタグ、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)、Flagタグ、ビオチン、Haタグ、Mycタグ及びXPressタグから成る群から選択される検出可能なマーカーを含む。
本明細書で用いられる場合、「チオレドキシン−ヒト−血小板−抗原1a」(Trx−HPA−1a)は、本発明の好適な実施形態に関し、ここで上記のペプチドアプタマーは、検出マーカーとしてHisタグを有するポリペプチドチオレドキシン(Trx)の活性部位中に融合する、配列番号1に記載のドデカペプチドを含む(図3a及び図3b)。当該Trx−HPA−1aは、配列番号2に記載のタンパク質配列を有し(図3b)、配列番号3の核酸配列によりコードされる(図3a)。
本発明のペプチドアプタマーは、組み換えDNA技術のような当該技術分野で既知の任意の方法により調製できる。
本発明のさらなる実施形態は、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法であって、
(i)ヒト血小板抗原特異抗体の検査を受けるヒト血清を準備する工程、
(ii)ヒト血清を上記のペプチドアプタマーと接触させる工程、及び、
(iii)ペプチドアプタマーのヒト血小板抗原特異抗体との直接又は間接相互作用を検出する工程、
を含む、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法に関する。
本明細書中で、「ヒト血小板抗原」という用語は、血小板GPIIb/IIIa糖タンパク質に存在するHPA−1aエピトープだけでなく、血清又は任意の体液中で可溶型のGPIIb/IIIaに存在する可溶性HPA−1aエピトープも包含する。
本明細書中で、「ヒト血小板抗原特異抗体」という用語は、任意のHPA−1a特異抗体(抗HPA−1a)を包含し、他のタンパク質又は糖タンパク質と交差反応性のある抗体も包含する。
本明細書中で用いられる場合、「ヒト血清」という用語は、直接患者から又は保存血液から採取した任意のヒト血液の血清、血漿又は羊水を包含する。
本発明によると、「直接又は間接相互作用」という表現は、ペプチドアプタマーとヒト血小板抗原特異抗体との間の任意の相互作用を包含し、他の分子が関与する任意の相互作用をさらに包含する。このような他の分子は、例えばタンパク質、タンパク質複合体、核酸、糖及び/又は脂質であり得る。
上記の方法の検出する工程(iii)はイムノブロット、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、フローサイトメトリー、プロテインアレイ技術、分光法、質量分析、クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、蛍光消光及び/又は蛍光エネルギー移動から成る群から選択される1つ又は複数の検出方法を含む。
本発明の好適な実施形態では、上記の方法で検出又は同定される抗体は、抗HPA−1aである。
本発明の別の実施形態では、免疫性血小板減少症を患う患者の血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出及び/又は同定するために、上記の方法は用いられ得る。
本発明の好適な実施形態では、上記の方法は患者の血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出及び/又は同定するために使用され、ここで患者は、特発性(ideopathic)血小板減少性紫斑病(ITP)、新生児/胎児同種免疫性血小板減少症(NAIT)、輸血後紫斑病(PTP)又は血小板不応状態から成る群から選択される免疫性血小板減少症を患っている。
本発明のさらなる実施形態は、本発明によるペプチドアプタマーを含む、ヒト血小板抗原特異抗体のスクリーニング及び同定のための診断キットに関する。この診断キットは、スクリーニング又は同定手順を実施するために当該技術分野で既知の任意のさらなる成分/化合物を含み得る。
本発明の別の実施形態は、本発明によるペプチドアプタマーを含む、ヒト血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出するイムノアッセイに関する。このようなイムノアッセイの例としては、イムノブロット法、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)及び/又は放射免疫測定法が挙げられる。さらなるアッセイは、表面プラズモン共鳴、蛍光消光(fluorescence evanescence)及びフローサイトメトリーに関する。
本発明によるさらなる実施形態は、治療に有効な量の本発明によるペプチドアプタマー及び必要に応じて、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、補助剤、希釈剤及び溶剤、又はそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される1つ又は複数の追加成分を含む、薬学的組成物に関する。
さらに、薬学的組成物は、それを必要とする患者に対して5〜50mgの適切な用量で、非経口的、経口的、皮膚に若しくは舌下にといった任意の適切な手段を介して投与するか、又はリンパ器官に注射することができる。
本発明の薬学的組成物は、特発性(ideopathic)血小板減少性紫斑病(ITP)、新生児/胎児同種免疫性血小板減少症(NAIT)、輸血後紫斑病(PTP)又は血小板不応状態等の免疫性血小板減少症疾患の治療及び/又は予防に使用することができる。このアプタマーを、母体の血漿中の抗HPA−1a抗体を中和するために用いること、胎児又は羊水中に注射することが可能である。さらに、アフェレーシス手順(選択的血漿吸着法)において、血漿をインキュベートした場合に抗体を除去するためのビーズ又はポリマーのような支持体に、このアプタマーをグラフトすることが可能である。
実施例1
FliTrx(商標)ペプチドライブラリ及びモノクローナル抗体
Lu et al.(Lu Z, Murray KS, Van Cleave V, LaVallie ER, Stahl ML, McCoy JM.「フラジェリンとの機能融合としての大腸菌細胞表面上のチオレドキシンランダムペプチドライブラリの発現:タンパク質−タンパク質相互作用の探査のために設計されたシステム(Expression of thioredoxin random peptide libraries on the Escherichia coli cell surface as functional fusions to flagellin: a system designed for exploring protein-protein interactions)」Biotechnology (N Y). 1995 Apr; 13(4): 366-72)により記載されたシステムに基づく、FliTrx(商標)ランダムペプチドライブラリは、Invitrogen(San Diego, CA)より入手した。表現型HPA−1aに特異的なGPIIb/IIIaタンパク質に対するmAb Camtranは、Cambridge(Griffin H. M., Ouwehand W. H.,「V遺伝子ファージディスプレイライブラリ由来の血小板糖タンパク質IIIaのロイシン33に特異的なヒトモノクローナル抗体(HPA−1a)(A human monoclonal antibody specific for the Leucine 33 (HPA-1a) form of platelet glycoprotein IIIa from V gene phage display library)」Blood 1995, 86, 12: 4430-4436)より入手した。
増殖及びペプチドライブラリの誘導
細胞培養及び一般的なパンニング法を製造業者のプロトコルに記載の通り実施する。発現を駆動するPLバクテリオファージプロモータを含有するpFliTrx(商標)を、clリプレッサの発現がtrpプロモータの支配下にある大腸菌(GI826)中で伝播する。プラスミドを含む大腸菌細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含有するIMC培地(1×M9塩(40mM NaHPO、20mM KHPO、8.5mM NaCl、20mM NHCl)、0.2%カザミノ酸、0.5%グルコース、1mM MgCl)中で25℃で一晩、飽和状態になるまで増殖する。100μg/mlのトリプトファンにより、ペプチド挿入を含むチオレドキシン−フラジェリン融合タンパク質の発現を25℃で6時間誘導する。次に、10mlの誘導大腸菌培養物に0.1gの脱脂粉乳、300μlの5M NaCl及び500μlの20%α−メチルマンノシドの混合物を添加する。得られた溶液は、以下のスクリーニングのためのペプチドライブラリとして使用される。
ランダムペプチドディスプレイライブラリのパンニング
60mm組織培養プレート(Nunc)をペプチドライブラリスクリーニングに使用する。1mlの滅菌水で希釈した抗体20μgを用いて、20〜25℃で1時間、プレートをプレコートする。液体を除去した後、10mlの滅菌水でプレートを洗浄し、次に10mlのブロッキング溶液(IMC培地中、1%脱脂粉乳、150mM NaCl、1%α−メチルマンノシド及び100μg/mlのアンピシリン)を補充し、1時間穏やかに攪拌する。6時間のペプチドライブラリ誘導の終了の直前に、ブロッキング溶液をデカントし、得られた溶液の10mlアリコートをプレートに添加する。プレートを水平振盪機で75rpmで1分間穏やかに攪拌し、20〜25℃で1時間インキュベートする。細菌培養物をデカントし、100μg/mlのアンピシリン及び1%α−メチルマンノシドを含有するIMC培地10mlで、5分間穏やかに攪拌することでプレートを洗浄する。さらに4回洗浄した後、1mlのIMCで30秒間ボルテックスすることで、結合細菌を分離する。残存する分離細菌をプレートから回収し、次回のバイオパンニングのために増殖する。続く4回のバイオパンニングで同様の手順を実施する。5回のバイオパンニング後、細菌のコロニーをRMG(1×M9塩、2%カザミノ酸、0.5%グルコース、1mM MgCl、100μg/mlのアンピシリン及び1.5%アガー)プレートから無作為に取り出し、30℃で一晩増殖する。
ウエスタンブロット
基本的には製造業者のプロトコルに従って、ウエスタンブロットにより陽性クローンの同定を行う。簡潔に述べると、RMGプレートの40のクローンを2mlのRM培地(1×M9塩、2%カザミノ酸、1%グリセロール、1mM MgCl)100μg/mlのアンピシリンを含む)に移し、30℃で飽和状態になるまで振盪しながら増殖する。一晩培養物からの40μlの試料を、細胞密度がOD600、0.75になるまで、100μg/mlのアンピシリン及び100μg/mlのトリプトファンを含有するIMC2ml中に37℃で接種した。誘導細胞培養物の1.5mlアリコートを採取し、10000gで1分間遠心分離した。ペレットをSDSポリアクリルアミドゲルローディングバッファーに再懸濁し、5分間煮沸し、8%SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。分離したタンパク質を、液体電気泳動転写セル(Bio-Rad)のニトロセルロースメンブレン(PROTRAN(登録商標)BA79、Schleicher & Schuell)にブロットする。次にメンブレンをTBS(10mM Tris(pH7.2)及び0.15M NaCl)5%粉乳を用いて、4℃で一晩ブロッキングした後、TBS1%粉乳、0.05%Tween20で1:100に希釈したcamtran抗体を用いて、20〜25℃で2時間インキュベートする。TBS0.05%Tween20で3回洗浄した後、1:92000に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)(Sigma、A0170)を用いて、20〜25℃で40分間、メンブレンをインキュベートする。TBS0.05%Tween20でさらに3回洗浄した後、Lumi−LightPLUSウエスタンブロット基質(Roche)により結合複合体を検出する。次に、HPA−1b表現型に特異的なGPIIb/IIIaタンパク質に反応するヒト血清を用いて、ウエスタンブロットを行うことにより陽性クローンを再分析する。
DNAシークエンシング
同定したクローンのプラスミドDNAを、Wizard(登録商標)Plus SVミニプレップDNA精製システム(Promega)を使用して単離する。FliTrx(商標)フォワードシークエンシングプライマー(5’−ATTCACCTGACTGACGAC−3’)を使用して、ヌクレオチド配列をMWGにより決定する。
タンパク質Trx−HPA−1aのクローニング、発現及び精製
発現プラスミドのクローニング及び生成
事前に選択したpFlitrxプラスミドを用いて、チオレドキシンペプチドをコードするcDNAをPCR反応により増幅する。PCR条件は次の通りである:95℃で1分、続いて95℃で45秒、36℃で30秒、72℃で45秒の12サイクル、次に95℃で45秒、45℃で30秒、72℃で45秒の20サイクル、そして反応を完全にするために72℃で3分間。3’末端に、プライマー配列5’−TGTCGACCAGGTTAGCGTC−3’はSalI部位を誘導し、5’末端に、プライマー配列5’−TCATATGATGAGCGATAAAATTA−3’はNdeI部位を誘導する。PCRで生成したDNA断片をpGEM(登録商標)−TイージーベクターシステムI(Promega)にサブクローニングする。次に、プラスミド構築物を、制限酵素NdeI及びSalIにより増幅及び消化する。消化されたDNA断片を、SaltI部位の下流の停止コドンの前の6つのHisコドンをコードする、アンピシリン耐性ベクターpT7−7(T7ポリメラーゼ発現系に基づくベクター)のNdeI部位及びSalI部位にクローニングする。プラスミドを大腸菌株DH5αに形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを単離する。耐性コロニーを増殖することでプラスミドの大規模な産生と精製が可能になる。プラスミドの適切な構築をDNAシークエンシングにより確認する。
Trx−HPA−1a(JT−PLP01)の過剰発現及び精製
プラスミドを大腸菌株C41(DE3)に形質転換する(Miroux B, Walker JE.「大腸菌におけるタンパク質の過剰産生:幾つかの膜タンパク質及び球状タンパク質の高レベルの合成を可能にする突然変異宿主(Overproduction of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels)」J Mol Biol. 1996 Jul 19; 260(3): 289-98)。新たに形質転換したコロニーを20μg/mlのアンピシリンを含有する400mlの2YT培地(16%バクトトリプトン、10%バクト酵母抽出物、85.5mM NaCl)に接種し、0.7mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシドでの誘導前に、OD600が0.6〜0.8になるまで37℃で増殖する。37℃での一晩培養後、細胞を遠心分離により採取する。ペレットを再懸濁し、10mLの溶菌バッファー(20mM Tris−HCl(pH8.0)、20%グリセロール、500mM NaCl、0.1%Triton X−100、1mM PMSF、1mg/mLのリゾチーム、1/2錠のComplete Mini EDTA−free(Roche)及び250単位/mLのBenzonase(Merck))中で、4℃で30分間インキュベートする。画分(5ml)を30秒間の超音波処理により破砕する。上清の4回の遠心分離(9000gで30分間)後、リゾチーム及びBenzonaseを含まない溶菌バッファー中で予め平衡化した7ml Ni−NTAアガロースカラム(Qiagen)にその可溶性画分をアプライする。混合物を4℃で1時間、浴中でインキュベートする。リゾチーム及びBenzonaseを含まない溶菌バッファー、次いで20mM Tris−HCl(pH8.0)、20%グリセロール、100mM KCl、0.5mM PMSF、及び20mMイミダゾールを含む溶菌バッファーでカラムを洗浄し、100mMイミダゾールを含有する同じバッファーでTrx−HPA−1aを溶出する。SDS−PAGEによりTrx−HPA−1aを含有すると判断された画分をプールする。試料のバッファーを交換し、5kDaカットオフのVivaspin Concentratorメンブレン(Vivascience)及び20mM Tris(pH8.0)、10mM NaClを用いて、遠心分離により試料を濃縮する。1mL Q−セファロースカラム(Mono Q HR 5/5、Amersham Pharmacia Biotech)に試料をアプライする。20mM Tris(pH8.0)、10mM NaClでカラムを洗浄し、10mM〜1M NaClの直線勾配でTrx−HPA−1aを溶出する。Trx−HPA−1aに富む画分をプールし、1〜15mg/mlに濃縮し、PBS又は滅菌水中、Vivaspin Concentratorで平衡化し、使用するまで−20℃で保管する。タンパク質濃度をブラッドフォード法(Kruger NJ.「タンパク質定量化のためのブラッドフォード法(The Bradford method for protein quantitation)」Methods Mol. Biol. 1994; 32: 9-15)により求める。
精製Trx−HPA−1aの分析
エレクトロスプレー装置API 165(Applied Biosystems)を使用して質量スペクトルを得る。ペプチドマスフィンガープリンティング及びMaldi−Tof分析(voyager−DE TM PRO、Applied Biosystems)により同定する。
ヒト血清からの全IgGの精製
100mM Tris−HCl(pH8)中で予め平衡化した250μlml プロテインAセファロースビーズカラム(P3391、Sigma-Aldrich)に、10%の1M Tris−HCl(pH8)で平衡化したヒト血清をアプライする。カラムを10容量の100mM Tris−HCl(pH8)及び10容量の10mM Tris−HCl(pH8)で洗浄する。全IgGを100mMグリシン(pH3)で溶出する。溶出画分を10%の1M Tris−HCl(pH8)で中和する。IgGを含有する画分を濃縮し、5kDaカットオフのVivaspin Concentratorメンブレン及びPBSでバッファーを交換する。SDS−PAGEで試料を分析し、IgG濃度をブラッドフォード法(Kruger NJ.「タンパク質定量化のためのブラッドフォード法(The Bradford method for protein quantitation)」Methods Mol. Biol. 1994; 32: 9-15)により求める。
実施例2
免疫共沈降
1μgのTrx−HPA−1aタンパク質を、バッファーA(PBS、0.5Mトレハロース)又は0.01%Tween20、0.1%NP40、若しくは0.05%Tritonを含むバッファーA中、ヒト血清からのIgG抽出物30μgで20〜25℃で2時間インキュベートする。10%の1M Tris−HClを混合物に添加し、100mM Tris−HCl(pH8)で予め平衡化した25μlのプロテインAセファロースビーズを用いて4℃で45分インキュベートする。次に、ビーズを100mM Tris−HCl(pH8)、0.2%Tween20で4℃で10分3回洗浄し、10mM Tris−HCl(pH8)、0.2%Tween20で3回洗浄する。プロテインA−セファロース−IgG−Trx−HPA−1a複合体の沈殿(fall)を作成するために、混合物を10000gで2分間遠心分離する。SDSサンプルバッファー中で煮沸することによりタンパク質を溶出し、溶出物を15%SDSポリアクリルアミドゲル上で溶解し、液体電気泳動転写セルのニトロセルロースメンブレン(PROTRAN(登録商標)BA79、Schleicher & Schuell)上にブロットする。次に、TBS5%粉乳でメンブレンを4℃で一晩ブロッキングした後、TBS1%粉乳、0.05%Tween20で1:200に希釈した抗His抗体(Hisプローブ、Santa Cruz Biotechnology)を用いて、20〜25℃で1時間10分インキュベートする。TBS0.05%Tween20で3回洗浄した後、1:3000に希釈したHRP結合ヤギ抗ウサギIgG(Dakocytomation)を用いて、メンブレンを20〜25℃で50分間インキュベートする。TBS0.05%Tween20でさらに3回洗浄した後、Lumi−LightPLUSウエスタンブロット基質により結合複合体を検出する。
実施例3
イムノキャプチャー
Rachel et al.により発表された技法(Med Lab Sci: 1985, 42; 194-199)によると、イムノキャプチャーは、血小板に対するIgG抗体を検出する古典的な技法である。
本明細書中で、Trx−HPA−1aと血小板HPA−1aに対する抗体を含有するヒト血清との相互作用は、イムノキャプチャーにより試験される。血小板アッセイに対するIgG抗体を検出するための固相システム(Capture P(登録商標)、Immucor)が使用される。血小板のプールをTrx−HPA−1aタンパク質と置き換える。炭酸バッファー(脱イオン水中、15mM NaCO、35mM NaHCO)中、1ウエル当たり50ng又は100ngのTrx−HPA−1aで、円錐形のウエルを有するマイクロタイトレーションプレートを4℃で一晩コートする。PBSで洗浄した後、匿名のドナーの血清50μlをウエルに添加し、37℃で45分間インキュベートする。6回の洗浄後、50μlのCapture−P指示赤血球(抗ヒトIgG抗体を保有する赤血球)。
実施例4
イムノアッセイ
ヒト血清中のHPA−1a特異抗体を、炭酸バッファー中1ウエル当たり100ngのTrx−HPA−1aで、4℃で一晩コートしたマイクロタイトレーションプレート(Nunc)を使用して、ELISA試験により決定する。プレートを250μLのPBSで2回すすぐ。1%ウシ血清アルブミン(BSA)(A7030、Sigma)を含有するPBS250μlを用いて、非特異部位を20〜25℃で1時間30分インキュベートすることによりブロッキングする。プレートを250μLのPBSで1回すすぎ、次に100μlのPBS1%BSAで希釈したヒト血清10μlを用いて、20〜25℃で45分間、振盪培養器でインキュベートする。0.05%Tween20を含有するPBSで3回、及びPBSで1回の洗浄後、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG(Fc断片特異的)(Jackson ImmunoResearch)を用いて、プレートを20〜25℃で40分間、振盪培養器でインキュベートする。PBS0.05%Tween20で3回、及びPBSで2回の洗浄後、製造業者の使用説明書に従って、ペルオキシダーゼ基質OPD(1,2−フェニレンジアミン二塩酸塩)(DakoCytomation)を添加することにより、抗HPA−1a抗体の結合を検出する。25〜30分にわたって、492nmでの吸収をELISAプレートリーダーを使用して測定する。反応を停止するには、0.5M HSO100μlをウエルに添加する。次に、OPDのインキュベート時間に従う、吸光度の進展(evolution)の曲線を分析する。
実施例5
この実験では、Trx−HPA−1aのヒトIgGHPA−1a特異的ポリクローナル同種抗体の結合を中和する能力を、MAIPA技術により判定する。MAIPA技術は、Kiefel et al.(Blood: 1987, 70; 1722-1727)により記載されているように使用される。MAIPA技術は、血小板の同種抗体及び自己抗体を検出及び同定する、より特別な技法である。
特に、ポリクローナル抗HPA−1aを含む若しくは含まないヒト血清50μl、又はポリクローナル抗HPA−1aを含まないヒト血清50μL中の15ngのCamtranを、20μLのPBSで希釈した0、1ng、10ng、100ng又は1000ngのTrx−HPA−1aを用いて、20〜25℃で25分間、振盪培養器でインキュベートする。混合物を3μlのNi−NTAアガーロースビーズで、5分間プレインキュベートし、複合体同種抗体/Trx−HPA−1aを13000rpm、2分間の遠心分離により破壊する。50μlの上清を使用してMAIPAを実施する。次に、従来のようにMAIPA技法を使用して血清の中和を判定する。
30μLのPBSで希釈した、増加する濃度のTrx−HPA−1a(0、1ng、10ng、100ng及び1000ng)を、ポリクローナル抗HPA−1aを含む若しくは含まないヒト血清50μL、又はポリクローナル抗HPA−1aを含まないヒト血清50μLで希釈した15ngのCamtranに添加する。20〜25℃で25分間のインキュベート後、3μlのNi−NTAアガーロースビーズで混合物をプレインキュベートし、複合体同種抗体又はCamtran/Trx−HPA−1aを13000rpm、2分間の遠心分離により破壊する。次に、50μLの上清血清の中和を、従来のようにMAIPA技法を使用して判定する。結果は図8a、図8b及び図8cに示す。
実施例6
MAIPA及びELISAを使用した抗HPA−1a抗体の検出
血液試料(表1、左)は匿名のドナー又はNAIT患者からのものである。粗血清(表1、「MAIPA」)又はプロテインA精製免疫グロブリン(表1、「MAIPA pure」)についてMAIPAを実施する。ドナーの大部分は、MAIPA及びELISAの双方を使用して、陰性であることが判明した。MAIPAが0.1を上回る光学密度(OD>0.1)を示すことで、またELISA(終点測定)により、7つの試料は陰性であることが判明した。しかしながら、全てのドナー試料について、経時的分析は、光学密度は時間と共に直線的に増加し、一次導関数は一定であり(dOD/dt=一定)、二次導関数はゼロに等しい(dOD/dt=0)ことを示す。したがって、ELISAを使用してdOD/dt=0であった場合、所与の試料は陰性であることが割り出される。ELISA経時的分析の結果は、指定の欄に表示される(表1、「曲線」):全てのドナー試料は陰性であると試験される(dOD/dt=0)、一方、NAIT患者(Pan, St Camb, Bru)からの3つの試験された試料は陽性であることが判明する(dOD/dt>0)。その結果、所与の試料は、本明細書中に記載のELISAを用いて、以下の基準の1つを満たす場合、陰性である:0.1を下回る光学密度(終点)又はdOD/dt=0(経時変化)。全ての試料は、終点プロトコルを用いて陰性であると判明したが、経時的プロトコルを用いても同様に陰性であると判明することが指摘されるべきである。また、NAIT患者(Pan、Sch、Ac mB2)からの3つの試料の免疫除去は、精製ペプチドアプタマー(表1、「neutr.」)を用いて首尾よく行われる。HPA遺伝子座のジェノタイピングが示される(表1、「geno.」)。
表1は、MAIPA及びELISAを使用した抗HPA−1a抗体検出実験の結果をまとめたものである。記号は次の通りである:(−)陰性;(+)陽性;(−/+)最初は陰性であったが後に陽性と試験された;(ND)判定せず。
Figure 2009525725
(a)本発明によるペプチドアプタマーに含まれるドデカペプチドのアミノ酸の組み合わせ。全ての配列は順に、4つの脂肪族アミノ酸(V、I、L、A、G)、2つの酸性アミノ酸(D、E)、1つのプロリン、1つの塩基性アミノ酸(R、K、H)、2つの酸性アミノ酸(D、E)、1つのアルコールアミノ酸(T、S)及び1つの芳香族アミノ酸(W、Y、F)を含む。矢印はペプチドのN末端からC末端への方向を指す。(b)本発明によるドデカペプチドの無作為な例。矢印はN末端からC末端への配列の方向を指す。例として得られたドデカペプチドは、Gly−Ile−Val−Val−Glu−Asp−Pro−Lys−Asp−Glu−Thr−Tyrのペプチド配列を有する。 Camtranモノクローナル抗体を使用して試験されたウエスタンブロット。選択された細菌クローンからの全タンパク質抽出物(1〜9)。HPA−1a血小板からの試料は陽性対照として用いられた(左のレーン、「plata」)。陽性クローンは63kDのバンドを特徴とする(レーン2、3、5、8、9)。 (a)Trx−HPA−1aタンパク質をコードする配列。このORFは、pT7−7発現ベクターのNdeI制限部位とSalI制限部位との間にクローニングされる。Trx−HPA−1aタンパク質は、C末端に6−His尾部を持つ。(b)Trx−HPA−1aタンパク質の配列。タンパク質はチオレドキシンの活性部位に12アミノ酸長の配列、C末端にポリヒスチジン尾部を含有する。 (a)SDSPage(クマシーブルー)による組換えタンパク質の検出。陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製したタンパク質20μgを20%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した(レーン1)。分子量マーカーを右に示す。(b)Trx−HPA−1aタンパク質のエレクトロスプレー質量スペクトル。期待した大きさ(14640da)のメジャーピークが検出される。マイナーピーク(D)は、N末端に2つのメチオニン残基を欠くTrx−HPA−1aに対応する。(c)Trx−HPA−1aのトリプシン消化後に得られた生成物のMALDI−TOF質量分析スペクトル。黒い星印(H)は期待した大きさでのピークに対応する。これらのピークでTrx−HPA−1a配列の80%に相当する。 再懸濁し、抗His抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した免疫沈降物を示す。免疫沈降に使用したバッファーは、PBS(レーン1、2、9、10)、PBS−Tween(0.01%)(レーン3、4)、PBS−NP40(0.1%)(レーン5、6)、PBS−Triton(0.5%)(レーン7、8)である。抗HPA−1a抗体を含有する血清試料(1、3、5、7)又は含有しない血清試料(2、4、6、8)を免疫沈降に使用した。Trx−HPA−1aを含まない陰性対照(9)又は免疫グロブリンを含まない陰性対照(10)を示す。 典型的なイムノキャプチャー実験の結果を示す。以下の血清を使用した:抗HPA−1a抗体を含有する2つの試料(1−2)、抗HPA−1b抗体を含有する1つの試料(3)、1つの陰性対照(4)。50ng又は100ngのTrx−HPA−1aタンパク質でウエルをコートした。Trx−HPA−1aとの相互作用は、抗HPA−1a抗体を含有する血清(1、2)でのみ検出された。 ELISA実験を示す。ODが492nmの経時的分析。抗HPA−1a抗体を含有する血清(P+及びSt Camb)又は含有しない血清(429876、383545、489956、361177)を使用した。dOD/dtの値を示す(6c)。dOD/dtの算出により陽性試料と陰性試料を区別できる。dは、炭酸バッファー中1ウエルあたり150ngのTrx−HPA−1aを用いて、4℃で一晩コートしたマイクロタイトレーションプレート(Nunc)を使用するELISAアッセイにより測定した、ヒト血清中のHPA−1a特異抗体の検出を示す。プレートを200μlのPBSで2回すすいだ。1%ウシ血清アルブミン(BSA)(A7030、Sigma)を含有する200μlのPBSを入れ、100分間室温(RT)におくことで非特異的結合をブロッキングした。次に、プレートを200μlのPBSで1回すすぎ、100μlのPBS+1%BSAで(1:100〜4:5に)希釈したヒト血清を用いて、RTで45分間振盪培養器で再度インキュベートした。0.05%Tween20を含有するPBSでの3回の洗浄及びPBSでの1回の洗浄の後、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG(Fc断片特異的)(Jackson ImmunoResearch)を用いて、RTで40分間、プレートを振盪培養器でインキュベートした。PBS+0.05%Tween20での3回の洗浄及びPBSでの2回の洗浄の後、製造業者の使用説明書(DakoCytomation)に従って、ペルオキシダーゼ基質(OPD:1,2−フェニレンジアミン二塩酸塩)を添加することにより、抗HPA−1抗体の結合を検出した。20分後、100μlの0.5M HSOを添加して反応を停止した。ELISAプレートリーダーを用いて492nmで吸収を記録した。492nmでのODの進展は血清中の抗HPA−1aの力価に依存する。この進展は抗体−抗原相互作用に特徴的であり、Trx−HPA−1aアプタマーが抗HPA−1aを含む血清と含まない血清を区別できることを実証する。Sch及びPanという試料は抗HPA−1a抗体を含有し、試料Negは健康なドナーからの陰性対照である。高希釈(1/50)で、NegサンプルのODは<0.05であり、一方、Sch及びPanのODは>0.23である。低希釈(1/2)で状況は同じであり、NegのODは<0.11、Sch及びPanは>0.66であった。 (a)MAIPAアッセイにおける、ヒト血清の同種抗体抗HPA−1aの中和を示す。2つの異なる生成のデータを使用して時間内の安定性を比較した。(b)MAIPAアッセイにおける、Camtran抗体のTrx−HPA−1aでの中和。100ngのTrx−HPA−1aは、MAIPAアッセイにおけるCamtranの阻害に十分であった。(c)特異的HPA−1a抗体(抗HPA−1a)を含有する2種のヒト血清の中和。

Claims (13)

  1. (A)N末端からC末端の方向に、
    (i)バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及びグリシンから成る群から選択される4つの脂肪族アミノ酸、
    (ii)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
    (iii)1つのプロリン、
    (iv)アルギニン、リシン及びヒスチジンから成る群から選択される1つの塩基性アミノ酸、
    (v)アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される2つの酸性アミノ酸、
    (vi)トレオニン及びセリンから成る群から選択される1つのアルコールアミノ酸、及び、
    (vii)トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから成る群から選択される1つの芳香族アミノ酸、
    の配列を有する、少なくとも1つのドデカペプチド、
    (B)少なくとも1つのポリペプチド、及び必要に応じて、
    (C)1つ又は複数の検出可能なマーカー、
    を含む、ペプチドアプタマー。
  2. 前記ドデカペプチドの配列が配列番号1に従う、請求項1に記載のペプチドアプタマー。
  3. 前記ポリペプチドがチオレドキシン(Trx)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、コイルドコイルポリペプチド、ジスルフィド架橋を形成可能なシステイン含有ポリペプチド、又は1つ又は複数のそれらの断片から成る群から選択される、請求項1又は2に記載のペプチドアプタマー。
  4. 前記検出可能なマーカーが蛍光マーカー、放射性マーカー、Hisタグ、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)、Flagタグ、ビオチン、Haタグ、Mycタグ及びXPressタグから成る群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドアプタマー。
  5. 請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  6. ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法であって、
    (i)ヒト血小板抗原特異抗体の検査を受けるヒト血清を準備する工程、
    (ii)前記ヒト血清を請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーと接触させる工程、及び、
    (iii)前記ペプチドアプタマーのヒト血小板抗原特異抗体との直接又は間接相互作用を検出する工程、
    を含む、ヒト血小板抗原特異抗体を検出又は同定する方法。
  7. 前記検出する工程(iii)がイムノブロット、免疫沈降、イムノキャプチャー、血小板抗原のモノクローナル抗体固定化、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、フローサイトメトリー、プロテインアレイ技術、分光法、質量分析、クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴、蛍光消光(fluorescence extinction)及び蛍光エネルギー移動から成る群から選択される1つ又は複数の検出方法を含む、請求項6に記載の方法。
  8. 検出又は同定される前記ヒト血小板抗原特異抗体が抗HPA−1aである、請求項6又は7に記載の方法。
  9. 免疫性血小板減少症の症状を患う患者の血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出及び/又は同定する、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記免疫性血小板減少症が特発性(ideopathic)血小板減少性紫斑病(ITP)、新生児/胎児同種免疫性血小板減少症(NAIT)、輸血後紫斑病(PTP)又は血小板不応状態から成る群から選択される、請求項9に記載の方法。
  11. 請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーを含む、ヒト血小板抗原特異抗体のスクリーニング及び/又は同定のための診断キット。
  12. 請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチドアプタマーを含む、ヒト血清中のヒト血小板抗原特異抗体を検出するイムノアッセイ。
  13. 治療に有効な量の請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチドアプタマー並びに必要に応じて、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、補助剤、希釈剤及び溶剤、又はそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される1つ又は複数の追加成分を含む、薬学的組成物。
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